《cDNA文官库构建》PPT课件.ppt

《《cDNA文官库构建》PPT课件.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《《cDNA文官库构建》PPT课件.ppt（134页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、cDNA文库的构建,现代生物技术讲座,主要内容,基因文库的概念及意义 cDNA基因文库的类型 几种cDNA文库的介绍 SMART技术构建全长cDNA文库,一、基因文库的概念及意义,文库（library）：指一种全体的集合。 基因文库（gene library ）:是某一生物类型全部基因的集合，这些基因以克隆的形式存在（人工构建）。,基因文库与基因库（gene bank） 区别 基因文库与基因克隆,基因库是指某一生物群体中的全部基因。,基因克隆是只包含某些特定基因或DNA片段的克隆。 基因文库中包含着为数众多的克隆，建成后可供随时选取其中任何一个基因克隆之用。,构建基因文库的意义,使生物的遗传信

2、息以稳定的重组体形式贮存起来; 是一种分离克隆目的基因的主要途径； 基因文库也是复杂基因组作图的重要依据。,根据基因类型（重组DNA片段的供体） 基因组文库和cDNA文库 1、基因组文库, 基因组文库(gene library)：用重组DNA技术，将某种生物细胞的总DNA或染色体DNA切割成一定大小的片段，并与合适的载体重组后，然后转移到适当的宿主细胞中，通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），这些存在于所有重组体内的基因组DNA片段的集合，即基因组文库。它包含该生物所有基因。 根据DNA来源可分为核基因组文库、线粒体基因组文库和叶绿体基因文库,构建流程,抽提基因组DNA,鸟枪法制备D

3、NA片段,DNA片段与载体重组,转化宿主菌,筛选目的基因（核酸探针法、免疫结合法）,基因文库,限制性内切酶,克隆、转化、培养、鉴定,基因组DNA,基因文库,基因组DNA文库,限制性内切酶,基因组DNA,基因重组,转化细菌,体外包装,特点及应用： 包含所有遗传信息 构建难度大（单拷贝基因、长片段基因） 筛选难度大 用于研究基因在基因组中的情况,基因组物理图谱的构建 基因组序列分析 基因在染色体上的定位 克隆鉴定基因调控元件 基因组中基因的结构和组织形式分析,基因组DNA文库应用,结构基因,外显子,内含子,转录、加工修饰,mRNA,2、cDNA文库,cDNA 是指以 mRNA 为模板，在反转录酶的

4、作用下形成的互补 DNA( 简称 cDNA) 。,cDNA文库(complementary DNA library)以组织细胞中的mRNA为模板，反转录合成双链cDNA ，各cDNA分子分别插入载体形成重组子，再导入宿主细胞克隆扩增。这些在重组体内的cDNA的集合即cDNA文库。代表特定细胞或组织中mRAN的文库,cDNA文库的构建：,自20世纪70年代中期首例 cDNA 克隆问世以来，构建 cDNA 文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA 便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从 cDNA 文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。通过构建

5、cDNA 表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此，cDNA 在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。,从1976年 HOFSTETTER 成功的构建了第一个 cDNA 文库以来，构建 cDNA 文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期 cDNA 文库，由于当时技术的限制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存

6、等缺点，而 YOUNG 和 DAVIS 重组载体为表达性文库构建和保存提供了质的飞跃。近年来，cDNA 文库构建的新方法层出不穷，但其共同目的是使 cDNA 文库更加迅速、高效满足研究的需要。,cDNA文库优点,(1)使遗传物质为RNA病毒可建立文库； (2)因克隆数比基因组文库少得多，易于筛选； (3)从分化特异的细胞的cDNA文库中可分离到特异表达的基因。 (4)建库时已排除了其它的RNA，使假阳性率减低。 (5) cDNA文库可在细菌中表达，可用多种策略进行筛选。,cDNA 文库便于克隆和大量扩增，可以从 cDNA 文库中筛选到所需目的基因，并用于该目的基因的表达。,一个细胞在任何时间可

7、以产生几千种不同的蛋白质，所有的蛋白质都有相应的mRNA分子。为了鉴别其中任何一个mRNA分子，每一单独mRNA的克隆都得考虑，但是mRNA不能直接用于克隆，因为它很不稳定，因此，可以合成与选定组织中所有mRNA互补的DNA分子（complementary DNA，cDNA）。信息量远小于基因组文库,注意,(1) 细胞中不同mRNA的丰度不同，低丰度的mRNA要求很高的克隆数(要用公式来计算)。 (2)有的基因表达具有严格的时空性，要获得其mRNA并非易事。用不同发育阶段，或不同组织细胞中的mRNA制备的cDNA文库会包含一些共同和特异序列。这可用于分离差异表达的基因。 (3)cDNA文库的D

8、NA无内含子、调节元件和基因间DNA。不能用于基因结构和调节的研究。一个基因经不同的剪接可产生不同的部分重叠的cDNA克隆。,3、 cDNA文库和基因组文库的区别,时效性 cDNA 文库代表某一时期特定细胞或组织中mRAN，是转录水平，仅反映某一时期特定组织表达的功能基因，不是全部基因；而基因组文库包含该生物所有基因， 序列组成不同 cDNA 文库无间隔序列和调控区等非编码区；基因组文库可真实显示基因组的全部结构信息，由于制备DNA片段的切点是随机的，所以每一克隆内所含的DNA片段既可能是一个或几个基因，也可能是一个基因的一部分或除完整基因外还包含着两侧的邻近DNA顺序。,两种文库均有应用，如

9、何选择 根据试验目的，在分离植物RNA、病毒基因、研究植物功能蛋白序列、分离植物特定发育阶段或特特异表达的基因时应用cDNA文库；在研究mRNA不存在的序列及基因组作图时必须构建基因组文库。,亚克隆文库,将人工染色体文库或粘粒文库中克隆的大片段DNA用鸟枪法（shot gun）随机小片段化，然后用这些随机小片段建立的DNA文库,二、 cDNA基因文库的类型,依据起始mRNA是否经过标准化预处理 ：非标准化cDNA文库和标准化cDNA文库 文库功能：克隆文库和表达文库 载体类型：质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体文库 根据文库构建过程中是否对克隆进行过全长选择分为普通cDNA文库和全长cDNA文库

10、依据第一链反转录引物不同分为随机引物cDNA文库和Oligo d (T) cDNA文库,（一）非标准化cDNA文库和标准化cDNA文库,依据起始mRNA是否经过标准化预处理，可将文库分为非标准化cDNA文库( unnormalized cDNA library)和标准化cDNA文库(normalized cDNA library );前者反映了组织中所有基因的表达水平，适于基因表达谱分析，但文库中冗余较高，发现新基因效率低。后者往往经过杂交（均一化）、扣除杂交(subtractive hybridization )、抑制性扣除杂交(suppression subtractive hybridi

11、zation )处理，不能反映建库材料的基因表达情况，不能用于表达谱构建，但是新基因发现效率提高了。 在研究基因功能和表达调控时，建立减法文库是一个很好的策略。它是通过野生行DNA和缺失型DNA，或不同时空、不同环境条件下的两种CDNA样品反复杂交，去处杂交体后，将剩余的DNA或CDNA片段进行克隆而构建的文库。,（二）根据文库的功能分：克隆文库和表达文库,（1）克隆文库 由克隆载体构建，载体具有复制子、多克隆位点及选择标记，可通过细菌培养使克隆片段大量增殖。 克隆基因主要利用核酸探针，可用蛋白质序列或同源序列。,（2）表达文库 由表达载体构建，载体除具有克隆载体的元件外，还具有控制基因表达的

12、序列，如启动子、SD序列、ATG、终止子等，可在宿主细胞内表达出克隆片段的编码序列，它可分为融合蛋白表达载体和天然蛋白表达载体。 分离基因时，由于克隆片段的基因表达产物蛋白质具有抗原性和生物活性，所以除核酸探针外，还可用免疫学探针和生物功能进行筛选。 表达文库适合于那些不知道蛋白质的氨基酸序列、不能用核酸类探针筛选的目的基因分离。,（三）不同载体文库,主要有质粒、噬菌体、粘粒和人工染色体四大类，每类中由有许多不同的载体，不同的载体适于构建不同的基因文库。 质粒文库 噬菌体文库 粘粒文库 人工染色体文库,构建文库的载体,1.噬菌体载体 基础：裸露的噬菌体重组DNA转化宿主细胞或包装后转染宿主细胞

13、。 载体筛选：在细菌菌苔中形成噬菌斑。 重组筛选： 插入载体通过可见标记的插入失活(cI基因的打断阻止溶源性，产生的噬菌体更清澈；现代的载体携带lacZ基因，以兰-白筛选)。,置换载体Spi-表型(对P2感染敏感性消失)是中心“ 填充片段”gam和red基因座丢失引起的。 供体DNA的大小： 插入载体：0-10kbp; 置换载体：9-23kbp。 插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105所限制。 主要应用： 插入载体:cDNA克隆和表达文库;噬菌体展示。 置换载体:基因组DNA克隆。,2. 粘粒(cosmid)载体 基础：包含噬菌体cos位点的质粒； 导入宿主：经体外包装，再转

14、染宿主细胞； 载体筛选：类似于质粒 重组筛选：可见标记插入失活和小片段插入的阳性筛选； 供体DNA大小：30-45kbp。插入大小范围被有效形成噬菌斑的野生型基因组 75-105所限制。 主要应用：基因组文库构建。,3.质粒载体构建cDNA文库,4.大容量克隆载体,(1)细菌人工染色体(bacterial artificial chromosomes, BACs, fosmids) 基础：大肠杆菌F质粒 导入宿主：电转化 载体筛选：显性选择标记重组筛选：插入片段大小供体DNA大小：300kbp主要应用：大基因组分析评论：低频率的重排和嵌合分子。载体在每个细胞中维持一个或两个拷贝，产生少量供体D

15、NA。,(2) P1载体和P1人工染色体(P1 artificial chromosomes, PACs) 基础：噬菌体P1 导入宿主：体外包装和转导 载体筛选：显性选择标记 重组筛选：应用对致死标记的打断进行阳性筛选 供体DNA大小：约100kbp 主要应用：大基因组分析 评论：重排和嵌合分子少。载体维持低拷贝，但可以通过诱导噬菌体P1溶菌循环扩增。,(3)酵母人工染色体(yeast artificial chromsomes, YACs) 基础：酿酒酵母中心粒、端粒和ARS 导入宿主：转化酵母原生质体 载体筛选：显性筛选标记(营养缺陷型的恢复) 重组筛选：插入片段大小 供体DNA大小：20

16、00kbp 主要应用：大基因组分析，YAC转基因小鼠 评论：YAC的缺点是高频率的自发缺失，和克隆的嵌合化。重组载体的大小，需要电泳分析，有时难以区分内源性染色体。YAC维持低拷贝。,随机引物cDNA文库和Oligo d (T) cDNA文库,依据第一链反转录引物不同分为随机引物cDNA文库和Oligo d (T) cDNA文库。目前，随机引物cDNA文库使用较少。Oligo d (T) cDNA文库获得的克隆含有基因的3端非翻译区。因为不含有编码序列，受到的选择压力比较小，多态性程度较高，适用于发现新的多态性STS位点。同时可以减少文库构建过程中基因组DNA和其它种类RNA对文库的污染。但是

17、传统的Oligo d (T) cDNA文库难于获得较长基因的全长cDNA;同时长度不等的polyA尾巴的存在会影响后期3端测序。为此应分别通过全长库构建技术和使用锚定引物Oligo d (T) VN或者兼并的锚定引物Oligo d(T)VN来减少polyA长度。,三、几种cDNA文库的介绍,经典 cDNA 文库 全长cDNA文库 均一化 cDNA 文库 差减 cDNA 文库 (Subtractive cDNA library) 全长差减均一化cDNA文库 固相 cDNA 文库构建,（一）经典 cDNA 文库构建的基本原理,用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDN

18、A 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。 其基本步骤包括： （1）RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。,（2）合成 cDNA 在获得高质量的 mRNA 后，用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌

19、DNA 聚合酶 I，同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应)， （3）合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。 这里强调的是对载体的选择，常规用的是 噬菌体，这是因为 DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNA。,高质量mRNA的制备,反转录生成cDNA,与噬菌粒载体分子相连接,噬菌粒的包装,cDNA噬菌粒文库的主要步骤：,1、高质量mRNA的制备,用试剂盒提取总RNA,加入与生物素相连的寡聚(dT)引物温育,加入

20、与微磁球相连的抗生物素蛋白,用磁场吸附通过寡聚(dT)引物与抗生物素蛋白及强力微磁球相连的mRNA,洗脱得到mRNA,2、反转录生成cDNA,以寡聚dT或随机6核苷酸为引物,反转录酶,cDNA第一链,以cDNA第一链为模板合成cDNA第二链,加接头准备与载体连接,为了得到有方向性的cDNA应该接上不同的接头,加入带有酶切位点的寡聚dT引物,高活性的反转录酶,合成cDNA的第一链,合成cDNA第二链,用RNase H分解RNA链,加Eco RI接头,用Xho I内切酶切割,得到双接头有方向性的cDNA,(5CTCGAG),3、与噬菌体载体分子相连接,带有接头的cDNA,噬菌粒DNA,经内切酶切割

21、,含有cDNA插入片段的重组噬菌粒DNA,4、噬菌粒的包装,含有cDNA插入片段的重组噬菌粒DNA,体外蛋白质外壳的包装反应,有侵染和复制能力的成熟噬菌体,进行基因组学的研究,含有某种组织或器官的噬菌粒文库,经典 cDNA 文库优缺点,经典 cDNA 文库的构建虽然高效、简便，但文库克隆的片段一般较小，单个克隆上的 DNA 片段太短，所能提供的基因信息很少，大多需要几个克隆才能覆盖一个完整的全基因的 cDNA。,（二）全长cDNA 文库构建的原理,为了克隆到真正的 cDNA 全长，建立富含全长的 cDNA 文库具有重要意义。为此，必须克服仅用 mRNA 的 Poly（A） 尾合成以及由普通逆转

22、录酶作用特点所导致的局限性。 全长 cDNA 文库，是指从生物体内一套完整的 mRNA 分子经反转录而得到的 DNA 分子群体，是 mRNA 分子群的一个完整的拷贝。 全长 cDNA 文库不仅能提供完整的 mRNA 信息，而且可以通过基因序列比对得到 mRNA 剪接信息，此外，还可以对蛋白质序列进行预测及进行体外表达和通过反向遗传学研究基因的功能等。,cDNA文库的组建：,反转录引物和反转录酶,为了避免oligo(dT)作为cDNA第一链合成的引物造成的cDNA短截现象，人们对第一链引物末端的两个碱基作了改进(dT) nVN，其中V可以是A, C或G, N则为A. T. C, G中的任意一种碱

23、基，这就避免了由于mRNA内部存在寡聚(T)而造成的cDNA对应于mRNA的3端出现的短截现象。 传统的逆转录酶AMV和MMLV等都不能逆转录出很长的cDNA .Superscript II TM(Gibco BRL)的推出，使逆转录出更长的cDNA成为可能。(Caminci et a1.,2000)研究表明一些糖类如海藻糖能有效提高反转录酶和其它一些酶类的活性，并能提高酶的最适反应温度，从而为打破mRNA的二级结构，提高反转录的效率提供了可能。,5端帽子结构,真核生物的mRNA与原核生物不同，其5端有一个特殊的甲基化帽子结构，5端帽子结构就成为人们构建全长cDNA文库，寻找突破口的主要目标。

24、全长cDNA文库的构建方法都是基于5端帽子结构的特殊性研究出来的。其中代表性的方法有:Oligo-capping(Suzuki et a1.,1997;Marugama et a1.,1994), CAPture法(Edery et a1.,1995),SMARTTM法(Y.Y et a1.,2001),CAP-Trapper法(Carninci et a1.,1996), Capselect(Schmidt et a1.,1999 ),Oligo-capping,此方法又叫做寡聚核糖核酸单链连接法(SSLLM ) ( Single-Strand Linker Ligation Method

25、/ SSLLM ). 1994年，Maruyama等人首先取得了突破。他们利用5帽子的结构特点，用细菌碱性磷酸酶(BAP)去除无5端mG保护的、部分降解的、不完整mRNA末端的游离磷酸基团，再用烟草酸性磷酸酶(TAP)去除5的mG结构仅保留一个5P，合成一段寡核糖核酸，用T4 RNA连接酶连接到经过处理的mRNAS端的5P上，然后利用修饰的oligo(dT)作逆转录，并进行PCR反应，称为oligo capping。,该方法的优点在于为反转录第一链cDNA达到全长设定了标准，从而有利于全长cDNA的富集。理论上由于利用了PCR技术会导致基因的拷贝数得到极大的扩增，从而利用极少量的起始材料就可以

26、建库。该方法存在的不足有以下四点: a.实际操作中，反应的效率比理论上的大大降低，所以需要的起始材料非常大。 b.各种酶对反应模板底物有一定的倾向性，以及PCR反应在模板的量和长度上的选择性，所以会导致在文库中某种类型的克隆的富集，因此，不能真实地反映组织中各种基因的存在情况，同时会在以后的测序反应中产生冗余性。 c.各种酶反应的存在对技术难度的要求比较大，模板长时间的暴露在酶反应中会使降解的风险性加大，不利于得到高质量的库。 d.由于连接时要用到RNA连接酶，一般来讲RNA连接酶没有DNA连接酶的效率高，所以连接效率的高低也会直接影响到文库的质量。,CAPture法,Ederly等(1995

27、)报道了一种称为CAPture的方法，据称能够非常有效地建立全长的。DNA文库。他们利用“帽结合蛋白”专门结合mRNA的帽结构，含有完整帽子结构的mRNA被富集，逆转录后用RNase作用于mRNA/DNA杂合子，未被帽结合蛋白结合的部分降解”的不完整mRNA，有一些虽结合了“帽结合蛋白”但DNA并不完整的mRNA都被降解，仅完整mRNA又有全长cDNA第一链结合保护的那些mRNA被保护，进一步纯化富集后建库，获得的克隆全长比例很高，但每次需极其大量的mRNA(1OOug)，另外，被帽结合蛋白结合的mRNA 5端约10-50bp被丢失。所以严格来讲所谓的全长cDNA文库并不是全长的。,此技术的优

28、点是:特异地对5帽子进行筛选，目的性更强;整个过程对mRNA的酶促反应较少，降低了mRNA被降解的风险，有利于得到全长的。DNA克隆，从而使文库中全长的比例很高;不进行PCR反应，基因的冗余性大大降低。 此技术的缺点是效率和产量很低，需要的起始材料的量非常大，不利于有限材料的建库;模板mRNA 5端的二级结构对帽结合蛋白的有效性有着非常大的影响，从而会导致某一种类型的mRNA的富集，使文库的克隆产生偏向性;被帽结合蛋白结合的mRNA 5末端约10-5Obp的碱基被丢失，不利于分析。,SMART法,SMART法(Switching Mechanism at 5 End of RNA Transc

29、ript SMART ) CLONTECH公司推出的试剂盒Cap Finder(现又命名为SMARTTM）是利用帽子结构特征。SMART法充分利用了反转录酶PowerscriptTM RT末端转移酶活性和限制性内切酶sfi的特性。PowerscriptTMRT是MMLU反转录酶经过点突变而得来的，它丧失了RNaseH活性，但仍然保留着野生型的聚合酶活性，并且具有较好长距离反转录能力，另外它还具有在双链核酸的3端添加oligo(dC)的末端转移酶活性。,实验设计时，在合成第一链cDNA的oligo(dT)引物的5端加上了Sfil (A)的识别位点。当反转录达到mRNA的5端时，借助Powersc

30、riptTM RT的末端转移酶活性，可以在全长的cDNA末端加上几个(dC)，而截短的cDNA，由于反转录延伸没有达到mRNA的5端， PowerscriptTM RT不能以它为底物在截短的cDNA末端加上oligo(dC)，所以在合成第二链时，带有sfi(B)的oligo(dG)引物不能与它结合，不能合成第二链，因此，理论上所得到的dsDNA都是全长cDNA。全长dscDNA在经限制性内切酶Sfil切割，由于两端的粘性末端不同，所以可以实现对目的基因的定向克隆。,该方法的优点在于不存在对mRNA进行处理的酶促反应，不仅操作简单，而且一定程度上提供了全长cDNA合成的可能性。但是，该方法也存在

31、以下不足: a.理论上，只有当反转录第一链cDNA到达模板mRNA的5末端帽子结构时，末端转移酶活性才能发生，但实际上，在反转录并未到达帽子结构就终止的第一链cDNA的末端，反转录酶末端转移酶的活性照样表达，因此，文库中会有一定数量的非全长克隆，不利于以后的分析研究。 b.末端转移酶活性低，加dC量小，从而导致在CapSwitch这一步中，寡核昔酸作为模板的效率不高，导致克隆的丢失。,CAP-Trapper法,CAP-Trapper法 该方法首先由Carninci (1996)等报道。CAP-Trapper法合成全长的原理是:依据mRNA的5端和3端存在的二醇结构来开展工作。首先将二醇结构进行

32、氧化，在进行生物素修饰之后经过沉淀、酒精洗涤、无RNase的灭菌水重新悬浮等筛选步骤，得到生物素化的mRNA经逆转录酶催化进行cDNA第一链的合成，接着进行RNase 1处理，未被cDNA保护的mRNA(包括非全长cDNA与RNA杂交体中暴露的mRNA 5端及所有的未被cDNA保护的mRNA)即被降解。经链青霉素磁珠吸附并使用弱碱降解mRNA，如此得到单链cDNA，在末端转移酶的作用下进行5端Oligod(G)加尾，之后再进行第二链的合成，连接载体即可得到全长cDNA文库。这种方法后来又进行了许多改进。,该方法的优点在于:直接对全长mRNA进行筛选，最后得到的cDNA理论上主要是全长cDNA。

33、该技术的缺点也比较明显: a. NaI04氧化这一步难于控制，技术难度很大，易造成非特异性氧化或氧化不完全，从而降低全长比例或造成某些基因丧失。 b生物素酰肼并不一定特异的作用于帽子结构，它也可以和mRNA内部的C残基发生作用，标记上生物素，从而导致全长比例降低。 c. mRNA/cDNA杂合体双链的末端处于呼吸链状态，RNaseI消化容易造成某些全长克隆的丧失。 d.杂合子末端常处于呼吸链状态，RNaseA消化杂合链比较难以控制，容易产生非特异性切割，从而导致某些碱基的丢失。 e.模板长时间在酶反应体系中，有降解的风险，不利于保护。 f.在去除非全长mRNA/cDNA杂合体的过程中，如mRN

34、A 3端poly(A)被逆转录引物完全配对而保护，其相应的mRNA/cDNA杂合体照样会被链青霉素磁珠吸附而被作为全长cDNA进行处理。,Capselect法,Capselect法 避免了模板转移的要求，开发了SuperscriptII反转录酶在锰离子存在下具有很高的末端转移酶活性，然后利用此活性和rATP将一段controlled核昔酸尾巴连接到第一链cDNA末端，然后通过T4连接酶将adaptor连接上，起始第二链的合成，从而进行以后的步骤进行建库。 优点: a由于开发了末端转移酶的活性，使加dC的数目增加，同时又避免了模板转移的要求，所以效率大大增加。 b.需要的起始材料很少。 c.处理

35、mRNA的过程较少，这在一定程度上减少了mRNA降解的风险。 d.简单，易行。 缺点:无法剔除cDNA混合样中非全长cDNA 。,上述方法虽然都是从mRNA 5帽子入手，但各有侧重，因此，操作过程的繁易、效率的高低及优缺点也各不相同。 生物技术和生物信息学的飞速发展，全长cDNA文库的构建方法也将日新月异，但新技术，新方法总是朝着快速，简便，经济的趋势发展，研究者应当根据自己的实际情况选择适合自己的方法，达到自己的预期目的。,（三）均一化 cDNA 文库,它是指某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中，且在 cDNA 文库中表达基因对应的 cDNA 的拷贝数相等或接近。,优点,均一化 cDN

36、A 文库具有以下4方面的优点：第一，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验成本。第二，增加克隆低丰度 mRNA 的机会，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。第三，与原始丰度的 mRNA 拷贝数相对应的 cDNA 探针与均一化的 cDNA 文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。而以往的文库构建，忽略了 mRNA 丰度的影响。第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序或芯片制作等研究。,（四）差减 cDNA 文库 (Subtractive cDNA library),差减文库也称扣除文库，使用两

37、种遗传背景相同或大致相同但在个别功能或特性上不同的材料(如不同处理细胞系或植物的近等基因系等)提取 mRNA (或反转录后合成 cDNA)，在一定条件下用大大过量不含目的基因的一方作为驱动子( Driver )与含有目的基因的试验方( Tester )进行杂交，选择性的去除两部分共同基因杂交形成的复合物，往往进行多次的杂交去除过程，最后将含有相关目的基因的未杂交部分收集后，并连接到载体形成文库。,消减杂交是构建差减 cDNA 文库的核心，差减文库是否构建成功很大程度上决定于差减杂交的效率。差减杂交的方法主要有(1)羟基磷灰石柱层析法 (HAP)；(2)生物素标记、链亲和蛋白结合排除法；(3)限

38、制性内切酶技术相结合的差减方法；(4)差减抑制杂交法 (SSH)；(5)磁珠介导的差减法 (MAST)，其中 SSH 法最为常用。,抑制性消减杂交技术 (Suppression Subtractive Hybridization，SSH) 是 DIATCHENKO 等人于1996年依据消减杂交和抑制 PCR 发展出来的一种分离差异表达基因的新方法，主要用于分离两种细胞或两种组织的细胞中的差异表达基因。它主要是利用抑制 PCR 对差减杂交后丰度一致的目的材料中两端连有不同接头的差异表达片段进行指数扩增，而两端连接上同一接头的同源双链片段仅呈线形扩增，从而达到富集差异表达基因的目的。因此应用该技术

39、能够对两个有差异表达的材料(细胞或组织)高、中、低丰度目的基因都进行有效、快速、简便克隆。,抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization, SSH) 原理 SSH是差减杂交与PCR结合的简单、快速分离差异基因的方法。其运用杂交动力学原理，即丰度高的单链DNA在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA，从而使不同丰度的单链DNA得到均衡；抑制PCR则利用链内退火优于链间退火的优点，使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引物配对，选择性地抑制了非目的基因片段的扩增，从而使目的基因得到富集、分离,方法 提

40、取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA，经识别4碱基的限制性内切酶切割 实验组cDNA平均分为2份，分别连接2个接头 进行2轮差减杂交和抑制性PCR 获得富集的目的基因,2.抑制性差减杂交(SSH),抑制性差减杂交 (SSH) 流程图,检测组 (Tester) 含目的基因cDNA，加接头 驱逐组 (Driver) 不含目的基因cDNA，不加接头 * 接头含PCR 引物 正向SSH: 易感者(Tester) + 不易感者(Driver) 易感者特异表达或高表达基因 反向SSH: 不易感者(Tester) + 易感者(Driver) 不易感者特异表达或高表达基因,2.抑制性差减杂交(SSH),评

41、价 优点 采用两次差减杂交和两次PCR，保证了高特异性 (假 阳性率可降至6); 在杂交过程中可使不同丰度基因均衡化，从而获得低丰度差异表达基因;操作相对简便，是目前分离新基因的主要方法 缺点 起始材料需要g级量mRNA; SSH差减克隆片段较小，获取cDNA全长序列有一定难度,2.抑制性差减杂交(SSH),SSH应用 HighWire/ Abstract / Title : Suppression Subtractive Hybridization，SSH （截止2004年9月20日） 671 篇 1996.01.0112.31 1 篇 1997.01.0112.31 8 篇 1998.01

42、.0112.31 23 篇 1999.01.0112.31 48 篇 2000.01.0112.31 65 篇 2001.01.0112.31 120 篇 2002.01.0112.31 126 篇 2003.01.0112.31 156 篇 2004.01.0109.20 117 篇 2005 ? 篇 合 计 ? 篇,2.抑制性差减杂交(SSH),（五）全长差减均一化cDNA文库,全长均一化/差减cDNA文库(mRNA nomalization and subtraction of full-length cDNA library)最早由Carninci ( 2000) 等人提出的，整个文库

43、构建过程可分为三个步骤:,第一步，全长cDNA的获得。这一阶段的方法与cap-trapper法相同。 第二步，均一化/差减杂交。用上步得到的全长单链cDNA作为tester与用生物素标记的过量的driver mRNA杂交，用磁珠分离法将高表达的cDNA除去，最终得到稀有表达的单链cDNA (sscDNA )。 第三步，第二链的合成和文库构建(方法同cap-trpper法)。以第一链为模板，合成dscDNA，然后经酶切，连接，包装，转染，得到全长差减的一化处理的cDNA文库。Carninci ( 2000)等用这种方法构建了多个全长cDNA文库，全长基因的比例达到了95%以上。,Carninci

44、 P, Shibata Y, Hayastu N, et al. Normalization and subtraction of cap-trapper-selected cDNAs to prepare full-length cDNA libraries for rapid discovery of new genesJ. Genome Research, 2000，10:1617-1630.,（六）固相 cDNA 文库构建,固相 cDNA 合成法的主要优点是可以简便 cDNA 合成的操作。在进行缓冲液更换时既没有 cDNA 的丢失之忧，也无其它物质污染之忧。另外，用此方法可以得到真实的

45、代表性文库，它包含有短小的 cDNA，这是因为在克隆之前省去了分级分离的步骤。总之，固相法结合了传统的 cDNA 合成的优点并弥补了其不足。这种方法简便易行，可靠低廉，所建文库高质量，因此它可能会替代目前应用的 cDNA 文库操作方法。,四、SMART 技术构建cDNA文库,Switching Mechanism At 5 end of the RNA Transcript 原理：在合成cDNA的反应中事先加入的3末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末

46、端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。由于有5帽子结构的mRNA才能利用这个反应得到能扩增的cDNA，因此扩增得到的cDNA就是全长cDNA。,这个专利的方法是利用逆转录酶内源的末端转移酶活性，利用酶的天然属性，经巧妙设计而成为，研究只要单管，一步即可完成，不需要额外的cDNA抽提纯化或者沉淀

47、，或者额外的酶反应，只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高质量、高产量的cDNA库，更重要的是得到的cDNA能够代表原有样品中的mRNA的丰度，可以应用于直接扩增基因、构建cDNA文库、已知序列钓全长cDNA（RACE），和用于芯片检测的cDNA探针的扩增等。,SMART cDNA Synthesis,SMART Trip1Ex2 Ligation,（一）、 SMART cDNA文库构建一般程序,总RNA的提取 LD-PCR合成cDNA 蛋白酶K酶切 Sfi 1酶切 CHROMA SPIN-400 Columns层析柱分级分离cDNA Sfi 1酶切的cDNA

48、片段与Trip1Ex2载体连接,cDNA文库构建一般程序,包装反应 未扩增文库滴度的鉴定 未扩增文库重组率的测定 cDNA文库的扩增 扩增cDNA文库滴度、库容量及重组率的鉴定 基因文库的保存和利用 cDNA Library Construction Kit,1、总RNA的提取与纯化,1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d,2、cDNA 第一链的合成,取500l 的离心管，依次加入下列反应成分： 总RNA 1.0l SMART IV TM Oligonucleotide 1.0l CSDIII/3PCR Primer 1.0l Deionized H2o (Milli-Q-filtered) 2.0l Total volume 5.0l 混合均匀，轻微低速离心，72 恒温水浴2min ；迅速冰浴2min ；混合均匀，轻微低速离心，依次加入下列反应成分： 5First-Strand Buffer 2.0l DTT