第7章核酸化学.ppt

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1、1,第7章 核酸化学,教学目的: 1. 掌握核酸和核苷酸的基本知识。 2. 熟悉核酸的两性解离性质。 3. 熟悉DNA的变性、复性和分子杂交意义。 4. 了解DNA芯片的概念及应用。 教学重点： 核酸的两性离解及变性、复性与分子杂交。,2,1869年瑞士科学家Miescher从外科绷带上的脓细胞中分离出了称为“核素”的有机物，被证明是脱氧核糖核蛋白。1944年美国科学家Avery在离体条件下完成了肺炎球菌的转化实验，证明DNA是遗传的物质基础。20世纪50年代，前苏联科学家Chargaff发现DNA碱基配对规律：A=T，G=C；A+G=T+C。1953年Watson和Crick提出了DNA的双

2、螺旋结构模型。1960年Crick提出了中心法则。有关核酸研究领域方面，有人30多人次荣获诺贝尔奖。,3,核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。DNA主要集中在细胞核内, 线粒体、叶绿体、质体中也含有 DNA。RNA主要分布在细胞质中，核内含有部分RNA的前体。RNA主要分为: rRNA(80%)，tRNA(15%)，mRNA(5%)。 DNA是主要的遗传物质，在生物体内具有自体和异体催化功能，即自我复制和指导蛋白质的生物合成。,4,一 核酸的结构,两种核酸的基本化学组成,5,6,7,1 核苷酸,8,核苷酸由核苷中的戊糖C5原子或C3原子上的羟基与磷酸连接而成。有核糖核苷酸和脱氧

3、核糖核苷酸两类。,9,2 重要的核苷酸衍生物,ATP 是产能与耗能过程的中间媒介。UTP 参与单糖的相互置换和多糖的合成。CTP参与磷脂合成。GTP参与蛋白质合成。 ATP ADP + 30.5 kJ / mol,ATP,10,cAMP (3, 5-环腺嘌呤核苷一磷酸)和cGMP(3, 5-环鸟嘌呤核苷一磷酸)的主要功能是作为细胞之间 传递信息的信使。,cAMP和cGMP的环状磷酯键是一个高能键。在pH7.4条件下, cAMP 和cGMP的水解能约为43.9kj/mol, 比ATP水解能高得多。,cAMP,11,二 RNA的结构,RNA有三类，各具不同的生物学功能。RNA分子的基本结构是一条线

4、性的多核苷酸链，由四种核糖核苷酸以3, 5-磷酸二酯键连接而成。RNA分子中的核苷酸数目比DNA少得多。 mRNA以DNA为模板转录产生的，本身又是合成蛋白质的模板，将遗传信息从DNA传递给蛋白质。其平均长度为10001500个核苷酸，一级结构包括RNA链上核苷酸顺序及各个功能部位的排列顺序。,1 RNA的一级结构,12,1)原核mRNA的结构,原核mRNA一般为多顺反子，一条mRNA链含有指导合成几种蛋白质分子的信息，能作为翻译出几种蛋白质的模板。在原核mRNA分子的两端均无特殊的结构，在分子内部，一个顺反子的编码区是从起始密码AUG开始，到终止密码UAG为止。各个顺反子的编码区段之间均含有

5、一段非编码区。在每个顺反子编码区AUG前有段多嘌呤区，称为SD序列，在蛋白质合成时与核糖体结合，起到在核糖体上定位的作用。,13,2)真核mRNA的结构,真核mRNA为单顺反子，结构模式为5-帽子-5非编码区-编码区-3非编码区-多聚A(polyA)。帽子的结构简式为m7GpppNmpNmpNp-。在帽子结构中，m7G与mRNA链形成5, 5-磷酸二酯键的反式连接，使mRNA的5末端没有游离的磷酸基, 而只有2-OH和3-OH, 这种RNA的5端能对核酸外切酶的降解表现出抗性。,14,存在于所有的帽子中,存在于帽子1中,存在于帽子2中,15,帽子结构还可能具有协助核糖体与mRNA结合，促使核糖

6、体在起始密码AUG处正确起始翻译的作用。 大多数真核mRNA的3末端具有多聚腺苷酸结构，称PolyA尾。PolyA的长度为20 200个腺苷酸。其作用是延长mRNA的寿命，有助于mRNA穿过核膜，进入细胞质执行其模板功能。,16,2 RNA的二级结构,1)tRNA的二级结构,RNA的二级结构是指RNA分子自身回折，链内的互补碱基配对形成的局部双螺旋区与非配对顺序的突环相间分布的花形结构。每个局部双螺旋区至少有46对碱基才能保持稳定。RNA分子中的双螺旋构象与A型DNA相类似，一般双螺旋区约占分子碱基数量的40%70%。,17,18,tRNA的三叶草结构由以下几部分组成：,反密码环 环上含有三联

7、体反密码子。由79个核苷酸组成，在蛋白质合成时，其反密码子是tRNA识别mRNA上密码子的功能部位。,tRNA一般由7090个核苷酸组成，多种tRNA的一级结构碱基顺序和二级结构被测定。tRNA的二级结构均呈三叶草形，三个双螺旋区成为三叶草的三个叶柄，三个突环形成三个小叶。,19,二氢尿嘧啶环 环上含有稀有碱基二氢尿嘧啶，又称 D 环，由8 12个核苷酸组成。 TyC环 环上含有稀有碱基T和y(假尿嘧啶)，由7个核苷酸组成。 氨基酸臂 由7对碱基组成, 其3末端为CCAOH，为氨基酸结合部位。 额外环 由318个核苷酸组成。不同的tRNA具有不同的碱基数，故又称为额外环。,20,3 RNA的三

8、级结构,RNA的二级花型结构进一步回折扭曲，使分子内部自由能最小。在二级结构中突环上未配对的碱基，由于RNA链的扭曲而与另一环上的碱基形成新的氢键配对关系，形成立体花型结构。tRNA的三级结构为一个倒L型。,L型的一端为3-CCA末端，另一端是反密码环，D环和TyC环会合，构成L形的拐角。,21,三 DNA的结构,核酸的一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序(碱基顺序)，以及核苷酸之间的连接方式。DNA分子的多核苷酸链是以数量不等的四种脱氧核苷酸通过3-5磷酸二酯键连接起来的。DNA主链骨架是磷酸和脱氧核糖相间排列成的长链，碱基挂在戊糖的另一侧。DNA分子有两个游离末端：脱氧核糖5-OH末端(

9、称5-末端)和脱氧核糖3-OH末端(称3-末端)。一级结构的书写方向为5末端3末端。,1 DNA的一级结构,22,不同的DNA分子具有不同的一级结构，即脱氧核苷酸数目不同，四种碱基的比例不同，排列顺序也不同。DNA分子中的核苷酸排列顺序是生物遗传信息的贮藏和表现形式，决定生物遗传性状的多样性和复杂性。,23,2 DNA的二级结构,1953年，Watson和Crick在前人研究工作的基础上，根据DNA结晶的X-衍射图谱和分子模型，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和预测。,1)DNA双螺旋结构的特点：,DNA分子由两条DNA单链组成。 DNA的双螺旋结构是分子

10、中两条DNA单链之间基 团相互识别和作用的结果。 双螺旋结构是DNA二级结构的最基本形式。,24,DNA分子由两条多聚脱氧核糖核苷酸链(简称DNA单链)组成。两条链沿着同一根轴平行盘绕，形成右手双螺旋结构。其中两条链方向相反，即一条链的方向为5-3，而另一条链的方向为3-5。 含氮碱基位于螺旋的内侧，磷酸和脱氧核糖基位于螺旋外侧。碱基环平面与螺旋轴垂直，糖基环平面与碱基环平面成90角。,2)DNA双螺旋结构的要点,25,螺旋横截面的直径约为2 nm，每条链相邻两个碱基平面之间的距离为0.34 nm，每10个核苷酸形成一个螺旋，其螺距高度为3.4 nm。 两条DNA链相互结合以及形成双螺旋的力是

11、链间的碱基对所形成的氢键。碱基的相互结合具有严格的配对规律，即腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)结合，鸟嘌呤(G)与胞嘧啶(C)结合，这种配对关系，称为碱基互补。A和T之间形成两个氢键(A=T)，G与C之间形成三个氢键(CG)。 在DNA分子中，嘌呤碱基的总数与嘧啶碱基的总数相等(A+G=C+T)。,26,27,3 DNA的三级结构,DNA三级结构是双螺旋DNA的扭曲或再螺旋。一个环形双螺旋DNA分子，如果通过细胞内旋转酶的作用，或体外EB染料作用，即可在环形分子的内部引进张力。这种新产生的张力不能释放到分子外部，只能在DNA分子内部促使原子的位置重排，造成双螺旋的再螺旋(称超螺旋)。如引进张力的方

12、向与原先右手螺旋的方向相同，则超螺旋的螺旋方向是左手螺旋，称正超螺旋。如引进张力的方向与原先右手螺旋的方向相反，则超螺旋的螺旋方向是右手螺旋，称负超螺旋。所以，正超螺旋是旋紧双螺旋后形成的，负超螺旋是放松双螺旋后形成的。,28,生物体内天然存在的环形DNA分子，如病毒、细胞器、质粒、细菌染色体等均以负超螺旋形式存在。 正超螺旋只在特殊情况下出现，如DNA复制时，复制叉前进方向的前面部分，由于局部解链引起的右手螺旋方向的张力，造成旋紧螺旋后形成的正超螺旋。,(1)负超螺旋 (2)正超螺旋 两种超螺旋构象示意图,29,4 染色体结构,真核细胞核内的染色体是由DNA和组蛋白结合而成的复合物，一条染色

13、体只含一个DNA分子。染色体DNA必须经过复杂的盘曲折叠才能包装到细胞内。染色体中的蛋白质分为组蛋白和非组蛋白两大类，组蛋白有5种，含有较多的碱性氨基酸，在生理pH条件下带正电荷，与DNA结合紧密。非组蛋白种类很多，多数为酸性蛋白，与DNA结合较松散。组蛋白、非组蛋白、染色体DNA组装成染色体。,30,31,四 核酸的理化性质,DNA相对分子质量很大，一般在106 1012，制品为白色絮状物。RNA相对分子质量较小，一般在110万，制品为白色粉末。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物同，易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达4%。相对分子质量为100万的DNA在水中的溶解度为1%。DNA、RN

14、A和核苷酸均难溶于有机溶剂，所以常用乙醇做沉淀剂，使其从溶液中析出。,1 溶解性,32,2 核酸的两性解离,核酸及核苷酸中碱基上有可解离基团，如胞嘧啶的N3，嘌呤的N1和N7，可接受质子带正电荷。磷酸基团可进行酸性解离带负电荷。核酸和核苷酸为两性化合物，有等电点。尿嘧啶和胸腺嘧啶不能进行碱性解离，其核苷酸不是两性化合物。核酸和核苷酸的两性解离性质和等电点，在分离、纯化、分析和制备过程中有重要应用。,33,3 紫外吸收性质,嘌呤和嘧啶都有共轭结构，即核苷、核苷酸、NDA、RNA都能吸收240290nm的紫外光。DNA和RNA的紫外吸收性质无明显差异，最大吸收峰258nm，最小吸收峰232nm。不

15、同碱基的紫外吸收特性不同。同一种碱基，在不同pH条件、不同波长、吸收值也不同，据此，可对核酸进行定性和定量测定。,34,4 核酸的变性与复性,1)变性 指核酸分子中双螺旋区碱基对间的氢键受某种理化因素作用而破裂，变成单链的过程。核酸变性不涉及共价键的断裂，变性后相对分子质量不变，理化性质发生变化，生物学功能丧失。很多因素能引起核酸变性，如温度升高，介质pH10，变性剂如脲素或甲酰胺的浓度增加等。,35,伴随着核酸的变性其紫外吸收值增加的现象，称为增色效应。天然DNA的紫外吸收A260值，变性后可增加20%30%，天然RNA的A260值，变性后可增加10%左右。变性还可使溶液粘度降低，浮力密度增

16、加。DNA的热变性不是随着温度升高逐渐发生的，而是当温度达到某一个数值时，在一个很窄的温度范围内突然发生并迅速完成的。DNA的变性温度称为DNA的熔点，用Tm表示。,36,DNA的热变性曲线和Tm值,Tm为增色效应达最大值的50%时的温度，即DNA溶液的温度达到Tm时，有一半的双链DNA处于解链状态。DNA的Tm值一般在7085之间，,随分子内G-C对含量，介质中离子强度而有所不同。G-C相对含量越高, Tm值就越大；离子强度越低，Tm值也低。,37,2)复性 变性DNA在适当条件下，分开的两条互补单链恢复碱基配对，重新成为双螺旋，这个过程称为复性。复性后某些理化性质及生物活性也可部分或全部恢

17、复。复性过程中，紫外吸收值降低，这个现象称为减色效应。复性时降温速度必须缓慢，变性DNA从高温缓慢冷却的过程称为退火；热变性DNA从变性高温迅速冷却至低温(4以下)，此过程称为淬火。淬火处理后DNA不能复性。此外，DNA溶液的浓度越大，互补DNA片段碰撞机会越多，容易复性。DNA片段长度越大，DNA内部的顺序越复杂，互补碱基相遇的机会越小，复性越难。,38,3)分子杂交 不同来源的变性DNA，若彼此之间有部分互补的核苷酸顺序，当他们在同一溶液中进行热变性和退火处理时，可以得到分子间部分配对的缔合双链，这个过程叫分子杂交。 分子杂交不仅可以发生在单链的DNA与DNA之间，而且DNA与RNA之间，

18、不同来源的RNA与RNA之间，也可以进行分子杂交。分子杂交技术目前在分子生物学实验和基因工程技术中被广泛使用，可用来检测DNA或RNA上特定基因或特定功能部位的定位和分布。,39,40,五 核酸的分离和纯化,1 核酸分离提取的一般原理和方法,用啤酒厂废弃的啤酒酵母为原料提取RNA，作为生产核苷酸的原料，提取方法有稀碱法和浓盐法两种。稀碱法是用1%的NaOH使酵母细胞壁破裂，核酸从细胞中释放出来，再用HCl中和，离心除去菌体，调pH至等电点，使RNA在等电点时沉淀出来，离心后即可得到粗品。,1)核酸的工业化生产,41,浓盐法是在含10%干酵母的溶液中，加入NaCl使其终浓度达到10%，然后加热到

19、90并抽提34 h，得到RNA提取液。高浓度的NaCl可改变酵母细胞的渗透压，有利于RNA从细胞中释放出来。,2)活性核酸的制备,制备具生物活性的核酸，要注意防止降解和变性失活。在制备过程中要注意低温(04)、不过酸pH4、不过碱pH10、较高的离子强度、温和的操作及必需添加核酸降解酶的抑制剂等。,42,2 核酸的纯化,超离心法 根据不同密度的分子分布在不同密度层的溶液中的原理，建立密度梯度超离心。根据不同相对分子质量的分子在离心时有不同在沉降速度, 建立速度超离心。 凝胶电泳 电泳速度取决于分子量、带电荷数和分子形状。 柱层析 羟基磷灰石(HA)被用作纯化DNA的层析剂。,43,六 DNA芯

20、片,DNA芯片是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量的DNA探针以显微打印的方式有序地固化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析可获得样品的遗传信息。常用计算机硅芯片作为固相支持物，而称为DNA芯片。 基片的材料、微加工技术和检测方法等都能影响芯片的性能，决定芯片类型和用途的是以阵列分布的传感器分子。通过传感器分子与基因组DNA、cDNA和mRNA杂交而得到这些核酸样品的信息。,44,45,基因诊断 DNA芯片可用于大规模筛查由基因突变所引起的疾病。这项技术的高度准确性和高度自动化性对于筛查大量样品具有很大优势。 分析基因组及发现新基因 DNA芯片技术用于基因组研

21、究可将遗传病表型与DNA上特定的基因序列联系起来。 DNA芯片用于基因表达的研究 由于DNA芯片技术可直接测到mRNA的种类及丰度，所以它是研究基因表达的有力工具。 利用DNA芯片技术进行DNA序列分析 利用杂交谱重建靶DNA序列，可测定较长片段的DNA序列。,46,进行后基因组研究 通过基因打靶技术产生突变株，然后用DNA杂交，可鉴定基因的表型。 DNA芯片技术的应用前景是乐观的，但目前在技术上还存在一些问题。如DNA芯片上原位合成探针难免有错误核苷酸掺入及混入杂质，该技术还需要昂贵的设备。这些问题将随着技术进步而逐步解决，DNA芯片一定会象计算机芯片那样不断升级换代，在医药及生物科学领域发

22、挥越来越大的作用。,47,提 要,核酸分为DNA和RNA两类。 核酸是由核苷酸通过3-5磷酸二酯键连接起来的线性大分子。 核苷酸是由核苷和磷酸结合成的，核苷是由核糖与含氮碱基通过型C-N糖苷键连接成的。 核苷酸衍生物主要有ATP、UTP、CTP、GTP、cAMP等。 核酸的一级结构是指核酸分子中核苷酸的排列顺序以及核苷酸之间的连接方式。,48,DNA的二级结构就是DNA的双螺旋结构。 DNA双螺旋的结构特点: 是由两条反向平行的多聚核苷酸链形成的右手双螺旋；磷酸与核糖组成的主链在螺旋外侧，碱基位于内侧；每圈螺旋包含10个碱基对螺距为3.4nm；链间碱基之间以氢键互补配对。 DNA双链碱基配对规

23、律为：A=T, GC。 DNA三级结构是指双螺旋形成超螺旋，超螺旋有正超螺旋和负超螺旋。,49,真核生物mRNA结构模式为: 5-帽子-5非编码区-编码区-3非编码区-多聚A。 tRNA二级结构呈三叶草形。 核酸变性是指核酸分子中碱基对间的氢键被破坏，变成单链的过程；Tm为DNA热变性温度。 变性后的两条互补单链恢复碱基配对，重新成为双螺旋的过程称为复性。 不同来源的变性单链在同一溶液中进行退火时，得到分子间部分配对的双链，称为分子杂交。,50,DNA芯片的应用： 基因诊断 分析基因组及发现新基因 DNA芯片用于基因表达的研究 利用DNA芯片技术进行DNA序列分析 进行后基因组研究,51,习 题,1. 比较DNA、RNA在化学组成上，大分子结构上，生物学功能方面的异同点。 2. 简述DNA分子双螺旋结构模型的基本要点。 3. 比较DNA的变性与复性。,