第九章基因诊断.ppt

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1、第九章 基因诊断,第一节 基因诊断的概念 及常用技术,基因诊断利用分子生物学技术，从 DNA/RNA水平检测基因的存在,分析基因的结构变异和表达状态，从而对疾病作出诊断。,一、基本概念,二、基因诊断常用方法, 核酸分子杂交 PCR DNA序列测定 DNA芯片技术,(一) 核酸杂交,基本原理-核酸变性和复性理论 即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在与其互补的同源核苷酸序列。,核酸杂交的关键要素,probe DNA target DNA signal detection,核酸

2、杂交方法分类,按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交两种类型。 固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。,固相杂交分类,Southern 印记杂交 Northern 印记杂交 斑点杂交 原位杂交,Southern blot 是最经典的基因分析方法，不但能检出特异的DNA片段，而且能进行定量和测定分子量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变分析等。,Northern杂交,用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA或mRNA进行定性和定量分析。,斑点杂交（Dot blot）,可用基因组中特定基因及其表达的定性及定量分

3、析，方法简单、快速灵敏、样品用量少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量，特异性不高，有一定比例的假阳性。,原位杂交 （Colony in situ hybridization）,可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可检出基因和基因产物的亚细胞定位。,（二）利用PCR及结合其他技术进行基因诊断,直接采用PCR进行基因诊断 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCR-RFLPs）进行基因诊断 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）斑点杂交进行基因诊断 * 通过

4、PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断 采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基因诊断 采用PCR技术对靶核酸进行定量分析,寡核苷酸杂交分析SNP和等位基因特异寡核苷酸杂交 （ASO）#,（三） DNA序列测定,DNA序列测定是进行基因突变检测的最直接、最准确的方法，可以确定突变的部位，突变的性质。,（四 ） DNA芯片技术,应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变多态性，对基因表达的情况进行分析。,二 基因诊断的特点,高特异性 高灵敏度 获得稳定的结果 早期快速 适用性强，应用范围广,第二节 遗传病的基因诊断,一、概述,人类的遗传病达数千种 地中海贫血在意大利等国家发病率

5、达10 镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14 我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异常血红蛋白病和血友病。 有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛查，产前早期诊断，降低发病率。,二、镰状细胞贫血,血红蛋白病（异常血红蛋白病） 红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫血。 患者多在成年以前死亡,Mst酶切位点(CCTNAGG),5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,（一）镰状红细胞贫血分子机制,5 6 7 -Pro Glu Glu -CCT GAG GAG-,5 6 7 -Pro Ala Glu -CCT GTG GAG-,（二）镰状细胞贫血的基因诊断方法,限制性内切酶/Souther

6、n blot 采集制备血液DNA内切酶Mst消化电泳转膜32P标记的珠蛋白cDNA杂交放射自显影,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析,PCR/限制性内切酶 设计引物PCR扩增产物进行限制性内切酶酶切电泳EB染色直接观察 例： 引物1：5-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3 引物2：5-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3 扩增产物294bp,镰状细胞贫血的基因诊断方法,引物1,CCT GAG GAG,CCT GTG GAG,引物1,引物2,引物2,294bp,103bp,191bp,Mst

7、酶切位点(CCTNAGG),103bp,191bp,294bp,正常人,突变携带着,患者,镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析,RT-PCR/序列分析 采集制备血液RNART-PCR产物测序推测氨基酸序列进行诊断,镰状细胞贫血的基因诊断方法,二、地中海贫血 (Thalassaemia,简写thal或T),珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少（）或完全缺失（0） 珠蛋白合成速率降低，导致链和链合成的不平衡多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上改变了膜的通透性和硬度导致溶血性贫血。 高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人；中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发病率最高。 缺乏有效治疗措施

8、。,（一） 地贫病的分子基础,珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子（IVSI和IVS-II），3个外显子。 目前发现突变有百余种，中国人群发现约20种； 一般对特定种族来说，90%的地贫基因仅由46种突变组成。,（二） 地中海贫血的基因诊断,PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和580bp，分别包含14种和1种可能突变）合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（46对，分别标记） 制备DNA样品 PCR扩增 斑点印迹杂交 RFLP分析法,三地中海贫血的基因诊断,c,左侧缺失4.2kb,右侧缺失3.7kb,b,b,b,a,2,1,1,2N端1C端,正常基因序列,PCR扩

9、增法定性分析,左侧缺失型基因序列,右侧缺失型基因序列,ac扩增0.4kb ab无扩增片段,ab扩增1.2kb,0.4kb,1.2kb,正常人,右侧缺 失患者,地中海贫血患者基因组的PCR分析,左侧缺失患者,四、杜氏肌营养不良症（DMD）,1. DMD是常见的性连锁隐性遗传病， 2. 主要特征是进行性肌萎缩和肠肌假性肥大，XP21.2121.3区抗肌萎缩蛋白基因突变形式不同。 DMD多在5岁发病，10岁左右瘫痪，在20岁左右由于心力和呼吸衰竭而死亡，其发病率为活产男婴的1/3500。,（一）DMD分子基础：,抗肌萎缩蛋白基因长约2900kb，含79个外显子。抗肌萎缩蛋白基因突变分为基因缺失型和非

10、基因缺失型。 （1）DNA片段缺失（60%的病例导致阅读框移码移码实变致DMD，整码缺失BMD）。缺失的2个热点区该基因5端处4555外显子范围内。 （2）非基因缺失型部分重复（病例的5%）,（1）基因组探针法 用XP21区分离得到的不同探针如（P20）来进行相应内切酶酶谱分析、检出率取决于探针数和酶切位点数目。 （2）cDNA探针法 抗肌萎缩蛋白基因系列cDNA探针分析患者基因缺失、外显子拼接改变和基因内部分重复。 （3）多重PCR法 如有人设计多对引物进行多重PCR扩增该基因的9个易发缺失“热点区”DNA片段，可检出80%有基因缺失的DMD患者。 （4）多态性分析法 基因内及其旁侧探针进行

11、RFLP连锁分析。 （5）RTPCR扩增该基因外显子（全长2.4MB、外显子起来全长c14kb、用多对引物）可检出：外显子拼接异常。联用测序：可定位基因缺失的起始和终止。,1、苯丙酮尿症是一种常见的隐性遗传性氨基酸代谢病。 2、主要特征： （1）苯丙氨酸 酪氨酸多巴儿茶酚胺 苯丙酮酸 酪胺 黑色素 （2）患儿出生后须及早得到低phe饮食治疗，否则发生不可逆大脑损害和严重智力发育障碍。,五、苯丙酮尿症（PKU）,（一 ） PKU分子基础,（1）迄今约3/4的导致中国人PKU的突变基因已被查清 ，它们分属11种PAH基因点突变。体外研究表明，这些突变导致PAH活力或丧失。 （2）PAH第11外显子

12、的第399密码GTA（val）GTT（val）中性突变：不改变任何限制酶识别位点，故又称“序列多态性”。这一“序列多态性”在PKU患者和正常人中存在着连锁不平衡性， 故可作为一种“遗传标记”应用于产前诊断。,PCR/ASO探针法和PCR-RFLP连锁分析法。 PCR/SSCP 直接测序法若待诊断的PKU家系的基因突变类型尚属“未知”或无RFLP信息。,（二）PKU的DNA诊断,先合成ASO 如： 正常探针： TCCATTAACAGTAAGAATTT 突变探针： TCCATTAACAATAAGAATTT,利用PCR/ASO探针法诊断苯丙酮尿症,利用PCR/ASO探针法诊断苯丙酮尿症, , ,健康

13、男性 男性携带者 男性患者 健康女性 女性携带者 女性患者,正常探针,突变探针,第三节 肿瘤的基因诊断,1 通过检测肿瘤染色体易位及融合基因诊断肿瘤 慢粒：（染色体易位）费城染色体 PCR检测融合基因 2 检测肿瘤相关基因 癌基因（ras）、抑癌基因（ p53）、肿瘤转移基因 3 检测肿瘤相关病毒基因 HBV HCV肝癌 EB鼻咽癌 4 检测肿瘤标志物基因或mRNA 肝癌甲胎蛋白（AFP） 结肠癌癌胚抗原（CEA）,肿瘤基因诊断的策略,肿瘤标记物基因的检测,c- abl gene,bcr-abl 融合蛋白（具PTK活性）,慢性骨髓白血病,引物A,引物 B,2 癌基因和抑癌基因的检测,ras癌基

14、因的检测 ras基因中最常见的点突变是第12，13或61密码子突变 检测方法： PCR/ASO PCR-SSCP, p53的检测 p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130290，以175、273、284最多见 检测方法： PCRSSCP PCR测序 PCRRFLP, 其它基因的 检测 PCR结合其它技术 基因芯片,4、肿瘤标志物检测或mRNA诊断,肿瘤标志物 是由肿瘤组织细胞产生的、与肿瘤形成和发展相关的物质，包括肿瘤抗原、激素、酶、同工酶等。 基因标志和基因表型标志（胚胎性抗原） 检测方法： PCRASO PCR测序 PCRRFLP PCRSSCP,第四节 感染性疾病的 基因诊断

15、,一、感染性疾病基因 诊断的策略,针对病原体特异的核酸序列设计探针进行杂交 应用PCR技术扩增病原体基因保守序列 核酸杂交技术与PCR技术联合应用,特点,简便、特异、快捷 能检测出潜在的病原体 可对病原体进行分类、分型鉴定 不能得知病原体进入体内后机体的反应,二、基因诊断的感染性疾病,（一）、病毒 特点： 分离培养周期长，操作繁杂，制约因素多 电镜观察直观快速，但昂贵 免疫学诊断简便快速，但存在问题： 不易检出潜伏期的病毒 有些病毒亚型多，抗原变异性大 整合进入人基因组的病毒,病毒核酸分析技术,HBV包含4个开放阅读框，S、C、P、X PCR PCR/限制性内切酶谱分析 PCR/点杂交, PC

16、R/Southern blot 基因芯片,*HIV病毒基因组结构,Probe TGAGTTGCAACAGATGCTGTTGCGCCTCAATAGCCCTCAG,PCR/核酸杂交诊断艾滋病,SARSRTPCR 多重PCR 荧光定量PCR,（二）、细菌 细菌性痢疾志贺菌，侵袭性大肠杆菌，大质粒；PCR 结核病PCR,（三）、寄生虫 重复序列探针法、寡核苷酸探针法、基因组探针法、PCR,第五节 基因诊断策略,（一）检测致病基因突变,基因变异致病的类型： 内源基因的变异 基因结构的突变 点突变、插入、缺失、重排、异位 基因表达异常 mRNA剪接异常 外源基因的插入,点突变的诊断,诊断已知的点突变 （P

17、CR） 一对探针 突变碱基置探针中央 控制杂交条件 结果分析： 反向杂交技术,诊断未知的突变 PCR/测序 DNA芯片技术,分析与疾病连锁的遗传标志,对于还不清楚基因的多数基因病，可通过检测与特定染色体位点连锁的遗传标记来进行基因诊断。 基本方法：PCR产物酶切产物电泳分析。基因连锁分析（PCR/RFLP连锁分析法）,（三）建立多基因疾病表型克隆,一些多基因、多因素疾病，不仅涉及多个基因还涉及一些环境因素及其与基因的相互作用。 表型克隆从分析正常与异常基因组的相同或差异，找到正常人与疾病患者之间的差异序列和相同序列，进而分离、鉴定与疾病相关的多个基因，确定导致疾病的分子缺陷。,定量分析致病基因的表达水平,mRNA的相对定量分析 斑点杂交或狭缝杂交 RTPCR mRNA的绝对定量分析 RTPCR/竞争性PCR mRNA长度分析 Northern杂交/ RTPCR产物电泳,第六节基因诊断的应用前景,一、基因诊断技术的发展史,20世纪80年代初以前，DNA分子杂交、RFLP PCR技术建立和完善后PCR 基因芯片技术的建立高通量密集型技术,二、基因诊断技术的前景,人类基因组计划的完成 功能基因组计划的进行,三、基因诊断技术的问题,理论问题 技术问题 伦理问题,