第九章氨基酸.ppt

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1、第九章 氨基酸发酵 第一节、谷氨酸发酵 第二节、赖氨酸发酵,氨基酸的用途 (一)、在食品工业中的应用 1、强化食品：赖氨酸、色氨酸和苏氨酸常用于强化食品，使小麦、玉米、大米等食物提高营养价值。 2、作为调味剂：谷氨酸及天门冬氨酸的钠盐具有鲜味，特别是谷氨酸的一钠盐常用作鲜味剂。 3、作为人工甜味剂的原料：自从发现L-天门冬氨酸-L-苯丙氨酸甲酯(APM)的甜味为蔗糖的150-200倍后，对天门冬氨酸肽类的甜味进行了广泛的研究，其中以L-天冬氨酰-氨基丙二酸蒎醇甲醇二酯具有最大的甜味，为蔗糖的22000-33200倍。,(二)、在饲料中的应用 在饲料中添加赖氨酸和蛋氨酸，可加速猪等家畜的生长，改

2、良肉的质量。蛋氨酸可以提高家禽的产蛋率。 (三)在医药上的应用 几乎所有的氨基酸和它们的盐类在医药上都可作为注射剂或一般药物，医治各种疾病，各种氨基酸的混合液不但作为营养注射剂或口服液，而且为宇航员、飞行员等的强化剂食品。 (四)工业上的应用 聚谷氨酸树脂的薄膜具有天然的皮革性能，可制耐季节气候变化的人造皮革和涂料。谷氨酸还可制人造纤维。甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸可制表面活性剂、缓冲剂和抗氧剂等。,氨基酸生产的历史 氨基酸生产首先从谷氨酸开始 19l0年日本味之素公司采用提取法大量生产味精 1936年美国从甜菜废液中提取谷氨酸 日本在1956年用糖质原料发酵谷氨酸成功，完全取代了原来的水解法。

3、1960年发酵法生产了赖氨酸，同年用合成法生产dl蛋氨酸。 1962年谷氨酸的合成法生产成功 1966年采用醋酸原料生产谷氨酸，此后石油发酵谷氨酸、赖氨酸、酪氨酸等也获得成功 目前氨基酸几乎都可应用发酵法生产。,我国味精生产开始于1923年，上海天厨味精厂最先用水解法生产 1932年沈阳开始用脱脂豆粉水解生产味精 1964年上海味精厂和有关科学研究单位协作，开始采用发酵法生产味精，现在全国已普遍采用 目前我们除味精外，还生产了赖氨酸、蛋氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸等十多种氨基酸。,氨基酸的生产方法,发酵法： 直接发酵法： 野生菌株发酵、营养缺陷型突变发酵、抗氨基酸结构类似物突变株发酵、抗氨基

4、酸结构类似物突变株的营养缺陷型菌株发酵和营养缺陷型回复突变株发酵。 添加前体法,酶法：利用微生物细胞或微生物产生的酶来制造氨基酸。 提取法：蛋白质水解，从水解液中提取。胱氨酸、半胱氨酸和酪氨酸 合成法：DL-蛋氨酸、丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸。 传统的提取法、酶法和化学合成法由于前体物的成本高,工艺复杂,难以达到工业化生产的目的。,生产氨基酸的大国为日本和德国。 日本的味之素、协和发酵及德国的德固沙是世界氨基酸生产的三巨头。它们能生产高品质的氨基酸,可直接用于输液制剂的生产。 日本在美国、法国等建立了合资的氨基酸生产厂家,生产氨基酸和天冬甜精等衍生物。,国内生产氨基酸的厂家主要是天津氨基酸公司,

5、湖北八峰氨基酸公司,但目前无论生产规模及产品质量还难于与国外抗衡. 在80年代中后期,我国从日本的味之素、协和发酵以技贸合作的方式引进输液制剂的制造技术和仿造产品,1991年销售量为二千万瓶,1996年达六千万瓶,主要厂家有无锡华瑞,北京费森尤斯,昆明康普莱特,但生产原料都依赖进口。 2000年,世界氨基酸产值可达45亿美元,占生物技术市场的7%,国内的氨基酸产值可达40亿元,占全国发酵产业总产值的12%。,第一节 谷氨酸发酵 一、概述 二、谷氨酸的生产菌种 三、谷氨酸的生物合成途径及谷氨酸积累的条件 四、生物素对谷氨酸的生物合成的影响 五、如何克服生物素过量带来的问题 六、其它环境条件对谷氨

6、酸合成的影响 七、谷氨酸的提取,一、概述,水解法(如盐酸水解面筋蛋白质、大豆蛋白质、玉米蛋白质等) 从废液中提取法(如甜菜废糖蜜中含游离谷氨酸3.5) 60年代试制过合成法(如以石油裂解气丙烯为原料合成谷氨酸)天然氨基酸都为L-型，化学合成法一般产品中除L-谷氨酸外，还有D-谷氨酸DL-谷氨酸。 这些D-型的谷氨酸需用微生物进行转化，使成为L-谷氨酸,工业化生产开始于由水解小麦面筋或大豆蛋白质而制取。 1957年，日本率先采用微生物发酵法生产，并投入大规模工业化生产，这是被誉为现代发酵工业的重大创举，使发酵工业进入调节代谢的调控阶段。 目前世界产谷氨酸钠30万吨/年，占氨基酸总量的2/3。 我

7、国现已有200余家生产，年产量达15万吨，居世界首位。,二、谷氨酸的生产菌种,很久以来人们就知道在微生物的培养滤液中有多种氨基酸存在，有人测试了几千个微生物菌株的氨基酸形成的情况， 发现大部分菌株在一定条件下能够向基质中分泌氨基酸，其中有些菌株产生谷氨酸较高，随后进行大量的筛选工作，发掘的菌种逐渐增多，目前工业应用的谷氨酸产生菌，有下列几种：,谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium glutamicum） 乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum） 散枝短杆菌（Brevibacterium divaricatum） 黄色短杆菌（Brevibacteri

8、um flavum） 硫殖短杆菌（Brevibacterium thiogenitalis） 嗜氨小杆菌（Microbacterium ammoniaphilum）,菌株特点： 革兰氏阳性 不形成芽胞 没有鞭毛，不能运动 需要生物素作为生长因子 在通气条件下才能产生谷氨酸。,三、谷氨酸的生物合成途径及谷氨酸积累的条件,由葡萄糖生物合成柠檬酸的代谢途径,葡萄糖,6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖酸,6-磷酸葡萄糖酸,3-磷酸甘油醛,丙酮酸,丙氨酸,乙酰CoA,HMP,乳酸,CO2,草酰乙酸,柠檬酸,CO2,CO2,3-磷酸甘油醛,丙酮酸,乙酰CoA,草酰乙酸,柠檬酸,顺乌头酸,异柠檬酸,草酰琥珀酸,

9、-酮戊二酸,琥珀酸,延胡索酸,苹果酸,乙酰CoA,乙醛酸,乙酸,乙酰CoA,谷氨酸,NH+4,L-谷氨酸脱氢酶,一定的糖酵解速度，不能走向乳酸等合成。 生成丙酮酸后，一部分氧化脱羧生成乙酰CoA，一部分固定CO2生成草酰乙酸。 生成的乙酰CoA不向脂肪酸合成途径转化，全部趋于合成柠檬酸。 -酮戊二酸不转化为琥珀酸。 异柠檬酸裂解酶活性弱，即不形成乙醛酸环。 异柠檬酸脱氢酶活性强。 L-谷氨酸脱氢酶活性强。,谷氨酸积累的理想条件,对于正常生理的微生物，通过自身的代谢调节，谷氨酸是不能大量在细胞内积累的。 细胞膜透性大，生成的谷氨酸分泌于细胞外，以克服终产物的反馈调节。,黄色短杆菌中谷氨酸的代谢调

10、节机制如下图所示,1.切断或减弱支路代谢 2.解除自身的反馈抑制 3.增加前体物的合成 4.提高细胞膜的渗透性 5.强化能量代谢 6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株,谷氨酸生产菌的具体育种思路,四、生物素对谷氨酸的生物合成的影响,1、生物素影响糖酵解的速度 2、生物素影响异柠檬酸裂解酶的活性 3、生物素是羧化酶的辅基 4、生物素影响细胞膜的透性,作为催化脂肪酸生物合成最初反应的关键酶乙酰CoA的辅酶，参与脂肪酸的生物合在，进而影响磷酯的合成。 当磷酯含量减少到正常时的一半左右时，细胞发生变形，谷氨酸能够从胞内渗出，积累于发酵液中。 生物素过量，则发酵过程菌体大量繁殖，不产或少产谷氨酸，代谢

11、产物中乳酸和琥珀酸明显增多。,CH3COSCoA + ATP + CO2 HOOCCH2COSCoA + ADP + Pi,乙酰CoA,丙二酰CoA,乙酰CoA羧化酶 生物素 Mg2+,生物素量少，脂肪酸的合成减少，进而影响细胞膜的合成，造成细胞膜透性大,五、如何克服生物素过量带来的问题,1、选育油酸缺陷型 2、选育甘油缺陷型 3、加入表面活性剂或高级饱和脂肪酸 4、加入青霉素或头孢菌素C,六、其它环境条件对谷氨酸合成的影响,1、通气：加大通气有利于谷氨酸的合成，通气不足转向乳酸的合成。 2、温度：适当提高温度有利于谷氨酸的合成。 3、氨：CN=1000.52 合成菌体 CN=10011 以上

12、合成谷氨酸 缺乏氨：积累-酮戊二酸 氨浓度高：谷氨酸进一步生成谷氨酰胺 4、磷酸盐：不能太高，否则合成缬氨酸 5、pH:最适为7.2-7.4。,七、谷氨酸合成的提取,（一）等电点法： 谷氨酸等电点为3.2 工艺如下：,发酵液,调酸至pH 4.5,继续调酸至pH 3.03.2,搅拌20小时,静置沉降6小时,离心分离,母液,谷氨酸,离子交换,操作简单，收率60。周期长，占地面积大。,谷氨酸脱氢酶最适pH为7.0-7.2 转氨酶最适pH 7.2-7.4。 在发酵中后期，保持pH不变。过高转为谷氨酰胺，过低氨离子不足。,（二）离子交换法： 用强酸型阳离子树脂吸附后，用4的NaOH洗脱，然后树脂用5.4

13、的HCl再生。,（三）盐酸盐法： 发酵液中除含谷氨酸外，尚有一定量的谷氨酰胺及焦谷氨酸，用等电点及离子交换提取均无法回收，可用盐酸水解来提高收率。盐酸水解时也使菌体蛋白水解成氨基酸并可使碳水比合物破坏，生成腐殖质而被除去，提高水解液质量。 利用谷氨酸盐在浓盐酸中溶解度低而将谷氨酸与其它杂质分离。,谷氨酸盐酸盐的溶解度（20）,（四）锌盐法： 利用谷氨酸锌在水溶液中的溶解度低的原理，加入硫酸锌，当溶液中pH为6.3时，生成谷氨酸锌沉淀，然后加热，调pH至2.42.6，分离出谷氨酸。,谷氨酸制味精的工艺流程,第二节 赖氨酸发酵 一、赖氨酸的生产方法 二、赖氨酸的生物合成途径 三、二氨基庚二酸途径的

14、调节 四、赖氨酸的菌种选育 五、赖氨酸发酵生产工艺 六、赖氨酸的提取,一、赖氨酸的生产方法,（一）、提取法 自乳酪素或血粉中提取，乳酪素或血粉经盐酸或硫酸水解、浓缩等工序后，在pH l.8-2.0时以强酸性阳离子交换树脂吸附、氨水洗脱，或苦味酸沉淀等方法获得赖氨酸结晶。 （二）、合成法 化学法合成-赖氨酸的工艺很多，用于工业化的生产方法有荷兰DSM法和日本东丽法两种。 DSM法是以己内酰胺为原料，东丽法以环己烯(环己烷光硝化过程的副产物)为原料，两者都是先生成-氨基己内酰胺，再经水解生成DL-赖氨酸，以后再用酶法进行分割，制成L-赖氨酸。,酶法分割 将乙酰-DL-赖氨酸通过酰化酶的作用，使具生

15、物活性的L-赖氨酸分离出。 酰化酶只能作用于乙酰-L-赖氨酸，而对乙酰-D-赖氨酸不起反应，酰化酶作用后，得到L-赖氨酸和乙酰-D-赖氨酸，提取L-赖氨酸。 乙酰-D-赖氨酸再用化学消旋法消旋生成乙酰-DL-赖氨酸。,反应过程如下：,DL-赖氨酸,乙酰-DL-赖氨酸,L-赖氨酸,乙酰-D-赖氨酸,酰化酶水解,乙酰化,化学法消旋,（三）、酶法合成 利用隐球酵母产生的L-氨基己内酰胺水解酶将L-氨基己内酰胺水解，生成L-赖氨酸。 这种酶只能水解L-型的，而对D-型则无能为力。D-氨基己内酰胺需通过无色杆菌产生的D-氨基己内酰胺消旋酶将其消旋化，生成L-氨基己内酰胺。 如将以上两种菌混合培养，则可使

16、DL-氨基己内酰胺直接转化，全部生成L-赖氨酸。 （四）、发酵法 以谷氨酸棒杆菌或黄色短杆菌发酵生产。,二、赖氨酸的生物合成途径,微生物生物合成赖氨酸有两条途径： 细菌类的二氨基庚二酸(DAP)途径，除细菌外，也存在于绿藻，原生动物和高等植物之中。 霉菌、酵母的-氨基己二酸途径，这是一条循环途径。,三、二氨基庚二酸途径的调节,二氨基庚二酸途径广泛存在于细菌之中，但其代谢控制却是多种多样的，即使是亲缘关系很近的菌株之间也不一样。 这条途径以天门冬氨酸作为起始物质，在这条途径中合成的还有苏氨酸、蛋氨酸和异亮氨酸。,天门冬氨酸,天门冬氨酰磷酸,天门冬氨酸-半醛,二氢吡啶二羧酸,四氢吡啶二羧酸,二氨基

17、庚二酸,赖氨酸,高丝氨酸,胱硫醚,磷酸高丝氨酸,高半胱氨酸,蛋氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,天门冬氨酸激酶,高丝氨酸脱氢酶,天门冬氨酸,天门冬氨酰磷酸,天门冬氨酸-半醛,二氢吡啶二羧酸,四氢吡啶二羧酸,二氨基庚二酸,赖氨酸,高丝氨酸,胱硫醚,磷酸高丝氨酸,高半胱氨酸,蛋氨酸,苏氨酸,异亮氨酸,天门冬氨酸激酶,高丝氨酸脱氢酶,四、赖氨酸的菌种选育,（一）、切断支路代谢 以谷氨酸棒杆菌为出发菌株，选育高丝氨酸缺陷型切断苏氨酸和蛋氨酸的分支途径，是积累赖氨酸的有效措施。 （二）、增加前体物质的合成 为了提高赖氨酸产率，应设法增加前体物天门冬氨酸的浓度，如：选育丙氨酸缺陷型，丙酮酸和天门冬氨酸是赖氨酸和丙氨

18、酸生物合成的共同前体。 丙氨酸可由丙酮酸与L-氨基酸通过转氨酶作用而生成，亦可在-酮戊二酸和亮氨酸存在时，由天门冬氨酸-脱烃酶所催化，直接从天门冬氨酸脱烃形成。选育丙氨酸缺陷型，增强生物合成天门冬氨酸的代谢流，能提高赖氨酸产量。,（三）、增大谷氨酸的反馈抑制 增大谷氨酸的反馈控制，能增强生物合成天门冬氨酸的代谢流。 与谷氨酸发酵相比，生物素丰富(30-50g/l)，是提高产赖氨酸的关键。,丙酮酸,草酰乙酸,柠檬酸,-酮戊二酸,谷氨酸,天门冬氨酸,（四）、解除代谢互锁 赖氨酸与亮氨酸生物合成之间存在代谢互锁，即二氢吡啶二羧酸合成酶为亮氨酸所阻遏，应设法解除，如：选育亮氨酸缺陷型。此外，选育烟酰胺

19、缺陷型也能解除代谢互锁因为烟酰胺参与亮氨酸合成。,五、赖氨酸发酵生产工艺 1、温度：种子培养温度30-32，发酵温度32-34。 2、氧气：在发酵过程中，并不需要培养基中的氧浓度达到饱和，只要维持在临界氧浓度之上即可。 3、流加碳源：初糖浓度太高时，菌种接种后的适应期延长，比生长速率增加，赖氨酸生成速度降低，采用高糖流加发酵的方法比较合适。 4、流加氮源：赖氨酸发酵需维持高氮量，例如，总氮量需加4-5(NH4)2SO4，如全部作初氮加入，赖氨酸的产量不及2-3(NH4)2SO4的高，如采用流加方法，则产量显著提高。,六、赖氨酸的提取 （一）、晶析法 通过将发酵醪pH调整到3-7，以满足以下两个条件：X0.32 及 XY0.32，赖氨酸就形成两个结晶水的盐酸盐的结晶。,X = 0.32,赖氨酸总重百分数,发酵液中干物质总重百分数,XY = 0.32,HCL（mol）,赖氨酸（mol）,（二）、离子交换法 强酸性苯乙烯型阳离子交换树脂之氢型RSO3H及铵型RSO3NH4均可吸附赖氨酸，但铵型树脂能选择性的吸附赖氨酸及其它碱性氨基酸(如精氨酸、鸟氨酸)而不吸附其它中性氨基酸及酸性氨基酸，因赖氨酸发酵液中很少有精氨酸，故能比较容易地与其它氨基酸分离。,