重组DNA技术.ppt

《重组DNA技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组DNA技术.ppt（53页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、1 第七章 重组DNA技术 (Recombination DNA Technology) 2 第一节 基 本 概 念 3 重组DNA技术： 是指在基因水平上，将目 的DNA在体外重组于能自我复制 的载体DNA分子上，然后将重组 DNA导入宿主细胞中进行增生， 以获得大量的目的DNA片段，或 以此为基础，通过基因的诱导 表达，得到大量相应蛋白质产 物的过程。 又称为分子克隆技术或基 因工程技术 4 第二节 重组DNA技术的发展史 5 基因工程的诞生 1、Berg的开创性实验第一个实现DNA重组 1980年Nobel化学奖 猴病毒SV40的DNA+噬菌体的DNA 2 2、Boyer-CohenBo

2、yer-Cohen实验实验第一个取得基因工程成功 1973年构建双重抗药性重组质粒 1973年是基因工程诞生的元年 6 第三节 工具酶 7 Werner Arber 理论预见限制酶 Hamilton O. Smith 得到第一个限制酶 Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片断 1978年Nobel生理或医学奖 1、 “基因剪刀”限制性核酸内切酶 8 1.定义：能识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并 在识别序列内或附近切割DNA双链结构的一类核 酸内切酶（在核酸分子链的内部制造切口的酶）。 2.来源：原核生物 9 型酶、型酶： 具有限制切割与甲基化修饰活性。型和型酶都

3、没 有多大的实用价值。 型酶： 应用广泛，能在DNA分子内部的特异位点，识别和切 割双链DNA，其切割位点的序列可知、固定。 通常所说的限制性内切酶就是指型酶。 3.分类：根据结构、作用特点不同，分为三类。 10 识别位点：即为型酶识别的特殊DNA序列。 通常是48个碱基对、具有回文序列的DNA片段 5 G A A T T C - 3 3 C T T A A G - 5 4.识别和切割位点： 11 5突出粘性末端 3突出粘性末端 平头（钝性末端） 12 5突出黏性末端(EcoR)： 3突出黏性末端(Pst)： 平端缺口（钝性末端）( Sma） 5-GAATTC-3 5-G AATTC-3 3-

4、CTTAAG-5 3-CTTAA G-5 + 5-CTGCAG-3 5-CTGCA G-3 3-GACGTC-5 3-G ACGTC-5+ + 5-CCCGGG-3 5-CCC GGG-3 3-GGGCCC-5 3-GGG CCC-5 + 切割方式：对dsDNA 2条链同时切割产生3种不同缺口 13 2、DNA连接酶 催化DNA中相邻的5端磷酸基和3-OH末端之间形成 35磷酸二酯键。 大肠杆菌连接酶，只能连接粘性末端，T4噬菌体连接酶不 但能连接粘性末端， 还能连接齐平末端。 ACG-OH P-AATTCGT TACTTAA-P OH-GCA -ACGAATTCGT- -TGCTTAAGCA

5、 14 3、DNA聚合酶 具有53聚合活性、53外切酶活性、35外切酶活性 。 可用于合成双链cDNA分子或片断连接，探针制备，序列分析等 。 （1）耐热Taq DNA聚合酶 最适反应温度为7580 具有53外切酶活性，不具有35外切酶活性 （3）T4 DNA聚合酶：主要用于DNA的末端的标记。 （4）T7 DAN聚合酶 长模板DNA引物的延伸反应，标记DNA。 （2）逆转录酶 15 （5） DNA聚合酶大片段（Klenow 片段） 为DNA聚合酶I用枯草杆菌蛋白酶裂解后产生的大片段，分 子量为76 kD，这个片段也称为Klenow片段（Klenow fragment ） 它除了保留53聚合酶

6、活性及35外切酶活性外 ，失去了53外切酶活性。 常用于cDNA第二链合成，双链DNA 3端标记等。 16 （1）5端标记 （2）制备载体时，用碱性磷酸酶处理后，可防止载体自身 连接，提高重组效率。 碱性磷酸酶有细菌碱性磷酸酶（BAP）和牛小肠碱性磷酸 酶（CIP）。CIP能在 1% SDS溶液中68 加热15 min而 失活，故CIP较为常用。 4、碱性磷酸酶 去除DNA、RNA、dNTP和NTP 5端的磷酸根。 17 催化单脱氧核苷酸转移到DNA3-端羟基上。 应用：探针标记，标记测序以及制备人工黏性末端 。 催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化。 用途：放射性标记DNA的5端 使缺少5-磷酸基

7、的DNA磷酸化用于连接反应。 单链核酸内切酶，降解单链DNA或RNA。 6、T4多聚核苷酸激酶 7、S1核酸酶 5、末端转移酶 18 第四节 重组DNA技术常用载体 19 是指能携带目的基因进入宿主细胞进行扩增和表达的一 类DNA分子。 一、定义 分类： 克隆载体：用于在宿主细胞中克隆和扩增外 源DNA片段。 表达载体：用于在宿主细胞中获得外源基因 表达产物。 20 1、具备复制能力。 2、具备一个或多个筛选标志。 3、具备较多拷贝数，易从宿主细胞中分离纯化。 4、具备一个或多个限制性内切酶的单一识别点（多克隆位 点，MCS）。 5、具有较高的遗传稳定性。 二、特点 21 这些载体均需经人工构

8、建，除去致病基因，并赋 予一些新的功能：如有利于进行筛选的标志基因、单一 的限制酶切点等。 3、常用载体 质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA、酵母DNA 22 1、质粒（plasmid）: 质粒为细菌染色体之外一些能独立复制并保持稳定遗传的 复制子。结构上，它是一种双链闭合环状的DNA分子。 23 pBR322质粒载体 相对分子质量小，长度为4.3kb 。 含有氨苄青霉素和四环素的抗性 基因(Ampr和Tetr)。 有24种限制性内切酶位点。 有一个复制起始点（ori）及与 DNA复制有关的序列，赋予该质粒 复制子特性。 为松弛型复制子。 24 是感染细菌的一类病毒， 寄生于细菌中，并能溶解

9、细菌 细胞，故称噬菌体。 2、噬菌体（bacteriophage,phage) 25 噬菌体生活周期 26 27 4、病毒 3、酵母 酵母人工染色体（YAC）：用于大片段DNA的克隆 。 28 第五节 重组DNA技术 29 基本步骤 目的基因的获取 重组DNA导入受体菌 目的基因与载体 连接成重组DNA 克隆载体的选择 重组体的筛选 克隆基因的表达 30 1、 制备目的基因 （1）化学合成： 已知目的基因的核苷酸序列或根据基因产物的氨基酸序 列推导出相应基因DNA碱基序列。 目前使用DNA合成仪合成的片段长度有限，一般用于小 分子活性多肽基因的合成，较长的链则须分段合成，然后用 连接酶加以连接

10、。 31 （2）构建基因组DNA文库： 将某种生物细胞的整个基 因组DNA用物理或酶学的方法 切割成预期大小的片断，并将 所有这些片断都与适当的载体 连接，引入相应的宿主细胞中 保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体 上带有了该生物体的全部基 因，称为基因文库。 32 (3)构建cDNA文库： 33 (5)直接用限制性内切酶切取、分离： 对一些物理图谱已经确定，背景资料清楚的 原核生物、噬菌体及病毒等基因组，可直接用限 制性内切酶消化后，通过分离获得目的基因。 (4)聚合酶链反应（PCR） 已知目的基因的基因序列，用PCR从基因组 DNA中获得目的基因，或用逆转录PCR方法直接从 mRNA获得特

11、定基因的cDNA。 34 2、克隆载体的选择和构建 用于基因组文库构建的载体通常选装载量较大的噬菌体 和黏性质粒； cDNA文库和克隆较小DNA片段通常选pUC系列质粒； 待测DNA序列使用M13噬菌体。 35 由同一种限制酶切 割或不同的限制酶切割 形成互补的黏性末端。 经退火后，由DNA连接 酶连接。 3、目的基因与载体的连接 粘性末端连接： 36 平端 DNA片段可以在T4 DNA连接酶的作用 下相连接，但连接效率较低。为提高连接效率, 所用的ATP及T4 DNA连接酶的浓度比粘性末端 连接要高些。 （2）平端连接： 37 （3）定向连接： Eco R切割位点Bg l切割位点 + + E

12、coR+ Bg l 双酶切 Eco R+ Bg l 双酶切 T4 DNA连接酶 重组体 38 （4）同聚物加尾连接： 39 （5）人工接头连接： 接头是指含有某些 限制性内切酶切点的寡 核苷酸片段。 CCGAATTCG GGCTTAAGC 5- 3- Eco R 40 4、重组DNA导入受菌体 将重组DNA或其他外源DNA导入宿主细胞的常用方法： 转化、感染、转染、显微注射、电穿孔等。 转化（transformation）：是指将重组质粒DNA导入受体细胞 。 转染（transfection）：将重组噬菌体DNA直接引入受体细胞 的过程。 转导（transduction）：重组噬菌体DNA分子

13、，在体外经过包 装成具有感染能力的噬菌体颗粒，再以此噬菌体为载体，将 重组DNA导入受体细胞内的过程，也称为感染（infection）。 41 5、重组体的筛选与鉴定 筛选是指通过某些特定方法，从被转化的细 胞群体或基因文库中，鉴别出真正的阳性重组子 的过程。 42 （一）根据遗传表型进行筛选的方法 （1）抗生素抗性筛选 （2）-半乳糖苷酶系统筛选 （二）根据重组子结构特征进行筛选的方法 方法： 43 （1）抗生素抗性筛选: 大多数载体均带有抗生素抗性基因 （一）根据遗传表型进行筛选的方法 b.插入失活法:外源基因插入到一个抗性基因位点，使 此种抗生素抗性消失，重组体转化的细菌不能在含有 这种

14、抗生素的培养基中生长。 a.构建重组体时，保留了抗性基因活性，所转化的细胞 就能在含此种抗生素的培养基中生长,未转化的细胞 则不能生长。 44 (插入失活法) 抗生素抗性筛选 45 （2） -半乳糖苷酶系统筛选 46 47 （二）根据重组子结构特征进行筛选的方法 （1）快速裂解菌落并鉴定分子大小 （2）内切酶酶切图谱鉴定 （3）分子杂交 （4）PCR （5）核酸序列测定 48 原 位 杂 交 49 6、外源基因的表达与分离纯化 （一） 原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用） 利用原核细胞（大肠杆菌为主）作受体细胞，经培养 、诱导表达外源目的基因。 50 （二）真核表达体系（酵母、昆虫、哺乳类动物细胞） 利用真核细胞作为受体细胞，诱导表达外源基因 51 （1）分离：提取和获得目的基因和载体 （2）切割：分别对目的基因和载体DNA 酶切； （3）连接：目的基因与载体连接，形成 新的重组 DNA分子； （4）转化：用重组DNA分子转化受体细 胞； （5）筛选：筛选转化成功的细胞克隆 （6）表达：培养获得外源基因的细胞或 生物体，获得所需的遗传性 状或表达出所需要的产物。 小结： 52 第六节 重组DNA技术的在医学上的应用 （自学） 53 谢 谢 ！