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1、酶联免疫吸附反应 (Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA),什么是 酶联免疫分析技术,ELISA的基本原理和方法,ELISA的种类和变化,ELISA的特点,ELISA的应用实例,一、基本原理 是利用抗原抗体进行的检测技术。即利用制备好的特异抗原或抗体作为试剂，以检测标本中的相应抗体或抗原。,在这种测定方法中有3种必要的试剂： 固相的抗原或抗体（免疫吸附剂） 酶标记的抗原或抗体（标记物） 酶作用的底物（显色剂）,ELISA原理,使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性 使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活
2、性，又保留酶的活性 结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关,其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。 这种有色产物可用肉眼、光学显微镜、电子显微镜观察，也可以用分光光度计（酶标仪）加以测定。 其方法简单，方便讯速，特异性强。,二、酶及其底物 酶结合物是酶与抗体或抗原, 半抗原在交联剂作用下联结的产物。是ELISA成败的关键试剂，它不仅具有抗体抗原特异的免疫反应，还具有酶促反应，显示出生物放大作用，但不同的酶选用不同的底物 ，将得到不同的颜色反应.,ELISA的种类和变化,（一）双抗体夹
3、心法 （二）间接法 （三）竞争法 （四）双位点一步法 （五）捕获法测IgM抗体 （六）应用亲和素和生物素的ELISA,（一）双抗体夹心法,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,双抗体夹心法（HBsAg、HBeAg等）示意图,1.将抗体包被在固相载体上。,2.如样品中含有抗原，则结合 为抗原抗体复合物。,3.再加入酶标记抗体，则结合 为抗体-抗原-酶标记抗体复合 物。,4.酶催化底物并显色。,获得待分析物的未标定抗体,将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体,洗涤除去未结合的 抗体及杂质,加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点,洗涤并除去未结合的封闭蛋白,加受检标本（抗原）形成 固相
4、抗体抗原复合物,洗涤除去其他 未结合的物质,加酶标抗体生成 抗体待测抗原酶标记抗体 的复合物,彻底洗涤 未结合的 酶标抗体,加底物进行 酶催化反应,根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定,双抗体夹心法测抗原,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。,（1）双抗体夹心法测定抗原 A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量抗原量。,双抗原夹心法（抗-HBs等）示意图,1.将抗原包被在固相载体上。,2.如样
5、品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。,3.再加入酶标记抗原，则结合 为抗原-抗体-酶标记抗原复合 物。,4.酶催化底物并显色。,双抗原夹心法测抗体,用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。,间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。,（二）间接法,1.将抗原包被在固相载体上。,2.如样品中含有抗体，则结合 为抗原抗体复合物。,3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗
6、原-抗体-酶标记抗抗体复合物。,4.酶催化底物并显色。,间接法（抗-HCV等）示意图,间接法测抗体,传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。,包被固相载体: 用已知抗原包被 固相载体,加待检标本: 使相应抗体与固相抗原结合 洗涤，除去无关的物质,加酶标抗抗体: 与固相载体上抗原抗体 复合物结合；洗涤，除去 未结合的酶标抗抗体,加底物 显色,根据颜色反应的程度进行 该抗原的定性或定量测定,（三）竞争法,此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。,用已知特异性 抗体包被 固相载体,测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞
7、争结合,对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合,分别洗涤 除去未结合 的成分,加底物显色,分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量,（3）竞争法测定抗原 A. 将抗体吸附在固相载体表面; B. 加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。,对照管由于只加酶标抗原，与固相抗体充分结合，故分解底物显色深；测定管的显色程度则随待测抗原和酶标抗原与固相抗体竞争结合的结果而异。如待测抗原量多，竞争性地抑制酶标抗原与固相抗体结合，使固相上结合的酶标抗原量减少。因此，加入底物后显色反应较弱
8、。,放射免疫测定法(Radioimmunoassaly,RIA),应用同位素标记技术来检测抗原抗体反应的高灵敏度方法。 此法兼有放射性同位素标记物所显示的高灵敏度（可达到 ng和pg水平）和血清学反应的高特异性优点。,发光免疫测定法(Luminescent immunoassay),将化学发光反应与免疫测定法结合起来的新型技术。 常用的发光试剂有鲁米诺（luminol)和光泽精(lucigenin)。,一：灵敏性 该测定法的灵敏度来自作为报告集团的酶。众所周知, 酶是一种有机催化剂，很少量的酶即可诱导大量的催化反应 ，产生可供观察的显色反应现象。因此该体系常被称为酶放大体系。 ELISA实现了
9、在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在微克、甚至纳克水平上对其进行定量。 例如，在测定血清中某一物质的含量时，化学比色法的敏感度为mg/ml水平，酶反应测定法的敏感度约为510g/ml 。,ELISA的特点,二：特异性 其特异性来自抗体或抗原的选择性。抗原抗体的结合实质上只发生在抗原的抗原决定簇与抗体的抗原结合位点之间。由于两者在化学结构和空间构型上呈互补关系，所以抗原抗体反应具有高度的特异性。,ELISA的试剂(A、B、C三部分),ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。 （1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）； （2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；
10、（3）酶的底物； （4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品； （5）结合物及标本的稀释液； （6）洗涤液； （7）酶反应终止液,ELISA的试剂准备A,固相载体 聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。 聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。 良好的ELISA板应该是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间、同一板各孔之间性能相近。,包被的方式,将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的
11、作用。这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。,不易吸附的非蛋白质抗原可用间接包被的抗原经固相抗体的亲和层析作用，包被在固相上的抗原纯度大大提高，因此含杂质较多的抗原也可采用捕获包被法。 亲和素生物素 即用亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。 脂类物质无法与固相载体结合，可将其在有机溶剂（例如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。 优点：试验的特异性、敏感性均由此得以
12、改善，重复性亦佳。抗原用量少，仅为直接包被的1/10乃至于/100。,包被用抗原： 天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇，纯度高，特异性也高，但由于分子量太小，往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附，间接地结合到固相载体表面。,包被用抗体,IgG对聚苯乙烯有强吸附力，其联结发生在Fc段上，抗体结合点暴露于外。 取材于抗血清或含单克隆抗体的培养液.须除去杂抗体后才能用于ELISA，以保证试验的特异性。 腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，因此不需要作吸收层析处理，直接包被。在某些情况下，用多种单
13、抗混合包被，可取得更好的效果。,包被的条件,pH9.6碳酸盐缓冲液 pH7.2的磷酸盐缓冲液 pH7-8的Tris-HCL缓冲液。 加入包被液后，在4-8冰箱中放置过夜，37中保温2小时。包被浓度随载体和包被物的性质可有很大的变化，每批材料需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为10ng/ml-20ug/ml。,封 闭,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。 常用封闭剂：0.05%-0.5%的BSA; 10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉,比较价廉，可以
14、高浓度使用（5%）。 所有的ELISA固相均需封闭？,洗涤液 在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。,ELISA的试剂准备B,结合物,即酶标记的抗体（或抗原）是ELISA中关键的试剂 1 酶的催化活性 2 抗体（或抗原）的免疫活性 3 含有或少含有游离的抗体（或抗原） 4 结合物尚要有良好的稳定性。,结合物用的抗原和抗体,制备结合物时所用纯度较高的IgG，以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体，这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性，可以在高稀释度进行反应，实验结果本底浅淡。在ELISA中用酶标抗原的模式不多，总的要求是抗原必须是高纯度的。,酶,纯度
15、高，催化反应的转化率高，专一性强，性质稳定，来源丰富，价格不贵，受检标本中不存在相同的酶。 酶结合物保留活性部分和催化能力，底物易于制备和保存，价格低廉，有色产物易于测定等。 在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，-D-半乳糖苷酶和脲酶等。 HRP是一种糖蛋白，含糖量约为18%，分子量为44000，是一种复合酶，由主酶（酶蛋白）和辅基（亚铁血红素）结合而成，是一种卟啉蛋白质。,结合物的制备,酶标记抗体的制备方法主要有两种，即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法。,（1）戊二醛交联法：戊二醛是一种双功能团试剂，可使酶与蛋白质的氨基通过它而联结。有效（结合率达60%-70%）和重复性好。 交联反应是
16、随机的，结合物的大小也不均一，酶与酶，抗体与抗体之间也有可能交联，影响效果。 （2）过碘酸氧化法：适用含糖量较高的酶。过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼，可与蛋白质上的氨基形成chiff氏碱而 结合。简便有效.,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定。但游离的抗体则会与酶标抗体竞争相应的固相抗原，因此制备的酶结合物应予纯化，去除游离的酶和抗体后用于检测，效果更好。 制得结合物，最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。,结合物的保存,酶和抗体均为生物活性物质，易失活。高浓度较为稳
17、定，冻干后可在普通冰箱中保存一年左右。结合物溶液中加入等体积的甘油，加入蛋白保护剂。另外再加入抗生素（例如庆大霉素）和防腐剂（HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠）。,结合物的稀释液,用于稀释高浓度的结合物以配成工作液。为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上：0.1%牛血清白蛋白， 0.05%吐温20 。试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液，使用时不需再行稀释，在4-8保存期可达6个月。,试剂准备 C 酶的底物,酶的底物,HRP的底物,OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。,E,TMB经HRP作用后共产物
18、显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。 HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。,AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。,酶反应终止
19、液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。,对照设定,阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。 加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。,参考标准品,定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的4-5个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防
20、腐剂的缓冲液中.,阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如HBsAg检测的阴性对照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是阴性。,5 标本的采取和保存,体液、分泌物和排泄物等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。 以血清标本为例：血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份同血清。血浆和血清可同等应用。 血清标本应避免溶血：红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，可能会增加非特异性显色。,加样:,在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,基
21、本操作注意事项,保温,抗原抗体完成反应的保温过程称为温育(incubation)。 ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育？ 温育常采用的温度有43、37、室温和4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。,保温方式：ELISA仪器附有特制的电热块，水浴。 若用保温箱：ELISA板放在湿盒内，在盒底垫湿的纱布，最后将ELISA板放在湿纱布上。反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。 室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25，但具体操作时可根据说
22、明书的要求控制温育。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。,洗涤,洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。 ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。,洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：,（1）流水冲洗式 流水冲洗法最初用于小珠载体的洗涤，洗涤液
23、为蒸馏水，自来水。洗涤效果更为彻底，且也简便、快速。已有实验表明，流水冲洗式同样适用于微量滴定板的洗涤。让水流冲击板孔表面，洗涤效果更佳。,（2）浸泡式 微量滴定板多采用。洗涤液为非离子型洗涤剂的中性缓冲液。聚苯乙烯载体与蛋白质的结合是疏水性的，非离子型洗涤剂既含疏水基团，也含亲水基团，使蛋白质回复到水溶液状态，从而脱离固相载体。,显色,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。 TMB受光照的影响不大，可在室温中置于操作台上，边反应观察结果。但为保证实验结
24、果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB经HRP作用后，约40分钟显色达顶峰，随即逐渐减弱，至2小时后即可完全消退至无色。,比色,拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。 以蒸馏水校零点，测读底物孔（未经任何反应仅加底物液的孔）和空白孔（以生理盐水或稀释液代替标本作全过程的孔），以记录本次试验的试剂状况。其后可用空白孔以蒸馏水校零点，以上各孔的吸光度需减去空白孔的吸光度，然后进行计算。 结果以光密度（oplical density，OD），现按规定用吸光度（absorbence，A），两者含义相同。通常的表示方法是，将吸收波长写于A字母的右下角，如OPD的吸收波长为492nm，
25、表示方法为“A492nm“或“OD492nm“。,酶标比色仪,酶标比色仪简称酶标仪，通常指测读ELISA光度计。针对固相载体形式的不同，各有特制的适用于板、珠和小试管的设计。酶标仪的主要性能指标有：测读速度、读数的准确性、重复性、精确度和可测范围、线性等等。优良的酶标仪的读数一般可精确到0.001，准确性为1%，重复性达0.5%。 操作时室温宜在15-30，使用前先预热仪器15-30分钟，测读结果更稳定。测读A值时，要选用产物的敏感吸收峰，如OPD用492nm波长。有的酶标仪可用双波长式测读。 各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书。,6 结果判断,6.1 定性测定,定性测定的结果判断
26、作出“有”或“无”的回答，分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中，将标本作一系列稀释后进行试验，呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低，可以判断标本反应性的强弱，这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。 在间接法和夹心法ELSIA中，阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反，阴性孔呈色深于阳性孔。两类反应的结果判断方法不同，分述于下。,A.阳性判定值： （cut-off value）一般为阴性对照A值加上一个特定的常数(0.05)，以此作为判断结果阳性或阴性的标准。,B.标本/阴性对照比值：在实验条件（包括试剂）较难保证恒定的情况下，这种判断法较
27、为合适。在得出标本（S）和阴性对照（N）的A值后，计算S/N值。,间接法和夹心法,（2）竞争法,因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异，一般均用比色计测定，读出S、P和N的吸光值。 a. 阳性判定值法 阴性判定值=0.4NCX+0.6PCX 阳性 A阳性判定值 阴性 A阳性判定值 b. 抑制率法 抑制率（%）= （阴性对照A值-标本A值）100%/阴性对照 阳性 抑制率50%为 阴性 50%,定量测定,ELSIA操作步骤复杂，影响反应因素较多，特别是固相载体的包被难达到各个体之间的一致，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。 测定大分子量物
28、质的夹心法ELISA，标准曲线的范围一般较宽，曲线的值逐点连接，所得曲线一般呈S形，其头、尾部曲线趋于平坦，中央较呈直线的部分是最理想的检测区域。,4. ELISA的操作要点,严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证ELISA必要条件。 严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。,ELISA应用实例,饲料中盐酸克伦特罗的测定 饲料中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 简曲霉毒素 ） 饲料中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌 ）,甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析,ELISA在饲料安全检测中的应用,ELISA用于农药残留的检测,河豚毒素,植物毒素如罌粟碱、吗啡、藻类毒素,苯并芘,主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。,农药的检测：,ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒,ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体,ELISA在疾病诊断中的作用,ELISA法检测幽门螺杆菌抗体,ELISA试剂盒商业资讯,ELISA试剂盒,酶联免疫,谢谢大家,