动物生化第九章核酸的生物学功能1.ppt

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1、第九章 核酸的生物学功 能 讲授内容 第一节 DNA的生物合成 第二节 RNA的生物合成 第三节 RNA催化活性的发现 第四节 蛋白质的生物合成 第五节 蛋白质的到位 第六节 中心法则 第七节 基因表达的调控 第八节 分子生物学技术 教学目标 v了解DNA复制的一般过程，以及原核细胞和真核细 胞DNA合成的异同 v了解PCR有选择扩增DNA的原理 v了解RNA合成涉及的起始、延伸和终止三个过程 v掌握核酶的概念 v掌握蛋白质合成的一般过程 v掌握乳糖操纵子模型 v了解几种分子生物学技术过程及原理 第一节 DNA的生物合成 一、 DNA的复制 vWatson和Crick在提出DNA双螺旋结构模型

2、推测 DNA在复制时首先两条链之间的氢键断裂，两条链分 开 然后以每一条链分别做模板各自合成一条新的DNA链 这样新合成的子代DNA分子中一条链来自亲代DNA， 另一条链是新合成的，这种复制方式为半保留复制 半 保 留 复 制 A=T G=C DNA合成的同位素示踪实验 1958，Meselson和Stahl 大肠杆菌 15NH4CI为唯一氮 源的培养液中生长若干代 被15N标记的大肠杆菌转入 14NH4CI为唯一氮源的培养液 中 完成第一代和第二代繁殖时 ， 分离DNA，密度梯度超速离心 被15N标记的亲代双链DNA（ 记作15N/15N）密度大，在下部 ；14N/14N密度小，在上部； 1

3、5N/14N在15N/15N和14N/14N之间 （一） DNA的半保留复制 （二）DNA复制开始于特定的 起点 v复制是从DNA分子上的特定部位开始的， 这一部位叫原点 （origin） v从原点开始同时向DNA链的两个方向进行 ，结果形成一个分叉，称为复制叉（fork） 原核生物与真核生物DNA合成区别 v大肠杆菌只有一 个复制原点，Q 形复制，速率 1700bp/s v高等生物有多个 复制点，速率只 有50bp/s DNADNA的复制总是由的复制总是由55向向3 3 方向进行方向进行 前导链前导链(leading strand)(leading strand) 以以3535方向的母链为方

4、向的母链为 模板，连续复制合成的模板，连续复制合成的 一条一条5353方向的链方向的链 随后链随后链 另一条母链另一条母链DNADNA是是 5353方向，它作为模板方向，它作为模板 时，复制合成许多条不时，复制合成许多条不 连续的连续的5353方向的短链方向的短链 （三） DNA复制中一股链是不连续合成 DNA复制的过程 （四）DNA复制相关的酶和蛋白 质 （1） DNA聚合酶 vDNA聚合酶I是一个模板指导酶 需要打开的DNA单链作为模板才能合成子链 此酶催化的底物必须是脱氧的核苷5-三磷酸（dATP、 dGTP、dTTP和dCTP） vDNA聚合酶 需要引物 DNA聚合酶只能将脱氧核苷酸加

5、于已存在的DNA或RNA链 的3-羟基上，缺少则不能合成 vDNA聚合酶还具有水解作用 DNA聚合酶I是一个35核酸外切酶，又是53核酸外切 酶。这两种酶活性对DNA的复制都是十分重要的 由DNA聚合酶催化的链延长反应 2引物酶 v复制合成先导链或随后链冈崎片段的引物 是一段RNA（5-10个核苷酸） v这段RNA由一种特异的RNA聚合酶合成， 此酶称为引物酶（Primerase）。 引物及引物酶的作用 v已知DNA聚合酶具有35的外切作用以校对复制中的错误核 苷酸。这就决定了它不能从头开始合成。 v因此先合成一段低忠实性的多核苷酸来开始DNA的合成，并以 核糖核苷酸来标记是“暂时”的。 v这

6、种高度精确的安排增加了DNA复制的复杂性，却保证了复制 的忠实性。 v已知复制的误差率仅为十亿分之一至百亿分之一，即复制十亿 到一百亿个碱基才可能出一个差错。 3.DNA连接酶 DNA聚合酶能将脱氧核苷酸加到引物 RNA链上并延长，但不能催化两条DNA单 链连接起来或把单条DNA链闭合起来。 二、DNA的损伤和修复 v保证DNA分子的完整性对于生物是至关重要的 v在几亿年进化的过程中产生了对复制过程中偶然 发生的错误，进行校正的高效“校正”系统及由于 客观因素造成的DNA损伤进行修复的系统。 （一） DNA的损伤 v某些化学、物理的因素可引起细胞DNA的损伤（ 化学结构发生改变） 化学因素种类

7、繁多，机制也很复杂； 物理因素中紫外线的作用机制研究得比较清楚。例如 形成胸腺嘧啶二聚体。 此外，DNA的损伤还有碱基可能改变或丢失、骨架中 的磷酸二酯键可能断裂，螺旋链可能形成交联等。 胸腺嘧啶二聚体 v紫外线引起DNA分子中同一条链上相邻的两个嘧啶核苷酸 以共价键连接生成环丁烷结构，即嘧啶二聚体。 v最易见的是胸腺嘧啶二聚体。此种二聚体不能容纳在双螺 旋结构中，它不能与互补链上的腺嘌呤形成氢键配对，影 响DNA的复制和基因表达。 （二） 损伤修复系统 v修复保护DNA的正常功能是非常重要的 v不论物理因素或化学因素所造成的损伤，只要DNA结构 发生改变，就能被修复酶识别，而把不正常的部分切

8、除 光诱导的修复（光修复） 不依赖光的修复（暗修复） v在高等动物体内暗修复代替了光修复。 光修复 v光修复也称光复活 它是由可见光（300-400nm）激活光复活酶，该酶能 分解胸腺嘧啶二聚体。 已从细菌和动物的细胞中分裂出一种光复活酶。 哺乳动物和人体内缺乏此酶。 暗修复 暗修复通过三种不同的机理来完成修复 ： 1切除修复（excison repair） 2重组修复（recombinational repair ） 3SOS修复（SOS repair） 切 除 修 复 2重组修复 v重组修复是一种复制后 修复。 这种修复中含嘧啶二 聚体的DNA片段仍可 进行复制，但子链中 在损伤的对应部位

9、出 现缺口。 复制后通过分子内重 组或称为姐妹链交换 （sister-strand exchange），从完 整的亲代链上把相应 碱基顺序的片段移至 子代链缺口处，使之 成为完整的分子。 亲链上的缺口由聚合 酶I和连接酶填补完整 ，这就称为重组修复 。 重组修复的结 果 v在重组修复过程中亲代链上的嘧啶二聚体并未消除 ，因此在进行第二次复制时子代链中仍会出现缺口 ，还需通过重组修复来弥补。 v但随着复制的不断进行，代数增多之后，虽然亲代 链中的嘧啶二聚体仍然存在，而损伤的这一条DNA 链却逐渐被稀释，最后对正常生理过程没有影响， 损伤也就得到了修复。 3SOS修复 v这种修复是允许子链DNA复

10、制合成时越过亲链上受损伤 的片段而不形成缺口，称为旁路系统（bypass system ）。 v这种修复以牺牲复制的忠实性为代价。 例如修复嘧啶二聚体时，SOS系统被激活后，就沿复制叉前进 合成子链，但在损伤对应部位随机放上两个腺嘌呤或其它错误核 苷酸，子链虽合成但可能含有碱基错误。 vSOS修复的详细机理还不十分清楚。 三、RNA指导下的DNA合成 v20世纪70年代从一些含RNA的肿瘤病毒如鸟类成髓细 胞白血病病毒和劳氏肉瘤病毒中分离到一种独特的 RNA指导的RNA聚合酶 v由于它以RNA为模板合成DNA，故此称为反转录酶（ reverse transcriptase） 反转录 酶 v反转

11、录酶以病毒RNA为模板，在引物参与下以四种dNTP为 底物，按53方向催化合成一条与模板RNA互补的RNA- DNA杂交链，其中的DNA链称为互补DNA链（cDNA）。 然后再以新合成的RNA链为模板，合成另一条互补的DNA 链，形成双链的DNA分子。 v新合成的双链DNA分子可以进入宿主细胞核，并整合到宿 主的DNA中，随宿主DNA一起复制传递给子代细胞。 v在某些条件下此潜伏的DNA可以活跃起来转录出病毒RNA 而使病毒繁殖。在另外一些条件下它也可以引起宿主细胞发 生癌变。 逆转录病毒的生活周期 四、多聚酶链式反应（PCR） 多聚酶链式反应（PCR， Polymerase chain re

12、action），是20世 纪80年代末发展起来的一种快速的DNA特 定片段体外合成扩增的方法。 PCR反应的步骤 在微量离心管中，加入适量的缓冲液，微量的模板DNA，人工合成的 两个DNA引物，四种脱氧单核苷酸（dNTP），一种耐热的多聚酶和 Mg2+。 将上述溶液加热，使模板DNA在高温下（如95）变性，双链解开为 两条单链； 然后降低反应温度，使两条引物在低温下（37）分别与两条模板互 补退火，形成局部双链； 再升高反应温度至中温（72），此时多聚酶以dNTP为原料，以两 引物为复制的起点，在两条模板上合成新的DNA子链。 如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段 。

13、PCR反应的结果 v以三次改变温度为一个循环，每一次循环就使欲扩增的 DNA区段的拷贝数放大一倍 v即第一次循环，每条模板双链DNA变为2条；第二次循环 ，则变为4条；第三次循环，变成8条以几何级数扩增 下去。 v一般样品经30次循环最终使特定DNA片段放大了数百万 倍。 PCR的特点 （1）对DNA模板要求不高，纯度要求不严，用量很低， DNA分子量的长度仅为几百个bp，只要含有未损伤的需要 扩增的片段即可。 （2）引物设计十分重要，它决定了PCR扩增片段的大小及特 异性。引物的设计是按需要及引物设计原则进行的。现在 已有DNA合成仪，设计好的引物能很快合成。 （3） 需要一个耐热的DNA聚

14、合酶。发现了TaqDNA聚合酶 ，PCR才进入实用阶段。PCR技术现已成为分子生物学、 医学、生物工程、法医学及考古学等领域不可缺少的工具 。 PCR技术的应用 PCR技术可以广泛应用于科研和实 际检测中，用于DNA研究、序列分析、 测定基因表达，从cDNA可放大特定克 隆、构建基因图、进化分析、生物证据 分析和医学研究与临床检验等。 五、DNA核苷酸顺序测定 DNA顺序测定技术有A.Maxam和 W.Gilbert提出的化学裂解法和1978年 F.Sanger提出的双脱氧核苷酸末端终 止法。以Sanger法最适用。 Sanger法的程序 vSanger法最突出的特点是在PCR反应中加入一种2

15、，3- 二脱氧核苷三磷酸（ddNTP），整个测定的程序如下： 将被测DNA制成单链模板。分别加入4个反应管中。并在每个管中 加入引物、DNA聚合酶和4种dNTP（其中一种为32P标记）。然后 在4个管中分别加入ddTTP、ddCTP、ddGTP和ddATP。然后进 行保温反应。 由于双脱氧的ddNTP比正常的dNTP少了3-羟基，当它在DNA聚 合酶作用下掺入到正在延伸的DNA链时，因ddNTP不含3-羟基， 于是就阻止了其它dNTP的继续掺入，起了特异性终止剂的作用。 2，3-二脱氧核苷三磷酸结构图 Sanger法的结果分析 v反应结束后在4个管中分别形成一些全部具有相同5-引物 端、和分别

16、以ddT、ddC、ddG、ddA 残基为3-端结尾的 一系列长短不一的混合物。 v每种混合物经变性聚丙烯酰胺电泳分离及放射自显影，可 见4种混合物形成不同的电泳迁移条带。每一条带都代表 着一段以ddNTP终止的片段。 v只要按照电泳条带出现的先后次序即可读出被测DNA的顺 序。 第二节 RNA的生物合成 一、转 录 v整个生物体所有的遗传信息，都编码在每个细胞的 DNA分子中。 vDNA是通过转录（transcription），将遗传信息 转移到RNA分子上。 v转录就是以DNA为模板合成RNA的过程。 （一） DNA的大小与基因 v在整个DNA的分子上分布着许多特殊的片段。在这些片 段中有些

17、是为一种或几种蛋白质的全部氨基酸编码的核 苷酸顺序，称为基因（gene），也称为顺反子或多顺反 子。 v通常也把这些编码蛋白质的基因片段称为结构基因。在 DNA分子上还有些片段是为rRNA和tRNA编码的核苷酸 ，这些片段有时也称为基因。 v有些DNA片段，不编码基因而是一些不被转录的调控区 ，它们具有主宰基因转录和表达的功能，是基因不可缺 少的部分。 重复基因 vDNA中有些基因是重复的，称为重复基因。 原核生物中的重复基因数较少，真核生物中重复基因 则很丰富 如酵母的tRNA基因为每一种不同的tRNA编码的基因 平均达10个重复基因 v这种多重复基因的现象，是为适应细胞的分裂 和增殖的需要

18、。 基因重叠 vDNA分子中的基因的组合也很不相同 v在一些病毒中存在基因重叠的现象，如大肠杆菌噬菌体 174DNA序列中基因排列 。 不连续基因 v真核生物的许多基因是不连续的，即一个完整的基因被 一个或更多个插入的片段所间隔。 v把这些插入而不编码的序列称为内含子（intron），把 被间隔的编码蛋白质的基因部分称为外显子（exno）。 v转录出来的所有RNA都必须经过加工，除去其中的内含 子并经复杂的修饰才能成为成熟的各种RNA，其中的 mRNA才能成为合成蛋白质的模板。 （二）双链DNA中仅有一段被转录 v基因中仅一股链被转录。现在把被转录的一股 链称为模板链，另一股链称为编码链。 v

19、mRNA与模板链是互补的。mRNA的核苷酸顺 序则与编码链完全相同，只是其中以U代替了T 。因此，mRNA的遗传信息与编码链相同，代 表了基因的编码顺序。 （三）RNA聚合酶 v基因的转录是由RNA聚合酶（RNA polymerase）催化 。 RNA聚合酶催化底物合成时是形成磷酸二酯键。 合成的方向是53：即RNA聚合酶是沿着模板链的3 5方向 移动。 vRNA聚合酶的条件 模板，双链DNA或单链DNA均可作模板。 活化的底物，需要4种三磷酸的核苷酸：ATP，GTP、UTP及 CTP为反应底物。 二价金属离子，主要是Mg2+和Mn2+。 RNA聚合酶的结构组成 v大肠杆菌的RNA聚合酶是一个

20、非常大的（450KD）极其复杂的酶 分子。它由4种亚基组成。 整个酶的亚基组成是2，称为全酶。 没有亚基的RNA聚合酶称为核心酶（2）。 vRNA聚合酶中各亚基的作用 亚基激活RNA聚合酶使之识别转录起始点的序列，并参与解开DNA 双链，找到模板链。当转录开始合成RNA链后，亚基就从全酶中解离 下来。解离下来的亚基可与另一核心酶连接，开始另一轮的转录。 核心酶继续对DNA模板转录。 全酶的作用是识别起始，而核心酶的作用是延长及辨认转录终止。 （四）DNA模板上的启动子 v概念 转录起始于RNA聚合酶结合在被转录的DNA区段上。结合的特定 部位称为启动子（promoter）。 它是20至200个

21、碱基的特定顺序。 v习惯上将+1以下的转录方向称“下游”，-1以上称“上游”， 启动子在上游区。 v现在发现原核生物的启动子顺序中存在两个共同的顺序， 即-10顺序，也称为Pribnow顺序（pribnow box）和-35 顺序 。 启动子中不同顺序的作用 v-10顺序 -10的基本顺序是TATAATG。 -10顺序被看作是双螺旋打开形成开放启动复合物的 区域。 v-35顺序 典型的情况下含有9个碱基，被认为是酶结合的起始 部位。 启动子常以单位时间内合成RNA分子数的多少分为 强启动子和弱启动子。据认为强弱之间的区别就存在 于-35的结构中。 启动子处的反应 v聚合酶含有两个核苷酸结合位点

22、，称为起始部位和 延伸部位。起始部位结合三磷酸嘌呤核苷酸ATP或 GTP。 v转录与复制不同，不需要引物，因而合成的RNA 第一个核苷酸常常是pppA或pppG。 （五）延长在转录鼓泡上进 行 v转录泡是一个含有核心酶、DNA和新生RNA的区域，在这个区域 里含有一段解链的DNA“泡”，所以称为转录泡（transcription bubble）。 v在“泡”里新合成的RNA与模板DNA链形成一杂交的双螺旋。此段 双螺旋长约12bp，相当于A型DNA螺旋的一转。 v在“泡”里核心酶始终与DNA的另一链（编码链）结合，使DNA中 约有17个bp被解开。延长速率大约是每秒钟50个核苷酸，转录鼓 泡移

23、动170nm的距离。 RNA-DNA杂交链的长度 v在RNA聚合酶沿着DNA模板移 动的整个过程中形成的RNA- DNA杂交链的长度及DNA未解 开的区域长度均保持不变。 v杂交双链12bp的长度恰好短于 双螺旋完整的一转，当形成完整 的一转前，RNA因弯曲很厉害 即离开了DNA模板，防止了 RNA 5-末端与DNA相互缠绕打 结。 转录的错误频率 vRNA聚合酶没有核酸外切酶活性，不能对进入RNA链的 核苷酸进行校正，所以转录的错误频率是每104或105中 有一个错误，是DNA复制中错误的105倍。 v这种准确性虽很低，但由于RNA的转录产物很多，极少 数有缺陷的转录产物大概不会产生有害的影

24、响。 （六）转录终止 v转录有终止点，转录终止 出现在DNA分子内特定的 碱基顺序上。 v细菌及病毒DNA的终止顺 序分析证明，它们有明显 的特点 。 富含GC，转录产物极易形 成二重对称性（ dyadsymmetry）结构， 紧接GC之后有一串A 。 按此模板转录出来的RNA 极易自身互补，形成发夹 状结构 新生的RNA链却以几个U 残基而结束。当RNA聚合 酶遇到这种结构特点时就 会停止下来。 二、RNA转录后的加工成熟 1.原核生物的mRNA成熟过程 2.原核生物的tRNA成熟过程 3.原核生物的rRNA成熟过程 1. 原核生物的mRNA成熟过程 v原核生物的mRNA通常不用修饰，因生成

25、的 mRNA高度不稳定，当它们的3末端合成尚未完 成时，mRNA的5末端已经开始降解。 vmRNA的转录和翻译是同步发生的，mRNA仅仅 合成一部分时，翻译就开始了，翻译结束， mRNA就开始降解。 2.原核生物的tRNA成熟过程 vtRNA的成熟过程较为复杂，包括切割与核苷酸的修饰 。 v多数tRNA的前体约比成熟分子大20，在5和3端都含 有多余的顺序。 v这些多余顺序由特异的核酸酶RNase P及Rnase Q（或 RNase）分别在5和3端进行切割 。 稀有碱基 v稀有碱基的形成是在转录后与切割同时完成的。 v碱基的修饰是由酶催化的如甲基化酶，该酶能将 甲基引入tRNA核苷酸的不同位置

26、。 3. 原核生物的rRNA成熟过程 v大肠杆菌的rRNA是由三种rRNA丛集在一起形成一个转录 单位，彼此由间隙区（内含子）分隔开来。 v在间隙区中还存在着tRNA。这些rRNA和tRNA基因同时 转录，形成一个长的RNA分子。 v在原核生物中，加工修饰与转录是同时进行的，因此在细 胞内从来不存在完整的前体分子。 由由16sRNA16sRNA、tRNAtRNA谷、谷、23sRNA23sRNA、5sRNA5sRNA和和tRNAtRNA色以色以 及在远端的另一个及在远端的另一个tRNAtRNA天冬等组成天冬等组成 三、真核生物中的转录 真核生物中的转录比原核生物复 杂，其主要差别如下： 1真核生

27、物中转录与翻译处在不 同的区域 2RNA聚合酶不相同 3启动子不同 4转录后RNA加工修饰不同 1真核生物中转录与翻译处在不 同的区域 v在原核生物中mRNA的转录与翻译几乎是同 步发生的。而真核生物，转录是发生在细胞 核内，翻译则在核外进行。转录合成的RNA 必须穿出核膜才发挥作用。 v这种转录和翻译在空间上和时间上的分隔使 得真核生物能够以精巧的方式进行RNA的加 工、修饰、拼接，增强了真核生物对基因转 录和翻译的调控。 2RNA聚合酶不相同 v原核生物中RNA由一种聚合酶合成。 v在真核生物中则有三种类型的RNA聚合酶。 3启动子不同 v已知真核生物的启动子与原核生物的很相似，也位 于转

28、录起始部位的5端，但存在着几个重要的区域 。 如距起始部位最近的一个是在-25处，称为TATA盒（ Hogness盒），与原核的-10顺序（TATAAT）极为相似 。它是启动子活性所必需的。 此外在-40和-110之间还有更多的影响启动的碱基。具体的 生物学功能尚在研究中。 4转录后RNA加工修饰不同 （1）mRNA加“帽子”和“尾巴”的修 饰 （2）mRNA的剪切加工 （3）rRNA 的剪切加工 （4）tRNA 的剪切加工 （1）mRNA加“帽子”和“尾巴”的修 饰 v原核生物的只有几秒钟。而且不用加工 修饰。 v真核生物mRNA分子的寿命较长，有的 可达几小时，真核生物的mRNA在5和 3

29、两个末端都要受到修饰。5末端要形 成一种称作帽子（cap）的复杂结构。 帽子 v在mRNA5末端连接 一个7-甲基的鸟苷。 v连接帽子的头两个 核苷酸的核糖也被 不同程度的甲基化 。 mRNA3末端的poly（A）结构 v在mRNA3末端则要加上一段多聚腺嘌 呤核苷酸poly（A）: （AAAAAAAAA-）的顺序，长度可 达20至200个核苷酸。 真核生物中mRNA的加“帽子”和“尾巴” 的生物学意义 v真核生物中mRNA的加“帽子”和“尾巴”的生物学意义尚不十 分清楚。 v添加帽子发生在mRNA合成起始不久，其功能也许是保护 mRNA免受核酸酶降解，以及为蛋白质合成机器（核糖体） 提供识别

30、特征。 v加“尾巴”可能增加mRNA的稳定性，并对mRNA附着于细胞 的内膜上也可能有作用。 （2）mRNA的剪切加工 v真核生物每种mRNA分子内部含有数 目变化很大的内含子。 最少的是2个，最多的例如-胶原蛋 白在转录单位中含52个内含子之多。 这些内含子广泛地分布于mRNA的前 体分子中，长短各不相同，但都比外 显子长。 v真核生物mRNA前体物的剪切加工， 包括内含子的剪除及留下的片段拼接 成成熟mRNA等过程，称为RNA剪接 （RNA Splicing）。 v剪接是在核内进行，而且是在加上“ 帽子”和接上“尾巴”之后。整个剪接 过程完成之后，5端的“帽子”和3端 的“尾巴”并不丢失。

31、 原核生物原核生物 真核生物真核生物 核不均一 RNA v在细胞内任何时候 都存在着大量正在 加工似乎无用的 RNA分子。这些分 子总称为核不均一 RNAhnRNA。 （3）rRNA 的剪切加工 v在典型动物细胞的核仁中有一段几百个拷贝的DNA顺序（核糖 体DNA或rDNA）编码18s，5.8s和28srRNA分子。5srRNA基 因位于核仁之外，处在另一个转录单位中，基因长24000个拷 贝。 v所有的rRNA转录物都需要加工，过程与原核相似，即剪切5和 3末端和切除转录物中不需要的区域。 （4）tRNA 的剪切加工 v真核生物的tRNA也是一个大转录物（tRNA前体转录物 ），这些转录物可

32、能含有一个或多个tRNA的顺序。 v成熟的tRNA也是在转录后经剪切加工而成。 第三节 催化活性RNA的发现 一、TCech的发现 1982年塞克（TCech）及其同事在用四膜 虫（Tetrahymena）研究rRNA剪接的过程中引出 了一个非常出人意料的发现。 四膜虫核糖体四膜虫核糖体RNARNA的前体长的前体长 4.6kb4.6kb，必须除去一段必须除去一段414bp414bp 的内含子，才能产生成熟的的内含子，才能产生成熟的 26srRNA26srRNA。 塞克（塞克（T TCechCech）及其同及其同 事发现只需核苷酸存在下，事发现只需核苷酸存在下， RNARNA就能剪接自身或自我剪

33、就能剪接自身或自我剪 切（切（selfself- -splicingsplicing）。即）。即 RNARNA分子本身具有高度的专分子本身具有高度的专 一性和催化活性。一性和催化活性。 其它催化活性RNA的发现 v对大肠杆菌核糖核酸酶P（Rnase P）的研究 v真核的酵母和真菌的线粒体中的发现 v对核糖体大亚基的研究 早期RNA世界 v在DNA和蛋白质出现之前，生命进化的早期存在着一个RNA 的世界。这些RNA分子集信息编码和催化功能于一身; v经过亿万年的衍变进化，开始合成蛋白质，由于蛋白质有20 种氨基酸的多侧链，比RNA的4个碱基更为多样性，于是逐 步替代RNA形成催化活性更高的酶；

34、v由RNA衍变，出现反转录开始形成DNA。由于DNA的双螺旋 比单链的RNA更稳定，因此替代RNA成为遗传信息稳定的贮 藏所，成为今天专管遗传信息编码的载体。 第四节 蛋白质的生物合成 蛋白质的生物合成概述 v生物体每个蛋白质的生物合成都受DNA的指导， 但贮存遗传信息的DNA并非蛋白质合成的直接模 板，而是转录了遗传信息的mRNA。 v以mRNA为模板合成蛋白的过程称为翻译（ translation）或称为表达（expression）。 遗传信息是如何储藏在遗传信息是如何储藏在4 4种核苷酸中的？种核苷酸中的？ 如何破译遗传密码？如何破译遗传密码？ 一、遗传密码一、遗传密码 数学家、物理学家

35、数学家、物理学家 逻辑运算或推导逻辑运算或推导 分子生物学家分子生物学家？ 遗传密码的破译遗传密码的破译 19551955年年 纽约大学纽约大学Grunberg-ManagoGrunberg-Manago用将核苷酸连接起来的酶形成用将核苷酸连接起来的酶形成RNARNA 聚合体聚合体 A A连接成多聚连接成多聚A A（polyApolyA，A-A-A-A-A-A-AA-A-A-A-A-A-A） polyCpolyC polyGpolyG polyUpolyU polyAUpolyAU 问题：什么样的核苷酸组合可以被翻译成多肽片段？问题：什么样的核苷酸组合可以被翻译成多肽片段？ 19601960年

36、德国人年德国人 3131岁岁 MattheiMatthei 和美国国家健康研究所和美国国家健康研究所 3333岁岁 的的NirenbergNirenberg 将将ATPATP和游离的氨基酸加入到从细胞中提取的核糖体、核酸和酶的混合物和游离的氨基酸加入到从细胞中提取的核糖体、核酸和酶的混合物 中在试管中合成多肽中在试管中合成多肽 问题：哪一种问题：哪一种RNARNA可促进多肽的合成？可促进多肽的合成？ 在试管中加入了在试管中加入了ATPATP、游离的氨基酸、酶和核糖体及核糖体游离的氨基酸、酶和核糖体及核糖体 RNARNA没有蛋白质的合成没有蛋白质的合成 问题：需要其他带有遗传信息的问题：需要其他

37、带有遗传信息的RNARNA？ Marianne Marianne Grunberg-ManagoGrunberg-Manago方法人工合成方法人工合成RNA RNA 加入不同的酶、核糖体、加入不同的酶、核糖体、ATPATP、氨基酸氨基酸 加入加入poly Upoly U、poly Apoly A、poly AU poly AU poly Upoly U产生了许多蛋白质产生了许多蛋白质 问题：问题： poly Upoly U主要利用了哪些氨基酸呢？主要利用了哪些氨基酸呢？ 不同的氨基酸分别加入不同的氨基酸分别加入 到到poly Upoly U试管系统中试管系统中 5 5天通宵达旦天通宵达旦 星期

38、星期 六早晨，熬红了眼的六早晨，熬红了眼的 MattheiMatthei得到了答案：得到了答案： poly Upoly U合成的肽链全部合成的肽链全部 是苯丙氨酸（是苯丙氨酸（PhePhe） 世界上破译第一个遗传世界上破译第一个遗传 密码的人密码的人 问题：几个问题：几个U U决定一个决定一个 苯丙氨酸的合成苯丙氨酸的合成？ Nirenberg Nirenberg 莫斯科莫斯科 第五届国际生物化学大会第五届国际生物化学大会 不善于推销自己不善于推销自己 小组会上小组会上 MeselsonMeselson认为非同小可认为非同小可 全体大会上重新做学术报告全体大会上重新做学术报告 问题：几个问题：

39、几个U U决定一个苯丙氨酸的合成？决定一个苯丙氨酸的合成？ NirenbergNirenberg全力组织其他遗传密码的破译全力组织其他遗传密码的破译 NirenbergNirenberg发现并定义了发现并定义了3 3 个核苷酸为一个密码子个核苷酸为一个密码子 决定一个氨基酸的翻译决定一个氨基酸的翻译 Khorana Khorana 按需要连接任意核苷酸按需要连接任意核苷酸 ACACACACACACAC ACACACACACACAC thr-histhr-his -thr-his-thr-his链链 ACAACA苏氨酸的密码子苏氨酸的密码子 CACCAC组氨酸的密码子组氨酸的密码子 1966年，

40、Nirenberg和Khorana 全部遗传密码字典 64个密码子 61个负责20种氨基酸翻译， 3个终止密码子 Nirenberg 和 Khorana 1968年 诺贝尔奖 遗传密码 v遗传密码 DNA（或mRNA）中的核苷酸序列与蛋白质中的氨基酸序 列之间的对应关系称为。 v密码子 DNA（或mRNA）上每3个核苷酸翻译成蛋白质多肽链上 的一个氨基酸,这3个核苷酸就称为密码子 （二） 遗传密码的主要特征 1.密码子高度简并 2.密码的通用性 3.遗传密码的变异性 4.重叠基因与重叠密码 二、解码系统 v氨基酸与tRNA分子的连接，也称为氨基酸的活化 v密码子一反密码子的相互作用 反密码子

41、3- X-Y-Z-5 密码子 5- X- Y- Z - 3 v摆动假说 前两个碱基对是标准型的碱基互补，以保证结合有最大限度的稳 定性，第三个碱基则要求不那么严格，可以允许结构上有小小的 波动（即摆动）。 在Holley测定的酵母tRNA Ala顺序中发现反密码子是TGC，它可 以识别丙氨酸的同义密码子GCU、GCC、GCA。 氨基酸+tRNA+ATP 氨基酰-tRNA+AMP+PPi 氨基酰氨基酰- -tRNAtRNA合成酶合成酶 三、核糖体 v核糖体（ribosome） 是蛋白质合成的主要场所。 它含有蛋白质合成中所需要的多种酶活性，能将 mRNA分子的碱基顺序翻译成氨基酸顺序。 （一）核

42、糖体的化学组成 真核生物核糖体 v真核生物的核糖体大约是80s 40s亚基 v18srRNA v约30种蛋白质 60s亚基 v5s、5.8s、28srRNA v50种蛋白质 （二）核糖体的结构与功能 v核糖体的结构至少要满足如下的部位： 容纳mRNA的部位， 结合氨基酰-tRNA的部位（称A-位点）， 结合肽基-tRNA的部位（称P-位点）， 形成肽键的部位（转肽酶中心）。 识别并结合mRNA上特异的起始部位， 能沿mRNA移动以“解读”全部信息， 在 翻译结束后肽链脱落掉下等功能 。 （三）多核糖体 蛋白质合成过程中一个mRNA的 分子上不止结合一个核糖体而是一群 核糖体，称多核糖体（pol

43、ysome） 。 多个核糖体同时翻译一个多个核糖体同时翻译一个mRNAmRNA分子分子 ，这显著提高了，这显著提高了mRNAmRNA的利用率。一条的利用率。一条 mRNAmRNA的最大利用率可达每的最大利用率可达每8080个核苷酸个核苷酸 结合一个核糖体。合成的多肽释放后，核结合一个核糖体。合成的多肽释放后，核 糖体即解离成糖体即解离成30s30s和和50s50s亚基亚基 。 四、蛋白质合成的过程 （一）翻译起始 （二）肽链延长 （三）肽链合成终止三个阶 段 （一） 翻译起始 v大肠杆菌内蛋白质合成的起始，是从核糖体小亚基30s与 fMet-tRNAfmet及一个mRNA分子起始因子参与下形成

44、 起始复合物开始。 v最终形成70s的起始复合物，完成翻译起始阶段。 fMet-tRNA fMet v大肠杆菌蛋白质合成的第一个氨基酸都是甲酰化的甲硫氨 酸，即N-甲酰甲硫氨酸（fMet）。 vMet的甲酰化是在Met-tRNAfMet合成后，由转甲酰基酶催 化，从N-9-甲酰四氢叶酸（fTHF）上将甲酰基转移到甲硫 氨酸的NH3+基上形成。但转甲酰酶不会催化组成肽链中 的甲硫氨酸甲酰化。 翻译起始信号 v作为起始密码子的AUG通常离mRNA5-末端约20 -30个碱基，在这段前导顺序中，具有一段特殊顺 序AGGAGGU，位于起始AUG之前的固定的位置 上，称为S.D序列 v核糖体小亚基30s

45、内的16srRNA3-末端有顺序5- PyACCUCCUUA-3，Py可以是任何嘧啶核苷酸 。于是这段顺序即与mRNA前导顺序中的 AGGAGGA能形成稳定的碱基对。 翻译起始信号示意图 mRNA翻译的方向 v翻译的方向是沿mRNA的53方向进行。 v所以，在大肠杆菌中，当mRNA的5端刚转录合 成后不久就与核糖体结合开始翻译。 （二）肽链延长 v蛋白质合成的肽链延长阶段包括 进位 肽键形成 移位 1进位 2肽链形成 3.移位 （三）肽链合成的终止 v当70s移位至A位出现终止密码子时，就没有氨基酰-tRNA 再进入A位点，肽链延长停止。 v终止过程是由释放因子（release factor，

46、 RF）参与下完 成的，使P位上的肽链转移至水中，形成游离肽链，同时 70s释放出50s核糖体亚基。 v此时，另一个被称为核糖体释放因子（ribosome releasing factor，RR）的成分参与使30s与mRNA分开 。 v脱去肽链的tRNA与终止因子也离开。分离后的50s、30s 又可为合成另一条肽链所用。 vv蛋白质的合成过程蛋白质的合成过程 五. 真核生物的蛋白质合成 真核生物中蛋白质合成的基本过程与原核生物中类 似。只是真核生物蛋白质合成时参与的蛋白组分较多， 有些步骤更为复杂。 六. 蛋白质的加工 v从mRNA翻译得到的蛋白质多数是没有生物活性 的初级产物。只有经翻译后的

47、加工过程才能成为 有活性的终产物。 v加工包括 修饰 折叠 蛋白质的折叠 v助折叠蛋白 酶 v二硫键异构酶加速蛋白质中形成正确的二硫键 v肽酰脯酰顺反异构酶催化肽脯氨酰之间肽键的旋转 反应，从而加速蛋白质的折叠过程 分子伴侣 v能帮助新生肽链正确组装，成熟，自身却不是终产 物分子成分的蛋白质 （二） 蛋白质的修饰 （1）N-端修饰 除去甲酰基，多数情况甲硫氨酸也被氨肽酶除去 （2）多肽链的水解切除 水解切除多余的肽段，使之折叠成为有活性的酶或蛋白质。 （3）氨基酸侧链的修饰 氨基酸侧链的修饰包括 羟化、 羧化、 甲基化、 二硫键的形成 等 （4）糖基化修饰糖 糖基化是多种多样的，可以在同一肽链

48、上的同一位点连接上不 同的寡糖，也可以在不同位点上连接寡糖。糖基化是在酶催 化下进行的。 第五节 蛋白质的到位 蛋白质到位的机制 v信号肽 除了少数蛋白外，几乎所有分泌蛋白都在N-末端含有一段信号序列（ Signal sequences）或称为信号肽 。 v信号识别蛋白（SRP） 能识别正在合成多肽并将要通过内质网膜的核糖体，与信号肽相结合，形 成SRP-信号肽-核糖体复合物，并暂时停止多肽链的合成。随即SRP将复 合体从细胞质引向内质网膜。 v停靠蛋白（ DP） 膜上SRP的受体，与复合体相结合，释放出SRP。 通过一个依赖GTP的过程，内质网膜被打开一个通道，信号肽穿过膜与膜 内另一受体SSR（SSR）相结合 核糖体上暂时停止的多肽链又恢复合成延长。这样新生的肽