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1、常用细菌鉴定技术,实验目的,掌握细菌的基本鉴定技术,细菌的基本鉴定技术,生化反应鉴定：通过观察细菌利用酶和降解糖类、醇类、脂类、蛋白质和氨基酸的能力可以了解其生化活性，从而识别和鉴定细菌。 免疫学鉴定（血清学鉴定） 编码鉴定,实验内容生化反应鉴定,（每2人一组）： 1、糖（苷、醇）利用试验：乳糖分解利用试验 2、氧化酶试验 3、过氧化氢酶试验 4、克氏双糖铁（KIA） 5、半固体（M）（这个实验已做过，本次不做） 6、吲哚试验（I） 7、尿酶试验（U）,一、糖（苷、醇）利用试验： 乳糖分解利用试验,【原理】 不同的细菌对不同的糖（苷、醇）的分解能力不同，有的分解，有的不能分解，有的分解后能产酸
2、产气，有的分解后仅能产酸，因此可以用来鉴别细菌。 以乳糖分解利用为例，乳糖发酵管中含溴甲酚紫指示剂，当细菌分解乳糖产酸，培养基pH下降，指示剂变黄色，不分解乳糖的指示剂不变色。,乳糖分解利用试验,菌种：大肠杆菌、变形杆菌 培养基：乳糖发酵管 方法： 1、取2支乳糖发酵管，用记号笔分别标记大肠杆菌和变形杆菌。 2、按细菌的液体接种法，将大肠杆菌和变形杆菌分别接种到乳糖发酵管中，放入培养箱中培养1824h。,乳糖分解利用试验,结果观察,乳糖发酵管中含溴甲酚紫指示剂，当 pH值6.8时呈紫色，pH值5.2时呈黄色，当细菌分解利用乳糖，产酸，使培养基的pH值变小，呈黄色。如细菌不能分解乳糖，则乳糖发酵
3、管仍为紫色。 接种大肠杆菌的乳糖发酵管变为黄色，接种变形杆菌的乳糖发酵管仍是紫色。说明大肠杆菌能够分解乳糖，变形杆菌不能分解乳糖。 乳糖发酵管中如果有小导管，还可以观察产气情况。大肠杆菌能够分解利用乳糖，产酸，产气，小导管中有气泡产生。,氧化酶试验,【原理】 氧化酶又称细胞色素氧化酶，能将还原型细胞色素C氧化形成水和氧化型细胞色素C，氧化型细胞色素C再使四甲基对苯二胺氧化，形成显色反应。,氧化酶试验,【试剂与器材】 1菌种 大肠埃希菌、铜绿假单胞菌 2试剂 氧化酶试剂（1%四甲基对苯二胺） 3器材 2cm2cm滤纸片、污物缸,氧化酶试验,【操作步骤】 1将滤纸片叠成四方块状。 2用滤纸片的中心
4、尖角小心刮取大肠埃希菌菌落，注意不可碰到培养基。 3轻轻展开滤纸片，刮取的菌落正好在滤纸片中心，滴加一滴1%四甲基对苯二胺。 4立刻观察菌落颜色的变化。 5同法做铜绿假单胞菌的氧化酶试验。,氧化酶试验,【结果】 滴加氧化酶试剂后铜绿假单胞菌立刻变为紫色，为氧化酶阳性。大肠埃希菌不变色，为氧化酶阴性。,氧化酶试验（左侧为铜绿假单胞菌、右侧为大肠埃希菌）,氧化酶试验,【注意事项】 1实验中的菌种要求新培养的，不宜用陈旧的培养物。 2刮取细菌时不可碰到培养基，不可用接种环等金属物品取菌。 3氧化酶试剂要新鲜配制，一般装在棕色瓶中，放在冰箱中可保存一周，时间长了易被空气氧化变色。 4结果要立刻观察，1
5、min内变色者为阳性，超过1min变色的为阴性。 5在滤纸片上滴加试剂时不要过多，以刚润湿纸片为宜，如滤纸片过湿，可能妨碍空气与细菌接触，延长反应时间，造成假阴性。,过氧化氢酶试验,【原理】 过氧化氢酶试验又称触酶试验。部分细菌含有黄素蛋白，在代谢过程中与空气中的氧发生反应，形成过氧化氢，过氧化氢对细菌有毒害作用，会破坏细胞组分，因此，细菌为保护自己，通常具有过氧化氢酶，可以催化裂解过氧化氢，形成水和氧气。,过氧化氢酶试验,【试剂与器材】 1、菌种 金黄色葡萄球菌 2、试剂 3%过氧化氢 3、器材 载玻片、无菌移液器吸头、酒精灯、火柴、超净工作台,过氧化氢酶试验,【操作步骤】 1、在载玻片中央
6、滴加一滴3%过氧化氢。 2、用无菌移液器吸头蘸取少量细菌，在3%过氧化氢中混匀。 【结果】 观察气泡的产生情况。可以看见在吸头上金黄色葡萄球菌菌苔周围，产生大量气泡，为过氧化氢酶阳性。如果菌苔周围无气泡产生，为过氧化氢酶阴性。,过氧化氢酶试验,【注意事项】 1、普通金属接种环可能与过氧化氢反应，形成气泡，造成假阳性，因此必须使用铂丝接种环或塑料、玻璃材质的工具。 2、从血液琼脂平板上挑取菌落时千万小心，不要碰到培养基，因红细胞中有过氧化氢酶，即使一点点也会造成假阳性。 3、过氧化氢试剂现配现用。,克氏双糖铁（KIA）,原理：克氏双糖铁（KIA)主要用于革兰阴性杆菌的鉴别，分解乳糖的细菌斜面为黄
7、色，分解葡萄糖的细菌底层为黄色，产生硫化氢的细菌培养基中出现黑色。此外还可以观察细菌分解葡萄糖是否产气。,克氏双糖铁（KIA）,【试剂与器材】 1、菌种 大肠埃希菌、变形杆菌 2、器材 克氏双糖铁（KIA）、接种针、酒精灯、火柴、记号笔、试管架、37恒温培养箱，超净工作台。 【操作步骤】 1取2支克氏双糖铁（KIA），用记号笔分别标记大肠埃希菌、变形杆菌。 2按细菌的斜面接种法，将大肠埃希菌、变形杆菌分别接种到相应的管中。 3放入培养箱中培养1824h。,克氏双糖铁（KIA）,结果观察：观察上部和下部的颜色变化，变黄为产酸，变红为产碱，有气泡为产气，有黑色为产硫化氢。 大肠杆菌结果：A/A,产
8、气 变形杆菌结果：K/A,产大量硫化氢。,吲哚试验,【原理】 吲哚试验又称靛基质试验。某些细菌具有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚、丙酮酸、氨。加入吲哚试剂对二甲基氨基苯甲醛，与吲哚结合，形成玫瑰色的吲哚化合物。,吲哚试验,【试剂与器材】 1菌种 大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌 2试剂 吲哚试剂（对二甲基氨基苯甲醛1g，95%乙醇95ml，浓盐酸20ml配制） 3器材 蛋白胨水培养基、接种针或接种环、酒精灯、火柴、记号笔、试管架、37恒温培养箱，超净工作台。,吲哚试验,【操作步骤】 1取2支蛋白胨水培养基，用记号笔分别标记大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌。 2按液体接种法，将2菌分别接种于蛋白胨水
9、中。 3置于37恒温培养箱中培养2448h，取出，分别滴加23滴吲哚试剂，轻摇试管，试剂浮于液面，观察颜色变化。,吲哚试验,【结果】 接种大肠埃希菌的试验管中，吲哚试剂变成玫瑰红色，为吲哚试验阳性。接种产气肠杆菌的试验管中，吲哚试剂不变色，为吲哚试验阴性。,尿酶试验（U）,【原理】 某些细菌可以产生尿酶来水解尿素，可以利用含有尿素的培养基和pH指示剂（如酚红）来检测。尿素被尿酶水解，产生氨、二氧化碳、水，使培养基变碱，酚红变为深粉红色。,尿酶试验（U）,【试剂与器材】 1、菌种 大肠埃希菌、普通变形杆菌 2、器材 尿素培养基、接种针或接种环、酒精灯、火柴、记号笔、试管架、37恒温培养箱，超净工
10、作台。,尿酶试验（U）,【操作步骤】 1、取2支尿素培养基，用记号笔分别标记大肠埃希菌和普通变形杆菌。 2、按液体接种法，将2菌分别接种于尿素培养基中。 3、置于37恒温培养箱中培养2448h，取出，观察颜色变化。,尿酶试验（U）,【结果】 接种大肠埃希菌的试验管为黄色，说明大肠埃希菌不产生尿酶，尿酶试验阴性。接种普通变形杆菌的试验管变为深粉红色，说明普通变形杆菌能产生尿酶，分解尿素，尿酶试验阳性。,实验内容生化反应鉴定,（每2人一组）： 1、糖（苷、醇）利用试验：乳糖分解利用试验（大肠杆菌、变形杆菌） 2、氧化酶试验（铜绿假单胞菌、大肠） 3、过氧化氢酶试验（金黄色葡萄球菌） 4、克氏双糖铁（KIA）（大肠杆菌、变形杆菌） 5、半固体（M）（这个实验已做过，本次不做） 6、吲哚试验（I）（大肠杆菌、肺炎克雷伯菌） 7、尿酶试验（U）（大肠杆菌、变形杆菌）,