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1、基因工程技术,曹月青 重庆大学生物工程学院,第三章 基因工程的常用载体,3,主要内容,载体的功能及特征 质粒（plasmid） 噬菌体 M13噬菌体 考斯质粒（cosmid）与噬菌粒 人造染色体载体,4,作用一：作为运载工具，将外源基因转移 到受体细胞中去。 作用二：为外源基因提供复制能力或整合 能力 作用三：为外源基因的扩增或表达提供必 要的条件,（一）载体的作用,5,作为运载体必须具备哪些条件？,1）能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。 2）高效率的进入宿主细胞 3）具多个单一限制酶切点，以便与外源基因连接。 4）具有较高的外源DNA的载装能力。 5）具有某些标记基因，便于进行筛选。 6）容
2、易从宿主细胞分离出来，便于后续体外操作,6,质粒是细菌或细胞染色体外，小型共价闭合环状双链DNA (cccDNA)分子，是能够独立复制并保持恒定遗传的复制子。与宿主共存的遗传单位。,（二）质 粒,1、质粒的定义,7,细胞内独立的能够自我增殖的结构单位为复制子； 包括与复制控制有关的结构和与复制控制无关的 结构； 细菌的染色体是一个复制子，而真核生物染色体是 多个复制子的复合体。,8,可自然形成超螺旋，大小在2-300kb。还有开环（ocDNA）和线状两种状态。 质粒的存在与否对宿主细胞生存没有决定性作用（不同于线粒体）。 是基因工程最常用的运载体。,9,2、质粒的种类,Col质粒 ：大肠杆菌素
3、因子。产生大肠杆菌素。 F质粒 ：致育因子，可借此与其他细菌接触， 传递质粒DNA。 R质粒 ：抗药因子，可控制细菌产生灭活药物 的酶，或降低细胞膜对药物的通透 性，可对某些抗生素产生抗性。已成 为耐药性基因之源。,10,ColE1质粒,小分子量 多拷贝 不能自动转移 编码蛋白质性质 的大肠杆菌素,11,F-质粒,大分子量 低拷贝（1-2） 可自动转移,12,质 粒 接 合 转 移 机 制,13,R质粒,接合或非接合转移性质粒； 复制基因和转移基因位于R-因子的一处，耐药基因位于另一处。 RTF 区(耐药性转移因子) 带有转移基因. R 决定区 带有耐药性基因（常是转座子的成分）,14,抗药性
4、包括：氯霉素（Cm），氨苄（Ap） 氯霉素（Cm）；卡那（Km）；链霉素（Sm） 对金属离子抗性 砷（As3+），汞（Hg2+），镍（Ni2+）银（Ag+）,15,（1）自主复制性 是能独立复制的复制子。质粒DNA复制的质粒可随宿主的分裂传给下一代。,3、质粒的基本特征,16,根据复制的控制和每个细胞中的拷贝数多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒（stringent plasmid ）：复制与宿主的繁殖相耦联，受寄主复制起始蛋白控制， 1 - 3 拷贝 松弛型复制控制的质粒（relax plasmid ）： 复制不与宿主的繁殖相耦联，几十至几百拷贝,（2）可扩增性,17,（3）
5、不相容性 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性。,18,两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，在复制和分配到子细胞时存在竞争，致使两种质粒的最终拷贝数不同。,质粒的不相容性：分子机制,19,20,两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。,21,革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（
6、接合作用），如含F因子质粒等； 非接合型质粒不能在天然条件下独立地发生接合作用； 目前在基因工程实验室中常用的质粒属于此类。,（4）可转移性,22,质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，常见性状包括： 抗生素抗性（如 抗四环素、Amp、Kan） 重金属离子抗性基因、 复杂有机物的分解基因 。 它们通常是宿主细胞生长所非需的。 颜色反应（如蓝白筛选）,（5）携带特殊的遗传标记,23,24,双向复制,4、质粒复制特性,从oriV ，如大肠杆菌 的F-质粒,25,滚环式复制： 单向复制，从ori开始，结束于ori,26,4、质粒改造构建,天然质粒往往
7、存在不同程度的缺陷，因而不适合用作 基因工程的载体必须对之进行改造构建： （1）具有复制起始点 具有复制子的功能，且起始区域没有所需的酶切位点。 （2）加入合适的选择标记基因 如两个以上，易于用作选择。 （3）增加或减少合适的酶切位点，便于重组,27,（4） 分子量尽可能小 缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率， 增加装载量 （5） 改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝 （6） 应为非传递性质粒,28,5、质粒的分类,人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒 突变拷贝数控制基因 拷贝数1000-3000 扩增基因 低拷贝质粒 来自pSC101 拷贝数小于10 表达某
8、些毒性基因 测序质粒 含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 整合质粒 装有整合促进基因及位点便于外源基因的整合 穿梭质粒 装有针对两种不同受体的复制子便于基因克隆 表达质粒 装有强化外源基因表达的转录翻译、纯化的元件 探针质粒 装有报告基因，便于启动子等元件的克隆筛选,29,6、实验室常用质粒,优点： 1、分子量较小，为4363bp，不仅利于自身DNA的纯化，可容纳的外源DNA也较大。 2、具有两种抗菌素抗性基因可供转化子的选择记号。 3、具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝，为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,pBR322,30,
9、特点： 1）分子量小，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（不用氯霉素扩增，每个细胞含500-700个拷贝）。 2）抗性和蓝白筛选,易于 检测。 3）多克隆位点区（MCS）.,pUC系列,31,半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZ） 半乳糖苷酶基因有1021 AAs。该蛋白质可分为两部分：链和链。前者负责四聚体装配，后者具半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为-互补作用。 这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为链编码的基因称之为lacZ(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZ）均可作为标记基因。,蓝白筛选原理,32,lacZ（lacZ）中含有
10、多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达半乳糖苷酶的-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码-肽）表达的lacZ基因产物（ 链）互补，产生有活性的半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ -肽基因的结构，细菌内不能产生半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。,33,半乳糖苷酶基因的优点: a. 酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZ编码5-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性 c. lacZ和链基因的分别表达可使载体小而容量大,34,pUC衍生载体,T7和SP6启动子,可进行体外转录,35,由人工构建的具有
11、两种不同复制起点和选择标记，因而可在两种不同寄主细胞中进行存活和复制的质粒载体。 大肠杆菌-酵母，大肠杆菌-枯草芽孢杆菌,穿梭质粒,36,T7 promoter：T7 特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等。,原 核 表 达 载 体,37,7、 质粒DNA的分离纯化,最常用的方法为碱裂解法 原理：当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中；蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。,用此方法制备的质粒
12、较纯，收得率高，但繁琐， 且质粒中有开环现象。,38,用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体 加溶菌酶裂解细菌细胞壁 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体DNA及大部分蛋白质 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA 用无DNase的RNase去除残余的RNA,39,沸水浴法 （1）将菌体悬浮在含有EDTA和Triton X-100的缓冲液中 （2）加溶菌酶破细胞壁 （3）放入沸水浴中煮40秒 （4）离心，用无菌牙签挑去沉淀物 （5）乙醇异丙醇沉淀 此法制备的质粒不纯，收得率低，且制备规模小， 但快速，特别适
13、用于重组质粒的鉴定。,40,图1 图2,超螺旋环状线状,41,质粒大小应以线性 状态做判断,1、2、3、5：单一酶切位点 4：两个酶切位点 7：未酶切质粒,42,分子量，拷贝数多 为内切酶提供切点的机会小 容易提取,8、质粒载体的优缺点,优点,克隆片段小，小于10kb,缺点,43,噬菌体是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来。,（二） 噬菌体,1、噬菌体介绍,44,温和噬菌体：既能进入溶菌生命周期又能进入溶源生命周期的噬菌体（双链） 烈性噬菌体：只有溶菌生长周期的噬菌体,45, 噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 噬菌体由外壳包装蛋白和
14、-DNA组成 -DNA全长48502个核苷酸 -DNA上至少有61个基因（必要， 非必要基因）,2、 噬菌体生物结构,46,线状双链DNA分子，两端各有一个12核苷酸的互 补单链（粘性末端），称为cos区。,47,3、噬菌体感染周期,48,噬菌体的包装,49,4、 噬菌体的溶原状态 噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。 人们可以根据需要改变-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态。 DNA重组技术一般需要噬菌体进入溶菌状态 。,50,1）缩短长度 2）删除多余的酶切位点 3）加装选择标记
15、4）构建琥珀型密码子突变体,5、-DNA载体的构建策略,51,野生型-DNA包装的上限为51kb（包装范围36-51kb ），本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载量。,1）缩短长度,52,野生型-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。被切除后，不影响生命功能。 根据切除的多少，可将-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体,53,插入型载体,由于该类载体重组与否均可包装，因而为区分重组子与非重组子必须携带标记基因。,DNA中缺失部分非必要基因，只含有一个供外源基因
16、插入的酶切位点的DNA载体。,取代型载体,* 36-51 kb为包装的上下限,DNA的可替换片段两端具有两个酶切位点，酶切后替换片段 与带有所有必需基因的左右两臂分开，由外源DNA片段取代。,55,2）删除重复的酶切口 野生型的-DNA链上有5个EcoRI位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 -2个。 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单一的酶切位点。 除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。,56,3）加装选择标记 与质粒不同，野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是-DNA克隆载体构建的重要内容。 -DNA克隆载体上的选
17、择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 颜色反应类标记,57,加装选择标记imm434（免疫功能插入失活） imm434基因编码一种阻止-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。含有完整标记基因的-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑；当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， -重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。,这种形态学上的差异，为分离重组体提供了方便的标志。,58,插入失活：外源DNA克隆到插入型载 体上，会使噬菌体的某种生物功能丧失 效力，即所谓的插入失活效应。,59,lacZ（ -半乳糖苷酶插入失活）,lacZ基因编码-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当
18、外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能降解X-gal，不能合成蓝色化合物，形成无色空斑；而空载 体-DNA则产生蓝色透明斑。,60,4）构建琥珀型密码子突变体 琥珀型突变（sup) ：是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。 将野生型-DNA上两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散。 基因工程实验中用的菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。,61,-DNA重组分子需在体外人工包装成有感染 力的噬菌体重
19、组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质可直接从感染了噬 菌体的大肠杆菌中提取，现已商品化。,6、-DNA重组分子的体外包装,62,这些包装蛋白通常分为相互互补的两部分： 一部分缺少头部的 E组份， 另一部分则缺少头部的D组份。 包装时，当且仅当这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。,63,gt系列载体 gt10、 gt11和gt18-23等，适合cDNA的克隆（约6kb）,7、常用的噬菌体载体,gt10 ：imm434阻遏基因（免疫功能插入失活） 根据噬菌斑的
20、浑浊与否判断是否插入外源片段。,gt11 ：与lacZ融合表达的表达载体，用抗体探针检测融合蛋白，筛选重组子。,64,EMBL系列载体 克隆大片段基因组DNA的替换型载体，克隆容量可达20kb，用于基因组文库构建。,65,8、-DNA及其重组分子的分离纯化,1. 大肠杆菌培养至对数生长期 2. 加入-噬菌体悬浮液， 37培养1小时 3. 用新鲜培养液稀释，继续培养4-12小时 4. 高速离心，沉淀噬菌体 5. 酚抽提，释放-DNA 6. 乙醇或异丙醇沉淀DNA,66,9、 -DNA作为载体的优点： -DNA可在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 -DNA载体的装载能力为25 kb，远远大
21、于质粒的装载量 重组-DNA分子的筛选较为方便 重组-DNA分子的提取较为简便 -DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因,67,-DNA载体的装载量最大为25 kb，但在很多情况下，往往需要克隆更大的外源DNA片段，柯斯质粒载体的构建就是为了进一步提高噬菌体DNA的装载量。 柯斯质粒(cos site-carrying plasmid) 就是含有 -DNA两端cos区和质粒复制子的杂种质粒载体。,（三）柯斯质粒,1、柯斯质粒的定义,68,由于-DNA包装时，其包装蛋白只识别粘性末端（cos）附近的一小段顺序，均1.7kb长，通过特异切割体系，将多联体分子切割，然后进行包装
22、。,2、构建柯斯质粒载体的思路,69,将噬菌体DNA中与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，同时又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒，这便是构建柯斯质粒载体的思路。,70,与噬菌体DNA不同的是：柯斯质粒不能在体内被包装，更不能裂解细胞。相同的是：可体外包装，具有感染性。 与质粒相同的是：柯斯质粒具有质粒的复制子，能象质粒一样在宿主体内进行复制。它的制备与质粒相同。不同的是兼有噬菌体的某些性质。,71,3、柯斯质粒的优越性,（1）具有噬菌体的某些特性 能象-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞， 由于柯斯质粒不再携带包装蛋白基因，因此重组 DNA分子
23、在细胞内不能形成噬菌体颗粒。,72,（ 2）具有质粒载体的特性 携带质粒的选择标记，便于筛选。 具有质粒的复制子，能象质粒一样在宿主体内进 行复制； 具有质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。,73,可以装载比质粒或 -DNA大得多的外源DNA 片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长 为3.3kb，则该考斯质粒最大可装载47kb的 外源DNA。,（3）装载量大,74,外形：丝状噬菌体； 单链环状（6.4kb）DNA分子； DNA为正链DNA（感染性单链）； 感染带有F性纤毛的 E.coli菌株或转染 雌性菌株； 复制以双链环形（RF DNA）作媒介 单双链都可转染宿主,（四） M13
24、噬菌体载体,1、M13的结构特征,75,ori,78,人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千kb 的DNA片段， 此时柯斯质粒和噬菌粒载体的装载量也远远不能满足需要。,（五）人工染色体载体,79,将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区 (自主复制序列，ARS)、分配区(着丝粒序列，CEN)、稳定区（端粒 序列，TEL）与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。 当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。,80,目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人工染色体（BAC）装载量范围 在50 - 300 kb
25、之间。 酵母人工染色体（YAC）YAC载体的 装载量为350 400 kb。,81,82,分两类： 不带真核复制子的质粒型载体 在原核质粒中插入一个完整的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体系统。 转染前在细菌中扩增，转染后整合到染色体上，低水平表达。,（五）哺乳动物细胞载体,83,带有真核病毒调控序列元件的质粒表达载体 如 SV40 载体：猴乳多空病毒。 特点： 1）含有SV40的复制起始点、启动子、poly （A） 信号等调控元件； 2）用于瞬时表达系统； 3）可以在各种哺乳动物细胞内表达。 4）感染率高,84,1、Ti质粒(Tumor inducible plasmid
26、) 含有T-DNA（Transfer DNA，与植物结合的部 分。能转移并整合到植物基因组中。 存在于根癌农杆菌（植物病原菌）中 含有Ti质粒的根癌农杆菌转入植物细胞后，导致 植物产生冠瘿瘤。干扰植物的正常生长。 根癌农杆菌只侵染双子叶植物,（六）植物克隆载体,85,86,冠瘿碱合成酶基因：为农杆菌提供C、N源 生长素、分裂素基因：瘤细胞形成 Vir：其产物能够诱导Ti质粒产生T-DNA的单链线性拷贝,结构：,87,88,转化细胞产生植物激素，破坏受体激素 的平衡； 冠瘿碱合成基因对转基因植物意义不大 且会降低植物的产量； Ti质粒庞大（200-800kb）； Ti质粒在大肠杆菌中不能复制。,2、Ti质粒作为常规克隆载体的缺陷,89,加选择标记基因 如Kan+及真核生物的转录调控信号 大肠杆菌的ori 单克隆位点,3、改造的Ti质粒,未涉及到vir基因，改造的载体不能整合,90,双元载体,含有选择标记基因 无T-DNA区域 大肠杆菌的ori 有vir区域 农杆菌ori 单克隆位点 不含vir区域,辅助质粒,转化前克隆操作在E. coli中进行，然后转化到含修饰Ti质粒的农杆菌中，借助Vir的产物将重组克隆转入植物细胞。,