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1、第二节基因工程的基本技术,1、有毒试剂,基因工程实验安全,溴化乙锭（EB）：,DEPC(焦碳酸二乙酯):强有力的蛋白质变性剂,丙烯酰胺：有毒，影响中枢神经系统,过硫酸酸铵：对粘膜和上呼吸道、眼睛和皮肤有较大危害性，吸入可致命。,2、紫外线 紫外分析仪 紫外灭菌,3、放射线 放射性同位素,氯化铯：（重金属）可因吸入、咽下或皮肤吸收而危害健康。,甲醛：毒性较大且易挥发，也是一种致癌剂,酚、氯仿：蛋白质变性剂,4、转基因生物,5、水电安全,需注意防止污染,1、微生物污染,2、DNA、RNA污染,3、其他污染,仪器的正确操作,微量移液器,离心机,灭菌锅,蒸馏水器,电子天平,由于提取DNA的目的、种类、
2、所用的生物、组织材料、实验条件等不同，DNA的提纯有很多方法。,一 DNA的提取与纯化,（一）、质粒DNA的提取,plasmid DNA,The genomic DNA of E. coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell.,Genomic DNA,闭合环状的质粒DNA，在变性后不会分离，复性快；,（1）原理,1 .碱抽提法提取质粒DNA,DNA双链,变性,DNA单链,复性,强碱,中性,染色体线性DNA和或有缺口的质粒DNA变
3、性后双链分离，难以复性而形成缠绕的结构，与蛋白质SDS复合物结合在一起，在离心的时候沉淀下去。,变性,（2） 所用的试剂作用, 溶菌酶,能水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1，4糖苷键。 在碱性条件（pH8）下有活性。, 葡萄糖,增加溶液的粘度，维持渗透压，防止DNA受机械力（震荡）的作用而降解。,EDTA,Mg2+、Ca 2+的螯合剂，可抑制DNA酶的活性，防止DNA被酶降解。,NaOH-SDS,NaOH：强碱，提供pH12的碱性条件，使DNA双链变性。 SDS: 溶解细胞膜蛋白和细胞内蛋白，并结合成“蛋白SDS”复合物，使蛋白质（包括DNA酶）变性沉淀。,冰醋酸把醋酸钠溶液的pH调到
4、4.8。 用来中和NaOH变性液，使DNA复性。,高浓度的NaAc有利于变性的大分子（蛋白质、DNA、RNA等）沉淀。,用于沉淀DNA。, 乙醇,DNA用于沉淀DNA分子以水合状态“溶于”水里，乙醇能夺去DNA分子的水环境。, NaAc-HAc缓冲液, RNase A,降解RNA。 以免提取后的DNA中含有小分子的RNA。, TE缓冲液,DNA保存液。 由Tris-HCl和EDTA配制。,Tris-HCl不含金属离子（不同于磷酸缓冲液或硼酸缓冲业），有利于以后操作； EDTA抑制DNA酶，防止DNA被酶降解。,蛋白变性剂，进一步抽提DNA溶液中的蛋白质，使蛋白质沉淀。 但苯酚会残留在DNA溶液
5、中。 （现多用各种商品化的层析柱纯化DNA)。, 酚-氯仿,选用,以上试剂有商业试剂盒；也可以自己配制。,（3）碱抽提法提取质粒DNA的步骤,Solution I 的配制：,使用“溶液”溶解细菌细胞壁。,第一步：溶菌,50mM葡萄糖， 25mM Tris-HCl(pH8.0)， 10mM EDTA， 4-5mg/ml溶菌酶， RNase A,溶液II 破坏细胞膜，蛋白质和DNA变性。,第二步：破膜，蛋白质和DNA变性,Solution II 的配制：,第三步：中和,溶液III使DNA复性、并促使蛋白质-SDS复合物和染色体DNA、RNA沉淀。,Solution III的配制：,0.2N NaO
6、H，1.0%SDS,3M 醋酸钠（用冰醋酸调pH至4.8）,最重要的是：,2. 影响质粒DNA产量的因素,菌株的遗传背景， 质粒自身的拷贝数。,一般要使用endA基因发生突变的大肠杆菌菌株。如DH5、JM109、XL1-Blue等。,（1）受体菌株,endA基因编码核酸内切酶，在Mg2+的存在下可将双链DNA消化成7bp的寡核苷酸片断。,这是直接决定DNA产量的重要因素之一。,（3）质粒大小,分子量大的质粒，拷贝数少。,（2）质粒拷贝数,质粒本身的性质所决定。,若干常用质粒的理论产量,（二）、基因组或其他DNA的提取,1.细菌基因组DNA的制备,大肠杆菌基因组DNA,一般过程及原理：,（1）细
7、胞裂解,10%SDS和蛋白酶K。37 温育。,不用NaOH !,（3）沉淀DNA,0.6倍体积的异丙醇。,（2）DNA纯化,CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)除去多糖，酚-氯仿-异戊醇除去蛋白。,苯酚 2次,酚氯仿异戊醇 25 24 1 1次,氯仿异戊醇 24 1 1次,一般过程及原理：,动物组织剪成小块，置液氮中冻结后研磨成细粉末。 组织培养的细胞用胰酶消化松散后直接使用。,（1）组织粉碎,2. 哺乳动物细胞基因组DNA的抽提,0.5%SDS和0.1mg/ml蛋白酶K。50 温育。,（2）细胞裂解,（3）纯化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。,SDS是离子型去垢剂（detergent
8、），可以使细胞膜崩解。也是蛋白质变性剂。,苯酚 2次,酚氯仿异戊醇 25 24 1 1次,氯仿异戊醇 24 1 1次,（5）除去RNA污染,用RNase。,用2倍体积的无水乙醇。,（4）沉淀DNA,（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀）,一般过程及原理：,（1）组织粉碎,用液氮冷冻后研磨成细粉末。,3. 从植物组织中制备 DNA,（2）细胞裂解,用2%CTAB / 2-ME (十六烷基三甲基溴化铵/2巯基乙醇）。 或1% SDS和蛋白酶K。 65 温育。,CTAB即十六烷基三甲基溴化铵，是一种阳离子去污剂，在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，只
9、是不能沉淀核酸。因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。 巯基乙醇作为还原剂使多酚氧化酶失活，可以防止酚类的氧化。,用0.6倍体积的异丙醇（-20 ）。,（3）纯化DNA,用苯酚和酚-氯仿抽提除去蛋白质污染。,（4）沉淀DNA,（5）除去RNA污染,用RNase A。,（可以加入1/10体积的3M醋酸氨辅助沉淀） 。,（三）、DNA的定量和纯度测定,1. 紫外光谱法,DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。,用微量比色杯（10l）在紫外分光光度计直接测定。,原理：,蛋白质在280nm处有吸收峰,2
10、,浓度测定步骤,一、用无菌TE或双蒸水将待测样品稀释20倍或更高。,二、用无菌TE或双蒸水做对照，将紫外分光光度计260 nm、280nm、310nm调到零点。,三、加入DNA稀释液在260nm、280nm、310nm测定OD值。,四、计算DNA浓度,ssDNA：ssDNA=33（OD260OD310） 稀释倍数 dsDNA：dsDNA=50（OD260OD310） 稀释倍数 ssRNA： ssRNA=40（OD260OD310） 稀释倍数,衡量提取DNA 的纯度,OD260/OD280 1.8 可能有RNA污染,OD260/OD280 1.8 可能有蛋白质污染,再进行酶消化处理，酚氯仿抽提去
11、酶,溴化乙锭（EB）能插入DNA分子中，紫外光照射下能发 红色荧光。,2. 琼脂糖凝胶电泳估计,原理：,与已知浓度的DNA电泳带荧光强度对比，就可以估计出DNA含量。,一般使用琼脂糖凝胶电泳，与已知分子量的DNA标准混合液对比得知。,DNA分子量Marker有许多公司的商品，使用非常方便。如DNA的Hind酶切物等。,（四）、DNA分子量的估计,Marker,Marker,DNA ladder,28kb,2500bp,2300bp,1300bp,900bp,750bp,200bp,5000bp,20kb,1000bp,900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,30
12、0bp,200bp,100bp,DNA Marker,自从琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶被引进核酸研究以来，凝胶电泳已经发展成为一种分析重组DNA分子的重要技术手段，同时也被广泛地应用于DNA 的核酸内切酶消化片段的分析、分离和纯化以及蛋白质的分析和纯化等方面的工作。,二 凝胶电泳技术,1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。,（一）、电泳的基本原理,4.,如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）： 分子在电场中迁
13、移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。 形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。,摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。,5.,Relaxed,supercoiled,Increasing degree of supercoiling,相同分子量的DNA:,闭合环状卷曲超螺旋迁移最快， 线性分子次之， 伸展开环状最慢。,超螺旋,线性,开环,（二 ）、琼脂糖凝胶电泳,1. 琼脂糖,2. 琼脂糖凝胶,琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。,是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。,琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙
14、（密度）。,浓度高,空隙小,空隙小，分辨率高： 小分子较易通过，而大分子难通过； 空隙大，分辨率低： 大小分子几乎以同等速率通过。,3.琼脂糖凝胶的分辨力,空隙大小决定其分辨分子大小的能力。,带电颗粒在电场作用下移动的速度叫做电泳迁移率。（1）DNA分子的大小。 （2）DNA的构象。 （3）琼脂糖浓度。 （4）溴化乙锭使DNA迁移率下降15%。 （5）电压。 （6）电泳缓冲液的成分及浓度。,何为电泳迁移率？影响DNA琼脂糖凝胶电泳迁移率的因素有哪些？,优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。,（三） 、聚丙烯酰胺凝胶电泳,琼脂糖凝胶电泳：分离30050000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：分离11000b
15、p,（四）、凝胶染色,1. 染料,溴化乙锭。,Ethidium bromide （EB）,EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。,2. 原理,UVP全自动凝胶成像分析系统,OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统,（五）、聚丙烯酰胺凝胶银盐染色法,银盐染色法灵敏度比EB高200倍.但银染色后，DNA不宜回收。银离子(Ag+)可与核酸形成稳定的复合物，然后用还原剂如甲醛使Ag+还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐色。主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色。,具体步骤
16、,1、固定液固定：2.5 ml 95%乙醇、2.5 ml冰醋酸定容到500ml,2、染色液染色：1克硝酸银定容至500ml,3、显色液显色：7.5克NaOH加5.4ml甲醛定容至500ml,DNA-DNA或DNA-RNA链杂交。用放射性同位素（32P或125I）标记的DNA或RNA探针。,三 核酸的分子杂交,（一）、Southern blot,用DNA（或RNA）探针检测DNA样品。,Southern blot 筛选结果,（二）、Northern blot,用DNA（或RNA）探针检测RNA样品。,（三)、 原位杂交,对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。,需要目的基因的探针。,四
17、 基因扩增技术-PCR,(一)、基因扩增（gene amplification),指生物体内或体外人工方式使基因拷贝数大规模增加。有下列五种方式：,1. 环境诱发扩增,2. 基因的程序性扩增,5. PCR扩增,3. 基因组进化扩增,4. 基因工程扩增,1. 环境诱发扩增,如氨甲喋呤诱发二氢叶酸还原酶基因扩增。,在环境因子的诱发下，某些基因产生明显的扩增。,在发育的某个阶段，某些基因的大量扩增。,2. 基因的程序性扩增,如非洲爪蟾卵子形成过程中rRNA基因的扩增。,生物进化过程中基因组中某些基因的拷贝数增加，结果相关的基因聚集成簇。,5. PCR扩增,应用聚合酶链式反应（Polymerase C
18、hain Reaction，PCR）技术，在体外特异性地扩增某个基因。,3. 基因组进化扩增,4. 基因工程扩增,载体携带目的基因在寄主细胞中大量复制。,（1）,1. PCR的发明,(二)、PCR技术,1971年Khorana提出体外人工复制DNA的设想。,当时由于引物和DNA聚合酶及DNA测序技术都没有解决，设想未能实现。,Polymerase Chain Reaction,聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）技术是利用酶促反应在体外指导特定DNA序列扩增的方法，以热变性的双链DNA分子为模板，利用引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为原料在DNA聚合酶的作
19、用下大量扩增了特定的DNA片段。,（2）,Mullis由此获得1993年诺贝尔化学奖。,1985年Cetus公司的科学家K.B. Mullis发明了PCR，使这一设想变成现实。,（3）Taq DNA 聚合酶,1988年 R.K. Saiki 把Taq DNA聚合酶用到PCR反应中。使 PCR自动循环仪成为可能。,（4）PCR 仪,1988年 Cetus公司发明自动热循环仪。,1986年 H.A. Erilish从嗜热 水生菌分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段（37 )，PCR技术才进入实用阶段。,PCR仪,2. PCR技术的原理,模板DNA变性,引物D
20、NA复性,引物DNA延伸,双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,TAGAACTTG,ACGTACGTA,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,3,3,5,5,3,TAGAACTTG,ACGTACGTA,95,（1）DNA模板变性,模板,模板（template）,95,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5端相同。,（2）DNA模板与引物复性,模板,模板,ATCTTGAAC,5,3,AC
21、GTACGTA,5,3,引物,引物,引物（primer）:,40-65,DNA聚合酶按碱基配对原则在模板上延伸DNA链。,（3）DNA链的延伸,TGCATGCAT,ATCTTGAAC,3,5,5,TAGAACTTG,ACGTACGTA,3,模板,模板,ATCTTGAAC,5,ACGTACGTA,5,Taq,Taq,72,理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA。,变性复性延伸。,（5）1个循环的结果,（4）新一轮循环开始,3. PCR的过程,（1）第一步 预变性（denature）,94-95 下5分钟，模板DNA双链完全变性成单链。,（2）第二步 循环（circle）,94 下
22、1分钟，新合成的DNA双链又变性成单链模板。,变性（denature）,72 下1-2分钟，Taq DNA聚合酶在引物的3端上加上核苷酸。, 延伸（extend）,复性（anneal）,50-60 下1分钟，引物优先与模板复性。, 引物的浓度高 引物的链短。,（3）第三步 补齐（fill）,72 下10分钟，Taq DNA聚合酶在非全长片段的3端上加上核苷酸使之成为全长片段。,第二步第三步第四步,复性,延伸,变性,95 5min,50 1min,72 2min,94 1min,温度循环,72 10min,PCR仪的温度循环程序,需要的模板量极低。,4. PCR的特点,（1）特异性强, PCR使
23、用专门合成的DNA引物。 延伸过程是在高温下进行。,（2）敏感性高,这就避免了一般DNA聚合酶污染和非引物延伸形成的DNA。提高了反映的特异性。,理论上只要一条模板链，32次循环就可合成约109条！,RT-PCR：,对模板的纯度要求低。,（5）可以扩增mRNA,（4）简便,先用逆转录酶将mRNA合成cDNA，再以cDNA为模板进行扩增。,（3）快速,整个PCR过程约4小时即可完成。,不需要纯化，甚至可以直接用细菌。已固定或包埋的组织切片也可以直接用于作模板。,自从H.A. Erilish分离出耐高温的Taq DNA聚合酶，代替大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片断（37 )，PCR技术才进入实用
24、阶段。,（1）Taq DNA聚合酶,5. 影响 PCR的因素,Taq DNA聚合酶的最大特点是热稳定性，耐高温，非常适合PCR过程的反复高温变性要求。, 热稳定性,最适温度： 75-80 延伸速度： 约35-150nt/s.酶分子 最长延伸长度：6.7kb, 最适温度高, Taq酶的功能缺点,具有53聚合酶活性和53外切酶活性，但没有3 5外切酶活性。 因此不能修复错误的碱基配对！,合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配，用于克隆基因时必须测序。,金属离子敏感（尤其是Mg2+ ）。 当dNTP（能结合Mg2+）的浓度为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2的最佳浓度应是2.0mmol
25、/L。, Taq DNA聚合酶的激活剂,50mmol/L KCl也能激活Taq DNA聚合酶的活性。,（2）其它耐热的 DNA聚合酶,Tth DNA聚合酶,无3 5DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA。,VENT DNA聚合酶,有35外切酶活性，能够校正碱基的错配。能耐受100高温。, Pfu DNA Polymerase, Taq Plus DNA Polymerase,有3 -5的外切酶活性，5-3外切酶活性。,但PCR产物为平端！,是目前已发现的所有耐高温DNA 聚合酶中出错率最低的。,是Taq和Pfu DNA聚合酶的混合物。,Taq的PCR产物3端往往带有一个A。
26、,与待扩增的模板DNA区段的两3端序列互补（ 5 端相同）的短DNA。,（3）引物（primer),位置,3,3,即2.751011 bp的基因组中有一次完全与19个核苷酸的序列相同的机会（或机会是约210-11）。,引物的长度,理论计算：,419=2.751011。,一般引物设计为长1530bp。,引物的碱基序列,5端根据需要可设计成某个内切酶的切点顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。,5ATGCAGAAACTGATCGATCGATCGAT3,3GCTAGCTACTTAAG5,3端必须与模板正确配对，5端可以不配对。,template,primer,尽可能提高
27、G+C含量，以提高引物与模板的结合力，碱基随机分布,一般G+C%含量宜在45-55%左右。,引物的碱基组成,避免连续相同碱基排列或内部回文序列.,5GGCAGTCTGCCAGTCTAC3,CTGCCAGTCTAC3,GACGG5,T,发卡结构,1）,2）,3）避免形成引物二聚体（dimer）,两个引物之间不能有两个以上的连续碱基序列互补。,5GGTCTGCCAGTCTAC3,3CAGGACTTAGTCACT5,primer1,primer2,Upstream primer vs Downstream primer,Sense primer vs Antisense primer,Primer1
28、 vs Primer2,Forward primer vs Reverse primer,4） 引物3端碱基最好选T,C,G而不选A,这样有利于延伸; 5） 为了便于后续的克隆可以在5端加保护碱基和酶切位点。,引物的Tm值,Tm=（G+C)4 + (A+T)2,当引物中的（G+C）含量低于50%时，复性温度低于55 。,适当提高复性温度可以提高引物与模板结合的特异性，减少非特异产物的出现。,实际复性温度选择低于Tm值5 。,手工计算：,一般估计：,引物的浓度,一般使用终浓度各0.5mol/L。,简并引物,如果引物的序列是从基因产物蛋白质的氨基酸序列反推出来的，就必须考虑密码的简并性。 需要合成
29、多种序列的引物，彼此间只有一个或几个碱基差异。这样的混合引物称简并引物。,设计多组引物，结合位点依次位于前一组引物之间。增加扩增产物的特异性。,引物设计现在多用专业软件,套嵌引物（nested primers),1,3,2,4,如Primer5.0等,Primer 5.0,但不能有蛋白质变性剂、DNA酶、Mg2+的螯合剂等影响DNA聚合酶的活性。,（4）模板（template), 模板的量：,不能太多，100l反应体系中100ng足够。, 纯度：,PCR对模板DNA的纯度要求不高。,dNTPs 是 dATP、dTTP、dCTP和dGTP的总称。,（5）dNTPs,一般反应体系中dNTP混合液终
30、浓度用0.2mmol/L。 浓度过高会抑制Taq DNA聚合酶的活性并增加错配率。,Taq DNA聚合酶要求有游离的Mg2+ 。,（6）Mg 2+ 的浓度,所以Mg2+浓度不能太低。但太高会增加非特异产物（杂带）。 一般用1.5-4.5mmol/L的MgCl2终浓度。,标准的PCR反应体系,1、引物 各0.1umol 2、 4种dNTP 各200umol/L 3、 10 buffer 10ul 2.5ul 4、 模板DNA 0.12ug 0.0250.5ug 5、Taq酶 2.5u 0.625u 6、Mg2+ 1.5mmol/L 7、ddH2O 加至100ul 加至25ul,100ul,25u
31、l,6. PCR技术的延伸技术,（1）荧光实时定量PCR,常规PCR 电泳鉴定产物的量,缺憾 1 无法对初始模板精确定量 2 无法实时监测扩增情况 3 跑胶繁琐、易污染,借助于荧光信号来检测PCR产物。可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据Ct值确定起始DNA的拷贝数，做到真正意义上的DNA定量。,Realtime PCR（或TaqMan PCR ）,Ct值：样品到达阈值水平所经历的循环数。,Threshold line,C(t) value,阈值：荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准。 C(t)值：荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数。
32、,荧光强度-循环数曲线,初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线,104,103,106,105,102,10,设定标准品，绘制标准曲线,通过标准曲线对未知样品模板进行准确定量,Ct值,模板量,到达阈值的循环数,阈值,扩增两个引物外侧的未知序列,（2）反向PCR,把线性DNA模板转变成环形分子。,template,template,3,5,5,3,（传统PCR只扩增两个引物质之间的已知序列）。,技术关键：,使引物的外侧序列 “转变” 成内侧序列。,低浓度的引物（限制引物）首先被用完，随后只有高浓度的引物，继续合成单链DNA。最后产物中99%是单链DNA。,（3）不对称PCR,3,5,5,3,引物
33、少,用于扩增单链DNA，单链DNA更适于测序。,技术关键：,两个引物的浓度相差100倍。,扩增RNA模板。如mRNA或RNA病毒。,（4）反转录PCR（RT-PCR),Temin,H.发现反转录酶， 1975诺贝尔奖,技术关键：,利用反转录酶，把RNA反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增。,RNA template,3,5,下游引物,cDNA first strand,3,5,上游引物,cDNA first strand,cDNA second strand,3,5,3,5,反转录酶,Taq酶,PCR,Reverse transcription (RT),下游引物,上游引物,Ta
34、q酶,(5)巢式PCR（Nest-PCR）,巢式PCR的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。,巢式PCR可以增加有限量靶序列（如稀有mRNA）的灵敏度，并且提高了困难PCR（如5 RACE）的特异性。,P1,P3,P4,P2,（6）原位PCR(in-situ PCR),原位PCR是Hasse等于1990年建立的技术，就是在组织细胞里进行PCR反应，它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的PCR技术的优点，是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。,原位PCR既能分辩鉴定带有靶序列的细胞，又能标出靶序列在细胞内的位置，于分子和细胞水平上研究疾
35、病的发病机理和临床过程及病理的转归有重大的实用价值。,（7）锚定PCR（anchored PCR）,锚定PCR：扩增已知序列侧翼未知序列的一种PCR方法，未知的3端添加一同聚物尾（polyG)，以互补的同聚物引物（polyC)和按已知序列设计的引物一起作PCR扩增。,关键：利用末端转移酶在未知一端创造引物结合位点,已知序列,末端核酸转移酶,3GGGG,5,CCCC 锚定引物,3GGGG,5,CCCC,3GGGG,CCCC,未知序列,5,3,7. PCR技术的应用,（1）扩增某一段DNA,从基因组中扩增； 从载体上扩增； 组织样本原位扩增； 微量残留DNA扩增； 分析模板序列；,在基因的某处引入
36、核苷酸突变（缺失、重复、插入、替换等）。,（2）基因的体外诱变,技术关键：,利用引物的5端序列不要求与模板严格配对，设计引物时引入突变序列。,设计引物定点诱变,利用6bp长度的随机序列引物扩增细胞中的总DNA，将会得到许多非特异性产物，反映了该引物序列在基因组中的分布状况。,（3）基因组的比较研究,比较不同物种之间的基因组特征和相似性。,限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析。,RAPD (Random amplified polymorphism DNA),1970年人们就有足够的理论知识来提出目前所用的快速DNA序列分析法。但当时在认识上和技术上存在两个问题：,当时没有能把不同长度的核
37、苷酸片段分离开的技术。 当时的分析思路局限于RNA序列分析法。,五 DNA序列分析,（1965年Cornell大学的S.W. Holley等首次测定了75bp的酵母丙氨酸tRNA全序列。使用的是降解片段法）。,Sanger等1977年发明。,(一)、双脱氧链终止法,Frederick Sanger, 1980年Nobel Prize化学奖,（1）DNA复制是以一条链为模板，按碱基配 对的原则进行的。 （2）脱氧核糖的连接是以35磷酸二脂键。 （3）复制反应可以在体外进行。 （4）2和3双脱氧的ddNTP会使复制反应终 止。,1. 原理,（1）制备单链DNA模板,2. 技术要点,就是待测序的 D
38、NA链。,不能有53和35的外切酶活性； 与模板的亲和力高，不会提前脱离模板。,（2）特殊的DNA多聚酶,dNTP / ddNTP = 100 / 1,（3）制备2和3双脱氧的ddNTP,时, DNA电泳带谱的分离效果最好，可读出200多个核苷酸序列。,需带有放射性或荧光标记。,（4）制备一小段单链引物（DNA或RNA）,3. Sanger双脱氧终止法测序过程,模板序列,1977年，哈佛大学的A.M. Maxam和W. Gilbert发明。,(二)、Maxam-Gilbert化学修饰法,Walter Gilbert, 1980年Nobel Prize化学奖,末端放射性标记 的DNA片单链,长度
39、只差一个核苷 酸的DNA链混合物,化学试剂处理,凝胶电泳,放射性自显影,阅读碱基顺序,特定的碱基中 引入化学基团,DNA在被修饰的 核苷酸位置断裂,1. 原理,2. 碱基特异的化学修饰法,3. 碱基特异的化学切割法,4. 测序过程,每组反应只针对特定的碱基，共有4组反应，可分别显示G、A+G、C、C+T的终止位置。,特点：,读出的序列就是要测的序列。,Sanger测序法读出的序列是新合成的互补链序列。,测序读片,90年代初期由英国、前南斯拉夫和俄罗斯的4个科学家小组同时提出来的。,1. 原理,（1）只有完全互补的DNA序列才能杂交形 成完全的双链分子。杂交效率最高。,(三)、DNA杂交测序,（
40、2）有个别不互补碱基时，杂交效率下降。 （3）非互补碱基越多，杂交效率越差。,（4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的碱基排列序列作探针。,8mer探针有48= 65536 种序列。,如： 8-mer靶DNA 同65536中的一种探针完全杂交形成完全互补双链。,（5）根据杂交效率可推断出靶DNA的序列。,5-AGCCTAGC-3,Target,3-TCGGATCG-5,Probe,假如探针序列已知，则可推知靶DNA序列。,（4）用一段寡居聚苷酸（8-mer）的所有可能的碱基排列序列作探针。,8mer探针有48= 65536 种序列。,如： 8-mer靶DNA 同65536中的一种探针完
41、全杂交形成完全互补双链。,（5）根据杂交效率可推断出靶DNA的序列。,5-AGCCTAGC-3,Target,3-TCGGATCG-5,Probe,假如探针序列已知，则可推知靶DNA序列。,（1）DNA芯片（chip）,把寡聚核苷酸探针的3 端或5端与玻璃或凝胶形成共价连接。 目前可以做出65536 种8-mer探针芯片。,2. 技术要点,每种探针的序列和位置已知，可被电脑读出。,DNA chip 杂交,（1）非放射性标记,1981年第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生。,(四)、DNA自动化测序,荧光物质标记。用激光能激发出不同颜色的荧光。,1. 技术要点,（2）不同的标记对象,既可标记引
42、物，也可标记ddNTP。,（4）分析自动化,（3）读片的自动化,激光探头直接读胶，实时阅读。,（2）反应的自动化,Sanger脱氧终止法。,电脑自动把荧光信号转化成对应的碱基，并打印出DNA序列。,（5）反应可在一个试管中进行,标记ddNTP时。,2. 荧光标记引物的自动化测序,分别用4种荧光物标记引物， 区分反应产物， 混合电泳， 激光一次读胶， 电脑合成结果。,3. 荧光标记ddNTP自动测序原理图解,4种不同的荧光物分别标记4种ddNTP。,可在同一管中进行,可在单一泳道电泳。,测序结果,高通量DNA序列分析技术,人类基因组计划的成功很大程度上得益于有效减少DNA测序成本的技术更新。通过
43、改良测序方法，不断提升其自动化程度，DNA测序的成本降低了100倍，从20世纪70-80年代$10/bp降低到本世纪初$0.1/bp！ 如果一个熟练的DNA序列分析人员采取早期80年代方法每天测定1000 bp计算，人类基因组（约3109bp）的全序列分析，至少也得需要100名这样的工人花上100年的时间才能完成。而2000年代的高通量测序仪可达到月测序1-6 Mbp！,Illumina / Solexa Genetic Analyzer 2000 Mb / run,Applied Biosystems ABI 3730XL 1 Mb / day,Roche / 454 Genome Sequencer FLX 100 Mb / run,Applied Biosystems SOLiD 3000 Mb / run,高通量DNA序列分析技术,