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1、红细胞膜蛋白提取鉴定,内容 1. 红细胞膜提取 2. 膜蛋白提取及定量测定（Lowry法） 3.膜蛋白电泳分离、分子量测定 SDS-PAGE 4.western blotting 鉴定-actin,实验报告要求： 分别按上各点，写出：原理，操作步骤，结果，讨论，结论 手写，A4 纸大小 ，报告首页写明 实验者，专业。,实验分组,每个班分三大组，每组十人左右，选出组长 实验进行一大组为单位 1.纯化RBC膜 2.SDS-PAGE 2块胶（一个凝胶架） 3.western blot 4.3-4 人一小组测定蛋白质含量,一.红细胞膜提取制备（低渗法）,原理： RBC置低渗缓冲液(pH7.4)，破裂溶
2、血 溶血液。 溶血液置高速离心作用中，去除溶液中Hb和其它内含物，制得纯净的RBC膜称为血影 “ghost”,注意事项：,1.离心步骤一定要“平衡、对称放置” 2.溶血液离心后上清吸取小心，以免丢失“膜” 3. 缓冲液pH7.4，偏酸使Hb残留增加 4.此分离方法适合于人、大鼠；牛、猪等易使脂蛋白脱落，1mMCaCl2可防止此种膜的不稳定性。 5.本实验因条件限制，在常温离心。如需保持蛋白活性，应在4C离心。,（1）RBC分离： 15 ml RBC液 2000rpm 5分钟 RBC（沉淀）3倍体积等渗磷酸Buffer 2000rpm 5分钟2 洗净之RBC （2）溶血液制备 RBC加入低渗磷酸
3、buffer（1:50) (在 烧杯中） 稍搅拌 置冰箱冻格（4C）溶血过夜 （以上步骤已完成！）,溶血液，用“水泵”吸去上清。 ！：膜很轻,二、 RBC膜纯化（洗涤）,RBC膜转至 1.5ml塑料管（2个/大组） 9000rpm 5 沉淀（膜）低渗磷酸Buffer（pH7.4) ?ml （吹打） 9000rpm 54 沉淀 等渗磷酸Buffer 1ml 9000rpm 5分钟 沉淀（RBC膜）0.6ml等渗Buffer （即为RBC原液）,三、 样品处理： 1.SDS-PAGE用样品处理（一大组）： 0.3ml RBC原液+0.3ml 样品溶解液 沸水浴 5 2.Lowry法测定用样品处理
4、(3-4 人/group）： A. 取0.3ml RBC原液 1.5ml H2O 150ul NaOH 沸水浴 5 待测管1： 取A液0.1ml0.9ml H2O 待测管2： 取A液0.3ml0.7ml H2O,四、Lowry法测定膜蛋白含量,立即摇匀，放置15分钟。以第管为空白管，在分光光度计上以620比色，读取。 以各管标准蛋白浓度为横座标，各管吸光度值为纵座标作图，画出标准曲线。 2.红细胞膜样品蛋白含量的测定 将待测管1、2同上加入碱性铜及酚试剂，一同测定,1.标准曲线制备,作图： 横坐标以标准蛋白含量 纵坐标以A620吸光度值 图比例应为3:2（横：纵） 计算： 在标准曲线上查出待测
5、样品的浓度，计算 提取膜的 Pr mg数/ml样品 注意稀释倍数 要求：计算原提取RBC液的Pr含量,五、SDS-PAGE测定膜蛋白分子量,不连续电泳系统： 电泳缓冲液pH离子强度与凝胶中不同（浓缩效应）,（一）垂直板安装 每套板两块玻璃下端对齐，夹好，放在胶架上！ （二）凝胶制备（见表） 先配好分离胶（留距齿梳1cm），待其凝固后，再配浓缩胶。 （三）电泳装置安装 先装内槽，试无渗漏； 放入外槽中，加Buffer。 上样品： 每孔18ul，2块/组 每块板留一标准蛋白孔 （四） 电泳： 100V进分离胶调至80V 约1.5小时,加入过硫酸铵，TEMED即刻灌胶。,（五）取胶: 用专用板平面轻
6、轻“橇”开板，推入小平皿中。 注意： 一块半干转移（浸入转移Buffer20min） 另一块考马斯亮蓝染色 染色2小时后，7%醋酸脱色（4） 每组做好标记（写好名字），交生化室扫描或摄像保留。,分子量计算,1.测量： cm a.每条带距离 （起始点至带中心） b.起始至示踪染料距离 2. MR： 条带距离(a) MR= 起始至示踪染料距离 (b),a,b,14,100,62,40,30,24,预染标准蛋白,3.半对数图：（六条标准蛋白） （参照统计学散点法） 横坐标为迁移率MR 纵坐标为LogM （直接按每一蛋白分子量标在半对数图中） 4.计算待测样品蛋白质分子量： 选在标准蛋白迁移范围内的相
7、应待测样品中的三条带，测量距离计算MR，Mw,9 8 7 6 5 4 3 2 1,0.1 0.2 0.3 0.4.,横坐标为迁移率MR；（六条标准蛋白） 纵坐标为LogM（直接按每一标准蛋白分子量）,20,60,100,六、western blotting(-actin鉴定),1.转膜 将与凝胶块(切去多余部分)一般大小的NC膜、滤纸均浸入转移Buffer中20分钟，取出，在半干转移槽中按以下顺序放置： (上）阴极端 滤纸-凝胶-膜-滤纸 阳极端（下） 用玻棒滚动去除空气气泡，盖好上盖。 开启电源，调电压时间20 v， 20分钟 2.封闭 将膜取出TBST中洗5，放置于封闭液中10分钟，用TBST洗53； 3.一抗孵育 将膜放入已放一抗溶液塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟3； 4.二抗孵育 将膜放入已放二抗溶液的塑料袋中，室温孵育 1小时，用TBST洗5分钟3； 5.DAB显色 配制DAB显色液 1 ml（适量），取出膜放入DAB溶液中，显色（约10分钟内）； （试剂盒：蒸馏水1ml ，A、B、C各一滴放入水中） 6.结果扫描保存,银 染,考马斯亮蓝染色,