生物化学蛋白质.ppt

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1、第二章 蛋白质,一、蛋白质的分类 二、蛋白质的组成单位-氨基酸 三、肽 四、蛋白质的结构 五、蛋白质的结构与功能 六、蛋白质的性质与分离分析技术,本章内容,蛋白质是有许多-氨基酸按一定序列通过以酰胺键(肽键)缩合而成的,具有稳定的构象并具有一定生物功能的生物大分子。 蛋白质是一切生物细胞和组织的主要组成部分，是生命活动所依据的物质基础。,一、蛋白质的分类,C H O N S （ 50%55%） （6%8%） （20523%） （15%17%） （03%）,Others: P、Cu、Fe、Zn、Mn、Co、Se、I,磷 铜 铁 锌 锰 钴 硒 碘,蛋白质氮元素的含量都相当接近，一般在15%17，

2、平均为16。这是凯氏定氮法测定蛋白质含量的计算基础。,蛋白质的元素组成：,6 .25 16的倒数，每测定g 氮相当于6 .25g的蛋白质。也就是1 g 氮所代表的蛋白质量（克数）,蛋白质含量蛋白氮6 .25,1.按分子的形状或空间构象分类 A.纤维状蛋白 分子很不对称，形状类似纤维。 一般不溶于水。典型的有：胶原蛋白质、弹性蛋白质、角蛋白质、丝蛋白质等 B.球状蛋白质 分子的形状接近球形，空间构象比纤维状蛋白复杂。 球状蛋白质的溶解性较好，能结晶，生物体内的蛋白质大多数属于这一类。 典型的有：胞质酶类等 C. 膜蛋白质 一般折叠成近球形。生物膜的多数功能是通过膜蛋白实现的。,2.按组成成分分类

3、 A .简单蛋白质单纯蛋白不含有非蛋白质部分。这类蛋白质水解后的最终产物只有氨基酸。 简单蛋白质按其溶解性又可分为: 清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白、精蛋白、组蛋白以及硬蛋白等,参见P18 表2-1,B.结合蛋白质结合蛋白是指由单纯 蛋白和非蛋白成分结合而成的蛋白质。 按其非氨基酸成分又可分为： 核蛋白、糖蛋白与蛋白聚糖、脂蛋白、色蛋白（血红素蛋白、黄素蛋白）、磷蛋白、金属蛋白,3. 按功能分类 酶（催化功能）；调节蛋白；贮存蛋白质；转运蛋白质；运动蛋白；防御蛋白和毒蛋白；受体蛋白；支架蛋白；结构蛋白；异常蛋白。,（一）-氨基酸结构通式,二、蛋白质的组成单位-氨基酸,氨基酸是含有氨基及羧基的

4、有机化合物。 氨基酸是蛋白质的基本组成单位。从细菌到人类，所有蛋白质都由20种标准氨基酸组成,构型：根据甘油醛构型确定D型和L型,1.根据甘油醛原则确定构型 2.自然界的氨基酸有两种构型，构型和旋光方向没有必然联系。 3.组成蛋白质的氨基酸都是L型，除甘氨酸外都有旋光性。LAA,据R基团化学结构分类,一氨基一羧基（中性AA、含羟基或巯基AA）Gly、Ala、Val、Leu、Ile、Ser、Thr、Cys、Met,芳香族A(Phe、Tyr),杂环(His、Trp);杂环亚(Pro);,据R基团极性分类,极性R基团AA,非极性R基团AA（8种） Ala、Val、Leu、Ile、Phe、Met、Pr

5、o、Trp,不带电荷（7种） Gly、Ser、Thr、Asn 、Gln 、 Tyr、Cys,带电荷：正电荷（种）His、 Lys、Arg 负电荷（种）Asp、Glu,据氨基、羧基数分类,一氨基二羧基(酸性AA及其酰胺）Glu、 Gln、Asp、Asn,二氨基一羧基(碱性AA）Lys、Arg,人的必需氨基酸 Lys Trp Phe Val Met Leu Ile Thr Arg、His（半必需）,(二) 氨基酸的分类,参见表2-2,脂肪族AA,氨基酸的结构、代号,1 氨基酸的两性解离性质及等电点,pH = pI 净电荷=0,pH pI 净电荷为正,pH pI 净电荷为负,(pK1),(pK2),

6、当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelectric point，pI)。,（三）氨基酸的重要理化性质,用标准NaOH和HCI进行滴定，用NaOH和HCI的摩尔数对pH值作图,规律,pHpI aa “” pHpI aa “” pH=pI aa “0”,表观解离常数 以丙氨酸为例:,参见P26,对侧链R基不解离的中性氨基酸来说，其等电点是它的pKl和pK2的算术平均值。,pI=(pK1+pK2)/2,对多氨基和多羧基氨基酸的解离 解离原则：,先解离COOH，随后其他COOH

7、； 然后解离NH3+，随后其他NH3+ 一般pI值等于两个相近pK值之和的一半,谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算,中性氨基酸：pK1为羧基的解离常数，pK2为氨基的解离常数。 pI=(pK1+pK2)/2 酸性氨基酸：pK1为羧基的解离常数，pK2为侧链羧基的解离常数。 pI=(pK1+pK2)/2 碱性氨基酸： pK2为氨基的解离常数，pK3为侧链氨基的解离常数。 pI=(pK2+pK3)/2,总结,1.某氨基酸的等电点即为该氨基酸两性离子两边的pK值和的一半。 2.在氨基酸等电点以上任何pH，AA带净的负电荷，在电场中向阳极移动；在氨基酸等电点以下任何pH，AA带净的正电荷，

8、在电场中向阴极移动。 3.在一定pH范围中，溶液的pH离AA等电点愈远，AA带净电荷愈多。,小结,(1)与茚三酮反应 茚三酮在弱酸性溶液中与-氨基酸共热，氨基酸被氧化脱氨、脱羧反应生成醛、CO2和NH3，最后茚三酮与反应产物氨和还原茚三酮发生作用，生成蓝紫色化合物。 两个亚氨基酸脯氨酸和羟脯氨酸 与茚三酮反应并不释放NH3，而直接形成 黄色化合物。,2 氨基酸的化学性质,茚三酮,+,氨基酸与茚三酮反应,水合茚三酮,(2) 与甲醛的反应,氨基可以与甲醛反应，生成羟甲基化合物。 由于氨基酸在溶液中以偶极离子形式存在，所以不能用酸碱滴定测定含量。与甲醛反应后，氨基酸不再是偶极离子，其滴定终点可用一般

9、的酸碱指示剂指示，因而可以滴定，这叫甲醛滴定法，可用于测定氨基酸。,(3) 与2，4-二硝基氟苯的反应 (Sanger反应） 在弱碱性溶液中，氨基酸的- 氨基很容易与2，4-二硝基氟苯（DNFB）作用，生成稳定的黄色2，4-二硝基苯基氨基酸（简写为DNP-氨基酸）。,+,DNFB（dinitrofiuorobenzene）,氨基酸,DNP-AA(黄色),（sanger反应）,+ HF,与丹磺酰氯反应（DNS） 丹磺酰氯是二甲氨基萘磺酰氯的简称,+,HCI,有荧光,(4) 与异硫氰酸苯酯反应（Edman反应） 在弱碱性条件下，氨基酸中的-氨基还可以与异硫氰酸苯酯（PITC）反应，产生相应的苯氨基

10、硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）。在无水酸中，PTC-氨基酸即环化为苯硫乙内酰脲（PTH），后者在酸中极稳定。 这个反应首先被Edman用于鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸。,+,PITC,苯氨基硫甲酰氨基酸（PTC-氨基酸）,（Edman反应）,苯硫乙内酰脲(PTH-AA),两个相邻氨基酸的羧基和氨基之间脱水缩和形成的酰胺键称 为肽键。 氨基酸形成肽键后，称为氨基酸残基。 肽键连接氨基酸残基形成二肽、寡肽、多肽链和蛋白质。,（一）肽与肽键的结构,三、肽,肽键,N=C 0.127nm 键长=0.132nm N-C 0.148nm,肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，

11、以反式结构存在。,参见p32,肽平面或酰胺平面：,组成肽单位的4个原子和2个相邻的碳原子都处于同一个平面内，此刚性结构的平面称为肽平面或酰胺平面。,肽单位：实际就是一个肽平面,（二）肽单位 肽键的四个原子和与之相连的两个-碳原子所组成的基团。,参见p32,酰胺平面与-碳原子之间形成的二面角 （ 和 ）,（三）肽链中AA的排列顺序和命名,通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如下面的五肽可表示为： Ser-Gly-Tyr-Val-Leu,参见p31

12、,多肽链结构示意图,（四）天然存在的活性肽,自然界中有自由存在的活性肽，主要有： 1.谷胱甘肽（GSH）：三肽（GluCysGly），含有自由的巯基，具有很强的还原性，可作为体内重要的还原剂，保护某些蛋白质或酶分子中的巯基免遭氧化，使其处于活性状态。,分子中具有一个由谷氨酸的-羧基和半胱氨酸的-氨基脱水缩合的-肽键,2.脑啡肽：为五肽，具有镇痛作用，它们在中枢神经系统中形成，是体内自己产生的一类鸦片剂。,Met-脑啡肽 H Tyr Gly Gly PheMetOH Leu-脑啡肽 H Tyr Gly Gly phe LeuOH,3.牛催产素与加压素： 均为九肽，分子中含有一对二硫键，两者结构类

13、似。前者第八位为Leu，后者为Arg。前者可刺激子宫的收缩，促进分娩。后者可促进小动脉收缩，使血压升高，也有抗利尿作用，参与水、盐代谢的调节。 牛催产素 S S CysTyrIleGlnAsnCysProLeuGly-NH2 牛加压素 S S CysTyrPheGlnAsnCysProArgGly-NH2,四 蛋白质的结构,蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。,定义 1969年，国际纯化学与应用化学委员会（IUPAC） 规定： 蛋白质的一级结构指蛋白质多肽链中AA的排列顺序，包括二硫键的位置。,(一)蛋白质的一级结构,2.一级结构的意义,一级结构 高

14、级结构 功能,决定,决定,例：牛胰岛素的一级结构,蛋白质的空间结构又称蛋白质的构象或高级结构，是指蛋白质分子中所有原子在三维空间的分布和肽链的走向。 蛋白质的高级结构包括二级结构、超二级结构、结构域、三级结构和四级结构等。,(二)蛋白质的空间结构,1 维持蛋白质构象的作用力 维持蛋白质空间构象的作用力主要是次级键，即氢键和盐键等非共价键，以及疏水作用力和范德华力等。 氢键： x H y 离子键（盐键）：它是由带相反电荷的两个基团 间的静电吸引所形成的 疏水作用力（疏水键）：是指非极性基团即疏水基团为 了避开水相而群集在一起的集合力 范德华力：在物质的聚集状态中，分子与分子之 间存在着一种较弱的

15、作用力 二硫键 ：是两个硫原子之间所形成的共价键,蛋白质的二级结构是指多肽链的主链本身通过氢键沿一定方向盘绕、折叠而形成的构象. 它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。(注:二级结构不涉及侧链的构象) 主要有-螺旋、-折叠、-转角、无规卷曲。,2 蛋白质的二级结构,多肽链中的各个肽平面围绕同一轴旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离为0.15nm; 每个aa残基沿轴旋转100度. 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，每个氨基酸残基的C=O氧与其后第四个氨基酸残基的N-H氢形成氢键。 绝大多数天然蛋白质中的-螺旋几

16、乎都是右手螺旋。 -螺旋都是由L-型氨基酸构成的（Gly除外）。,、 -螺旋及结构特点,(1)-螺旋结构,螺距0.54nm,每残基的 轴向高度,0.15nm,每残基绕轴 旋转100 o,、-螺旋结构形成的限制因素:,凡是有Pro存在的地方,不能形成。因Pro形成的肽键N原子上没有H,不可能形成氢键。 静电斥力。若一段肽链有多个Glu或Asp相邻,则因pH=7.0时都带负电荷,防碍螺旋的形成;同样多个碱性氨基酸残基在一段肽段内,正电荷相斥,也防碍螺旋的形成。 位阻。如Asn、Leu侧链很大，防碍螺旋的形成。,(2) -折叠（-pleated sheet）,-折叠或-折叠片也称-结构或-构象，它是

17、蛋白质中第二种最常见的二级结构。 -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的多肽链平行排列，通过链间的氢键进行交联而形成的，或一条肽链内的不同肽段间靠氢键而形成的。肽链的主链呈锯齿状折叠构象,-折叠结构几乎所有肽键都参与链间氢键的形成，氢键与链的长轴接近垂直。 -折叠有两种类型： 一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。 另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反,-折叠的特点,N,N,N,平行式,N,C,N,反平行式,蚕丝心蛋白,-回折（或发夹结构） 在-转角部分，由四个氨基酸残基组成;弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。 这类

18、结构主要存在于球状蛋白分子中。 其特点是肽链回折180度,(3) -转角,目前发现的-转角多数都存在蛋白质分子表面，它们的含量相当丰富，约占全部AA残基的1/4。,(4) 无规卷曲,肽段在空间的不规则排布称为无规则卷曲。 在一般球蛋白分子中，往往含有大量的无规则卷曲，它使蛋白质肽链从整体上形成球状构象。,无规则卷曲示意图,细胞色素C的三级结构,无规则卷曲,3 超二级结构,（1）超二级结构指蛋白质中相邻的二级结构单位（-螺旋或-折叠或-转角）组合在一起，形成有规则的、在空间上能够辨认的二级结构组合体。 （2）超二级结构的基本类型： 、 、,超二级结构类型, , ,-曲折,-螺旋,定义：对于较大的

19、蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构，这种相对独立的三维实体称结构域。 现在,结构域的概念有三种不同而又相互联系的涵义:即独立的结构单位、独立的功能单位和独立的折叠单位。,4 结构域,类型： -螺旋域； -折叠域； +域； /域；无规则卷曲+-回折域； 无规则卷曲+ -螺旋结构域,结构域1,结构域2,-折叠,-转角,二硫键,-螺旋,卵溶菌酶的三级结构中的两个结构域,两个铁原子,蚯蚓血红蛋白中四个-螺旋组成的结构域 -螺旋域；,免疫球蛋白VL -折叠结构域 -折叠域；,定义 多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，沿三维

20、空间多方向卷曲，进一步盘曲折叠形成特定的球状分子结构。 在三级结构中，具有极性侧链基团的AA残基几乎全部在分子的表面,而非极性残基则被埋于分子内部,不与水接确.而形成疏水的核心。,5 蛋白质的三级结构,木瓜蛋白酶,组织蛋白酶B,-螺旋,维持三级结构的作用力,氢键 范德华力 疏水键（疏水相互作用） 离子键（盐键） 二硫键 疏水键，在蛋白质三级结构中起着重要作用，它是使蛋白质多肽链进行折叠的主要驱动力。,三级结构的特征： 含多种二级结构单元； 有明显的折叠层次； 是紧密的球状或椭球状实体； 分子表面有一空穴(活性部位)； 疏水侧链埋藏在分子内部， 亲水侧链暴露在分子表面。 实例：肌红蛋白,肌红蛋白

21、的结构与功能,（1）肌红蛋白的功能： 哺乳动物肌肉中储存氧并运输氧的蛋白。 （2）肌红蛋白的结构特点：1963年，Kendrew a .一条多肽链，153个氨基酸残基，一个血红素辅基，分子量17600道尔顿。 b.肌红蛋白的整个分子具有外圆中空的不对称结构，肽链共折叠成8段长度不等的-螺旋体（A-H），最长的有23个氨基酸残基，最短的有7个氨基酸残基。拐弯处多由Pro、Ser、Ile、Thr等组成。 c.具有极性侧链的氨基酸残基分布于分子表面，而带非极性侧链的氨基酸残基多分布于分子内部，使肌红蛋白成为可溶性蛋白。,肌红蛋白,血红素辅基,抹香鲸肌红蛋白（Myoglobin）的三级结构,6 蛋白质

22、的四级结构,四级结构是指由两 个或两个以上具有三级结构的多肽链按一定方式聚合而成的特定构象的蛋白质分子。其中每条多肽链称为亚基。 通常亚基只有一条多肽链，但有的亚基由两条或多条多肽链组成，这些多肽链间多以二硫键相连,亚基单独存在时无生物学活性。 一般来说具有四级结构的蛋白属于寡聚蛋白。,定义,维持蛋白质四级结构的主要作用力,在蛋白质四级结构中，亚基之间的作用力主要包括：氢键、离子键、范德华力和疏水键。即亚基之间主要是通过次级键彼此缔合在一起。 疏水键是最主要的作用力。,血红蛋白的结构与功能,（1）血红蛋白的结构特点： a.是四个亚基的寡聚蛋白，574个AA残基，分子量65000 b.是由相同的

23、两条链和两条链组成四聚体22，成人的血红蛋白为22、胎儿的血红蛋白为22 c. 链由141AA残基组成， 链由146AA残基组成。 四条肽链的三级结构与肌红蛋白相似，各自内部有一个血红素辅基。 （2）血红蛋白的功能：存在于动物血液的红细胞中，具有运输O2和CO2的功能；血红蛋白还能和H+结合，从而可以维持体内pH.,血红蛋白四级结构,血红素辅基,化学键,共价键,次级键,肽键,二硫键,氢键,疏水键,盐键,范德华力,一级结构,二、三、四级结构,三、四级结构,蛋白质分子中的共价键与次级键,(一) 蛋白质一级结构与功能的关系 1.同功蛋白质一级结构的种属差异性 细胞色素C是真核细胞线粒体内膜上一种含F

24、e的蛋白质，在生物氧化中起传递电子的作用。通过植物、动物和微生物等数百种生物的细胞色素C一级结构的研究表明： （1）亲缘关系越近，AA顺序的同源性越大。 （2）尽管不同生物间亲缘关系差别很大，但与细胞色素C功能密切相关的AA顺序却有共同之处，即保守顺序不变,五 蛋白质的结构与功能,不同生物与人的细胞色素C相比较AA差异数目 黑猩猩 0 鸡、火鸡 13 牛猪羊 10 海龟 15 狗驴 11 小麦 35 粗糙链孢霉43 酵母菌 44,生物 与人不同的AA数目 黑猩猩 0 恒河猴 1 兔 9 袋鼠 10 牛、猪、羊 10 狗 11 马 12 鸡、火鸡 13 响尾蛇 14 海龟 15 金枪鱼 21 角

25、饺 23 小蝇 25 蛾 31 小麦 35 粗早链孢霉 43 酵母 44,不同生物与人的Cytc的AA差异数目,圆圈代表分歧点,2.蛋白质一级结构的变异与分子病 分子病指蛋白质分子中由于AA排列顺序与正常蛋白质不同而发生的一种遗传病(基因突变造成的)。 镰刀形贫血病： 病因：血红蛋白AA顺序的细微变化,-链N端氨基酸排列顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 Hb-A（正常人） Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys Hb-S（患 者） Val-His-Leu-Thr-Pro-Val-Glu-Lys,镰刀形贫血病：病人体内血红蛋白的含量乃至红细胞的量都较正常人少，且红细胞

26、的形状为新月形，即镰刀状。此种细胞壁薄，而且脆性大，极易涨破而发生溶血；再者，发生镰变的细胞粘滞加大，易栓塞血管；由于流速较慢，输氧机能降低，使脏器官供血出现障碍，从而引起头昏、胸闷而导致死亡。,谷氨酸在生理pH值下为带负电荷R基氨基酸，而缬氨酸却是一种非极性R基氨基酸，就使得HbS分子表面的荷电性发生改变，引起等电点改变，溶解度降低，使之不正常地聚集成纤维状血红蛋白，致使红细胞变形成镰刀状,输氧功能下降,细胞脆弱易溶血.,3.一级结构的局部断裂与蛋白质的激活,胰岛素原与胰岛素（牛胰岛素原的激活）,(二) 蛋白质的高级结构与功能的关系,蛋白质的功能通常取决于它的特定构象。 某些蛋白质表现其生物

27、功能时，构象发生改变，从而改变整个分子的性质，这种现象称为别构效应。 如血红蛋白是四个亚基的寡聚蛋白，其与氧的结合存在别构效应。而肌红蛋白只有一个亚基，不存在别构效应。,6.1 蛋白质的性质 （一）蛋白质的相对分子量（自学） （二）蛋白质的两性电离性质和等电点 （三）蛋白质的变性与复性 （四）蛋白质胶体性质 (五) 蛋白质的沉淀 (六）蛋白质呈色反应 （七）蛋白质的测定 6.2 蛋白质的分离、分析技术（自学）,六 蛋白质的性质与分离、分析技术,(二) 蛋白质的两性电离及等电点,蛋白质的等电点：当溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中即不向阳极移动也不

28、向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点（pI）。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在外液pH低于等电点的溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在外液pH高于等电点的溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳带电粒子在电场中移动的现象。,参见p50,6.1 蛋白质的性质 （一）蛋白质的相对分子量（自学）,参见p51,电泳,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。 利用蛋白质的电泳现象，可以将不同带电性质和不同大小、形状的蛋白质分子进行分离纯化。 根据蛋白质净电荷的差异来分离蛋白质的一种方法是电泳法。,(三) 蛋白质的变性与复性 A

29、、蛋白质的变性定义 天然蛋白质因受物理、化学因素的影响，使蛋白质分子的构象发生了异常变化，从而导致生物活性的丧失以及物理、化学性质的异常变化。但一级结构未遭破坏，这种现象称为蛋白质的变性。,参见p52,B、引起蛋白质变性的主要因素：,1.物理因素： 加热、高压、紫外线照射、X-射线、超声波、剧烈振荡和搅拌等 2.化学因素： 强酸、强碱、脲、去污剂（十二烷基硫酸钠（SDS）、重金属盐、三氯醋酸、浓乙醇等。,C、蛋白质的变性后的表现,生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；光吸收系数增大；生物化学性质改变。 组分和分子量不变。,D、蛋白质变性的本质： 分子中各种次级键断裂，使其空间构象从紧

30、密有序的状态变成松散无序的状态，一级结构不破坏。 变性后的蛋白质在结构上虽有改变，但组成成分和相对分子质量不变。,E、蛋白质的复性,定义：如果引起变性的因素比较温和，蛋白质构象仅仅是有些松散时，当除去变性因素后，可根据热力学原理缓慢地重新自发折叠恢复原来的构象，这种现象称作复性。,核糖核酸酶变性与复性作用,天然状态，有催化活性,非折叠状态，无活性,变性,天然状态 S-S-键恢复 而且是正确配对,如：NH3、COO 、OH、-SH、-CONH-等，它们都具有高度的亲水性，当与水接确时，极易吸附水分子，使蛋白质颗粒外围形成一层水化膜，将颗粒彼此隔开，不致因互相碰撞凝聚而沉淀。,(四)蛋白质胶体性质

31、,由于蛋白质分子量很大，在水溶液中形成直径1-100nm之间的颗粒，已达到胶体颗粒范围的大小，因而具有胶体溶液的通性。 蛋白质的水溶液能形成稳定的亲水胶体的原因： 、蛋白质多肽链上含有许多极性基团。 2、蛋白质是两性电解质，在非等电状态时，相同蛋白质颗粒带有同性电荷，与周围的反离子构成稳定的双电层。使蛋白质颗粒之间相互排斥，保持一定距离，不致互相凝聚而沉淀。 蛋白质溶液由于具有水化层与双电层两方面的稳定因素，所以作为胶体系统是相对稳定的。,参见p54,蛋白质胶体性质的应用,由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 透析法：以半透膜提纯蛋白质的方法叫透析

32、法 半透膜：只允许溶剂小分子通过，而溶质大分子不能通过，如羊皮纸、火棉胶、玻璃纸等,(五)蛋白质的沉淀,蛋白质在溶液中的稳定性是有条件的、相对的。如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或失去水化层（消除相同电荷，除去水膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀。 定义：蛋白质在溶液中靠水膜和电荷保持其稳定性，水膜和电荷一旦除去，蛋白质溶液的稳定性就被破坏，蛋白质就会从溶液中沉淀下来，此现象即为蛋白质的沉淀作用。,参见p54,1 可逆沉淀,定义：在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形

33、成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。,(1)盐析 在蛋白质的水溶液中，加入大量高浓度的强电解质盐如硫酸铵、氯化钠、硫酸钠等，可破坏蛋质分子表面的水化层，中和它们的电荷，因而使蛋白质沉淀析出，这种现象称为盐析。 而低浓度的盐溶液加入蛋白质溶液中，会导致蛋白质的溶解度增加，该现象称为盐溶。 盐析的机理： 破坏蛋白质的水化膜，中和表面的净电荷。 盐析法是最常用的蛋白质沉淀方法，该方法不会使蛋白质产生变性。,各种蛋白质的亲水性及荷电性均有差别，因此不同蛋白质所需中性盐浓度也有不同，只要调节中性盐浓度，就可使混合蛋白质溶

34、液中的几种蛋白质分散沉淀析出，这种方法称为分段盐析。,(2)弱酸或弱碱沉淀法(等电点沉淀） 用弱酸或弱碱调节蛋白质溶液的pH处于等电点处，使蛋白质沉淀。 弱酸或弱碱沉淀法机理： 破坏蛋白质表面净电荷。,酸,酸,碱,碱,碱,酸,溶液中蛋白质的聚沉,(3) 有机溶剂沉淀法： 在蛋白质溶液中，加入能与水互溶的有机溶剂如乙醇、丙酮等，蛋白质产生沉淀。 有机溶剂沉淀法的机理： 破坏蛋白质的水化膜。 注意：有机溶液沉淀蛋白质通常在低温条件下进行，否则有机溶剂与水互溶产生的溶解热会使蛋白质产生变性。,2 不可逆沉淀,定义：在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产

35、生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 如加热沉淀（次级键）、强酸碱沉淀（影响电荷）、重金属盐沉淀（Hg2+、 Pb2+ 、Cu2+、 Ag2+）和生物碱试剂或某些酸类沉淀等都属于不可逆沉淀。,(1)重金属盐沉淀(条件：pH 稍大于pI为宜) 当pH 稍大于pI时，蛋白质颗粒带负电荷这样就容易与重金属离子结合成不溶性盐而沉淀。 重金属沉淀法的机理： 重金属盐加入之后，与带负电的羧基结合。,(2)生物碱试剂沉淀法（条件：pH稍小于pI） 生物碱是植物组织中具有显著生理作用的一类含氮的碱性物质。 能够沉淀生物碱的试剂称为生物碱试剂。生

36、物碱试剂一般为弱酸性物质，如单宁酸、苦味酸、三氯乙酸等。 生物碱试剂沉淀蛋白质的机理： 在酸性条件下，蛋白质带正电，可以与生物碱试剂的酸根离子结合而产生沉淀。 例如：“柿石症”,(3)加热变性沉淀法 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。少量盐促进蛋白质加热凝固。 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全和最迅速. 如：煮鸡蛋,(六) 蛋白质的颜色反应 (自学),双缩脲反应 酚试剂反应 蛋白质定量、定性 茚三酮反应 测定常用方法,另外还有：蛋白黄色反应、米伦氏反应、乙醛酸反应等。,参见p55,双缩尿在碱性溶液中能与硫酸铜发生反应，产生红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。,红紫色络合物,180C,双缩

37、脲反应,蛋白质在远紫外光区（200-230nm）有较大的吸收，在280nm有一特征吸收峰，可利用这一特性对蛋白质进行定性定量鉴定。,测定范围：0.10.5mg/ml,(七) 蛋白质的含量测定 (自学),考马斯亮蓝染色法、紫外吸收法、凯氏定氮法等,参见p55-56,本章总结,蛋白质的分类。蛋白质的功能 蛋白质的组成（元素组成、化学组成）及蛋白质含量的测定 20种氨基酸的结构、分类及名称（三字缩写符、单字缩写符） 氨基酸的重要理化性质：两性解离、茚三酮显色、与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应、与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应 蛋白质的一级结构：肽、肽键、活性多肽及一级结构的测定 蛋白质的空间结构：二级结构单元（ -螺旋、-折叠、 -转角、无规卷曲）、三级与四级结构（超二级结构、结构域、亚基）及结构与功能的关系 蛋白质的性质：大分子性质、蛋白质分子量的测定（离心法、凝胶过滤法、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法）、两性电离（等电点、电泳、离子交换）、胶体性质、蛋白质沉淀（可逆沉淀、不可逆沉淀）、蛋白质变性、紫外吸收及颜色反应 8. 蛋白质的分离、分析技术,课外作业 P61-62思考题 ：3、4、6、8,