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1、细胞因子的检测与应用,苏州市跃亚生物技术有限公司 赵寅岗,暨BD CBA技术简介,流式的基本原理 流式检测细胞因子 CBA技术的应用,流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术。 流式细胞仪（Flow Cytometer）集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。,流式细胞术定义,BD Accuri C6,流式细胞术原理,Multicolor Research Applications, 各种细胞（
2、如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等,流式细胞仪的检测范围,细胞结构 细胞大小 细胞颗粒度 细胞表面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 ,细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原 细胞活性 细胞内/外的细胞因子 激素结合位点、细胞受体 蛋白磷酸化 pH值 钙离子浓度 细胞膜电位、线粒体膜电位 ,流式的基本原理 流式检测细胞因子 CBA技术的应用,一个细胞的全面研究,Cell Vol. 132, January 25, 2008,什么是CBA?,多重分析 节约样本 灵敏度高,CBA是利用一系列荧光强度不同的微球，同时分
3、析样本中多种可溶性成分的流式检测方法。每个CBA微球有特定的荧光强度，大小一致，包被有特异性抗体，提供了捕获表面，有效捕获待测蛋白，再加入荧光标记（PE）的检测抗体，形成“三明治”夹心复合物进行检测。,+,+,Analyze of Interest,Fluorescent Detector Ab- PE,Capture Bead,Capture Ab,一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体，与待测样本孵育后，形成“三明治”复合物。,CBA原理,CBA原理,BDTM CBA Kits,操作步骤,检测物与捕获微球共孵育 标记荧光探测试剂（FITC或PE标记） 洗涤 流式细胞仪检测 CBA分析
4、软件批量数据分析,Human Th1/Th2 Cytokine CBA 标准曲线,5000 pg/ml,2500 pg/ml,1250 pg/ml,625 pg/ml,312 pg/ml,80 pg/ml,20 pg/ml,IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF- IFN-,IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNF- IFN-,CBA 分析软件,Home Screen,Toolbar,Calibration entry screen,基本原理与CBA kit相似 检测原理不同： Flex Set微球带有近红外和红色两种荧光，分别在流式细胞仪的FL3（近红外荧光）和FL4（红色
5、荧光）通道检测，通过这个二维矩阵（对应于微球上的特定序号）识别捕获微球，从而定性目的蛋白，PE标记的检测抗体在FL2通道来对目的蛋白定量。,BD CBA Flex Set,BD CBA Flex Set,CBA Flex Set的分析软件 FCAP Array Software,CBA Kit与CBA Flex Set,CBA特点,液相中反应，同时检测多种蛋白 操作简单(标本制备和上机检测），省时省力 微量样本(5-50ul) 灵敏度2.8pg/ml 所有分析只需一组标准曲线 避免酶联反应信号放大带来的假阳性 更好的线性度和更宽的检测范围(5000pg/ml) 流式细胞仪和CBA软件自动分析,
6、传统的ELISA与CBA相比,现有CBA Kit产品,现有CBA Flex Set产品,流式的基本原理 流式检测细胞因子 CBA技术的应用,CBA 应用,检测对象 血清、血浆、眼泪、房水、唾液、体腔灌洗液、细胞培养液上清、细胞裂解物等 应用领域 肿瘤研究及肿瘤疾病的辅助诊断、疗效和预后监测 干细胞研究和干细胞治疗监测 免疫学研究和免疫疾病的辅助诊断和监控 感染疾病的研究及辅助诊断和疗效评价 免疫功能监测 药效评价，药物研发、疫苗研究 细胞信号传导中磷酸化蛋白、凋亡相关蛋白定量分析,一、CBA的免疫学应用-Th1/Th2,IFN、IL-2,IL-4、5、6、10,IL-4、10,IFN,细胞免疫
7、,体液免疫,Th1介导 细胞免疫、 细胞毒性T细胞(CTL)生长和活化、 巨噬细胞(M)活化 迟发型过敏反应。 Th2 B细胞生长、活化和分化。 Th1/2的平衡关系着免疫平衡,现有CBA Flex Set产品-信号蛋白,二、CBA在肿瘤中的应用,诊断：恶性肿瘤时Th2亢进，良性肿瘤相反 全面快速的免疫功能评价 治疗前 治疗中：如CIK治疗后4天细胞因子会发生变化 治疗：随时调整治疗方案,临床上主要采用经验治疗和采用国内外抗感染治疗指南的方法治疗感染，具有一定的盲目性，且容易受临床医师各自的临床经验和诊断水平的影响。 一旦发生发热感染，常立即加用广谱抗细菌+抗真菌+抗病毒等多重覆盖治疗法，不仅造成抗生素的滥用，招致耐药菌株的出现，而且加重了患儿身体和经济负担。,三、CBA在感染中的应用,四、CBA在药物疫苗研发中的应用,流感模型动物的炎性因子表达谱，用于疫苗评价，共检测18个指标（BD CBA Flex Set）,CBA应用相关中文文献,CBA特点,液相中反应，同时检测多种蛋白 操作简单(标本制备和上机检测），省时省力 微量样本(5-50ul) 灵敏度2.8pg/ml 所有分析只需一组标准曲线 避免酶联反应信号放大带来的假阳性 更好的线性度和更宽的检测范围(5000pg/ml) 流式细胞仪和CBA软件自动分析,Thanks!,