《液相色谱—20080124.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《液相色谱—20080124.ppt（124页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、液相色谱法 在食品检测中的应用,主要内容,第一节、概述及原理 第二节、高效液相色谱仪 第三节、高效液相色谱的类型 第四节、高效液相色谱方法的建立 第五节、维护保养,高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末发展起来的一种分析技术，是一种以液体为流动相的现代柱色谱分离分析方法。它是在经典液相色谱基础上，引入气相色谱理论和技术而发展起来的。 因此气相色谱法的许多理论与技术同样适用于高效液相色谱法。,第一节、概述及原理,随着不断改进与发展，目前高效液相色谱已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特
2、点。,液相色谱与气相色谱法的比较,能测高沸点有机物 色谱柱一般在室温工作 柱效高于气相 分析速度与气相色谱相似 柱压高于气相色谱 检测器灵敏度与气相色谱相似,高效液相色谱法在食品分析中的应用，从80年代才开始，在国家标准食品卫生检验方法 理化部分GB5009-85中，尚无HPLC法，到了GB/T5009-1996中才增加此法。增加,液相色谱法在食品分析中的应用,第二节、高效液相色谱仪,一、常见的高效液相色谱仪器 二、输液系统 三、进样系统 四、分离系统 五、检测系统,一、常见的高效液相色谱仪器,液相色谱基本示意图,二、 输液系统,高压液相色谱仪的输液系统由过滤器、贮液装置、脱气装置、高压泵、压
3、力脉动阻尼器、梯度淋洗装置等组成。,1、过滤器 由贮液瓶(罐)到高压泵的输液管入口装有过滤器，以阻止流动相中固体微粒或机械杂质进入泵体损坏高压泵或单向阀，并造成输液管路堵塞。常用过滤装置是孔径为510um的多孔性烧结不锈钢过滤筒。溶剂应预先过滤。 2、贮液装置 用来贮存液体流动相。一般是玻璃或不锈钢容器，体积在0.52升为宜。贮液瓶要求能承受一定压力，耐腐蚀，易于脱气操作。 简单的贮液器为500ml 试剂瓶，盖严，防溶剂挥发。,3 脱气装置 流动相进泵前必须脱气，尤其是水和极性溶剂。否则过柱以后，压力降低，放出溶解的空气。气泡将影响分离效率、基线不稳使检测器灵敏度降低，甚至不能正常工作。 商品
4、成套液相色谱一般装有流动相脱气设备，如微型真空泵在线脱气，以脱除溶解在液体中的空气，防止溶解气在柱后由于压力下降而脱出，形成气泡，影响检测器正常工作。,3 脱气装置（续） 液相色谱常采用仪器外脱气，如： 低压脱气：电磁搅拌器搅拌溶剂，水泵减压脱气，可同时加温或向溶剂通氮气。由于抽气过程中可能引起流动相中低沸点溶剂损失而影响其组成，因而不适用于多元流动相脱气。 超声波脱气：将溶剂贮瓶置于超声波水浴中，脱气1520分钟，这是目前使用最广泛的脱气方法。 充He气在线脱气等。,4、高压输液泵,主要部件之一，压力：3050MPa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（10m），液体的流动相高速通过时，
5、将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。,4、高压输液泵（续）,应具有压力平稳、脉冲小；流量稳定可调（精度在1%2%）；耐腐蚀；泵室体积小；密封性能好等特性。 目前使用往复式 恒流泵。,5 阻尼器 高压输液泵输出的流动相具有一定脉动，很多检测器对流动相流速波动敏感，为了获得稳定的液流，在高压泵输出口常常接上脉动阻尼器。阻尼器由螺旋毛细管、波纹管等组成。,6、梯度洗脱装置,高压梯度: 利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,低压梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,三、进样
6、系统,进样系统是将试样送入色谱柱的装置。液相色谱仪进样系统要求进样重复性好；进样器死体积小；由进样引起色谱峰扩张小；密封性能好，不得出现泄漏、吸附、渗透等；进样时系统压力、流量波动小。 目前液相色谱仪进样主要有两种方式：一类是手动进样；另一类是自动进样。,1.手动进样系统,由于流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：,进样位置,进柱位置,2.自动进样系统,现代先进的液相色谱仪将六通阀配上样品传送系统、取样系统和程序控制器，实现了自动进样功能。 自动进样由于管路增加等因素，相同情况下比用注射器进样柱效下降5一10左右，但可自动进行取样、进样、清洗等一系列操作，操
7、作者只须将样品按顺序装入贮样装置即可，操作简便、重复性好。,四、分离系统,液相色谱分离系统包括：色谱柱、恒温装置、保护柱、连接管等部分。根据分析的目的物，选择适合的色谱分离系统，可以提高分离效果。,1 色谱柱,色谱柱由柱子、填料、密封环、过滤板、柱头等部分组成。柱壁采用优质不锈钢管或硬质玻璃管组成。不锈钢耐腐蚀，易纯化、耐高压，其内表面光洁度对柱效影响很大。柱管内若有纵向沟痕或表面不均匀，会引起色谱峰区带扩张，降低柱效。分析柱柱体为直型不锈钢管，内径26 mm，柱长1030 cm。,1 色谱柱（续）,填料是色谱柱的核心，填料的品种、粒径的形状、大小对分离都有明显影响。发展趋势是减小填料粒度和柱
8、径以提高柱效。,1 色谱柱（续）,化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相； a. 酯化型（硅氧碳键型）： SiOC b. 硅烷化型（硅氧硅碳键型）：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广，能在70 以下使用、pH范围28。,C18 (ODS)制备过程,1 色谱柱（续）,化学键合固定相与常规涂渍固定的比较： （1）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击； 耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （2）传质快，表面无液坑，比一般液体固定相传质快； （3）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性； （4）有利于梯度洗脱。,由于键合基团的覆盖率的 问题，决定分离机理存在 着双重分
9、离机制： 高覆盖率：分配为主； 低覆盖率：吸附为主。,2 恒温装置,柱温可以影响色谱分离效率。一般情况下，提高柱温可以降低流动相的粘度，增加样品在流动相中的溶解度，减小溶质的保留值。常用的柱温控制范围为室温至65之间。多数的样品在室温条件下即可进行分析，但恒定的柱温可以提高保留值的重现性，因此在室温变化加大的实验室配置恒温箱是很有必要的。 商品化仪器的恒温装置多采用空气循环箱恒温和色谱套柱加热恒温。一些没有配备恒温箱的仪器也有人采用水浴套管的方式恒温。,3 保护柱（预柱）,保护柱是连接在进样器和色谱柱之间的短柱。一般长为3050mm，柱内装有填料或过滤片。 防止来自流动相和样品中的不溶性微粒对
10、色谱柱发生的堵塞现象，起到保护色谱柱的作用。 避免硅胶和键合相的流失，起到提高色谱柱的使用寿命和不使柱效下降的作用。 由于保护柱具备造价低、使用方便等特点，且在分析食品时，样品中含有未除尽的蛋白、多糖等成分，多被采用。,3 保护柱（续）,有填料保护柱和无填料保护柱的比较： 有填料的保护柱要选择和分析柱性能相同或相近的填料。有填料的保护柱的缺点影响峰的保留时间。 无填料的保护柱一般是利用筛板的过滤作用，效果不如有填料的保护柱。,4 连接管,液相分析系统的连接管为内径为0.10.3mm的不锈钢管或PEEK管。 在选择管路和连接管路时，应尽量选择内径细的管路和保留尽可能短的管路， 在连接时一定要紧密
11、，以设法降低柱外死体积，减少谱带展宽。,五、检测系统,通用型 示差折光检测器有时也称为折射指数，RI、 蒸发光散射检测器 选择性 紫外可见光检测器 二极管阵列检测器 荧光检测器 化学发光检测器 电化学检测器,五、检测系统,紫外可见光检测器是液相色谱中应用最广的检测器，随着液相色谱产生而产生。 应用最广，对大部分有机化合物有响应。灵敏度高， 对环境温度，流速波动，流动相组成变化不敏感，因此无论等度或梯度冲洗，都可使用。 分为固定波长型、可变波长二种。,1 紫外-可见光检测器,紫外可见光检测器,紫外检测器流通池,2 二极管阵列检测器,紫外可见光吸收新进展： 20世纪80年代中期，用一系列 （102
12、4或512个）的光电二极管取代了是传统的光电倍增管，在一次色谱操作中可同时获得多波长的吸光度，并且可以采用现代微机技术将各组份的保留时间、吸收波长和吸光度汇合一起，绘制三维谱图，提供既定量又定性的色谱信息。 称为：（光电）二极管阵列检测器。,2 二极管阵列检测器,2 二极管阵列与紫外检测器比较,注意溶剂透过波长下限,苏丹红（1ug /ml）标准品色谱图,210nm-600nm,320nm-600nm,苏丹红标准品色谱图,常用溶剂透过波长下限,3 荧光检测器,许多化合物，如维生素B等被入射的紫外光照射后，能吸收一定波长的光，同时发射出荧光。被这些物质吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。 在
13、实际检测应用中，一些物质虽然本身不能产生荧光，但含有适当的官能团，可与荧光试剂发生衍生化反应，产生荧光。 荧光检测器的最大优点是有极高的灵敏度和良好的选择性。一般来说，它比紫外吸收检测器的灵敏度要高101000倍，可达g/L级 。,3 荧光检测器（续）,高灵敏度：10-1210-13g/mL; 高选择性：对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应； 对温度和流动相的流速变化不敏感，可梯度洗脱； 所需试样少，适合痕量分析,4 示差折光检测器,示差折光检测器也称折光指数检测器，是一种通用型检测器。 原理是：基于连续测定色谱柱流出物折射率的变化而用于测定样品
14、浓度。原则上凡是与流动相折射指数有差别的样品都可用它来测定。 灵敏度低、对温度敏感、不能用于梯度洗脱。,4 示差折光检测器,常用溶剂在20时的折射率,检测的灵敏度和待测组分的性质有直接关系。,1966年澳大利亚联合碳化物公司开发用于HPLC的通用检测器,最初被称为蒸发分析仪， 1984年美国Varex公司推出以激光为光源的ELSD,并陆续开发系列产品。,5 蒸发光散射检测器,5 蒸发光散射检测器原理,是利用样品组分雾化和蒸发形成固体微粒后对光的散射现象来检测色谱流出组分的方法,ELSD的原理:,雾化,检测,溶剂的蒸发,检测器的响应值仅与光束中溶质颗粒的大小和数量有关。而与溶质的化学性质无关。,
15、5 蒸发光散射检测器（续）,是一种通用的高效液相色谱检测方法，其灵敏度较高，检测限可达ng量级。 对温度的敏感程度也较低，也适合于梯度洗脱。 其响应值仅取决于光路中溶质颗粒的大小和数量，与其化学结构关系不大，一般无需测定不同化合物的定量校正因子。 对于其他检测器难以检测的化合物如磷脂、皂甙、糖类和聚合物等的检测，蒸发光散射检测法具有重要意义。 不适合于测定可挥发和半挥发性化合物。 流动相必须是可挥发的，如果流动相含有缓冲液，则必须使用挥发性盐如醋酸铵等，而且浓度要尽可能低。,与示差折光检测器比较,检测器 示差折光 蒸发光散射 最小检出限(g/ml) 10-7 10-9 梯度 不宜 适宜 温度影
16、响 有 无 破坏性 否 是 线形范围 104 小 检测项目 糖等 糖、脂肪酸、酯、 黄芪甲苷。,液相色谱检测器比较,第三节 液相色谱主要分离类型与原理,液相色谱C18？,一、 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography,固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是510m的硅胶吸附剂； 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。 基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸； 适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性； 缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；,二、 液-液分配色谱 liquid- liqu
17、id partition chromatography,固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相 normal phase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相 reverse phase）。正相与反相的出峰顺序相反； 固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用； 化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C-18柱（反相柱）。,三、 离子交换色谱 ion-exchange chromatography,固定相：阴离子离子交换树脂
18、或阳离子离子交换树脂； 流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液； 基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长； 阳离子交换：RSO3H +M+ = RSO3 M + H + 阴离子交换：R4NOH +X- = R4N X + OH- 应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。,四、 排阻色谱色谱 size- exclusion chromatography,固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；,原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由
19、其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。 全部在死体积前出峰； 可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离,五、 亲和色谱(AC) Affinity chromatograph,原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。,先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。,一、选择合适分析样品的液相方法 二、选择合适色谱柱 三、选择合适的色谱条件
20、 四、定性定量与方法学论证,第四节 液相色谱方法的建立,方法建立的目的,问题什么样的分离结果是好的?分辨率?,什么是色谱的分辨率？,分辨率的公式：,影响分辨率的因素：K，a，N,分辨率的方程 k 是容量因子，表达了样品与柱填料的作用强弱。 a 是选择性系数，描述两化合物分离的好坏程度。是化学因素。 N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程度。,色谱柱的柱效 N,理论塔板数计算公式： W s 方法 Wtan 16 切线法 Wh 5.54 半峰高 W3s 9 3s W4s 16 4s W5s 25 5s,Inject,Inject,用“切线”法计算柱效,不好的色谱柱的柱效反而比好色谱柱的要高，因为
21、其拖尾部分测不出来,Good Column,Bad Column,Inject,Inject,用“5”法计算柱效,影响柱效和色谱峰扩展的因素,（一）柱内展宽 1. 速率方程（也称范.弟姆特方程式） H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度， u：流动相的线速度(cm/s),减小A、B、C三项可提高柱效； 存在着最佳流速； A、B、C三项各与哪些因素有关？,A涡流扩散项,A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子,固定相颗粒越小dp，填充的越均匀，A，H，柱效n。表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻，色谱峰较窄。,B/u 纵向扩散项,B = CdDm Cd
22、：与扩散有关的常数。 Dm ：试样组分分子在流动相中的扩散系数（cm2s-1） (1) 存在着浓度差，产生纵向扩散; (2) 扩散导致色谱峰变宽，H(n)，分离变差;,C u 传质阻力项,传质阻力包括固定相传质阻力和流动相传质阻力之和,化学键合相为一单分子层液膜，因此样品分子从流动相进入固定相进行交换的阻力可忽略不计。,固定相传质阻力Hs ：,速率方程,提高柱效的方法,色谱柱本身 减小填料的颗粒度 填充的均匀 找到最佳的流速(根据不同内径) 合适的温度 降低溶剂的粘度 增加柱长,容量因子 k,改变k值的方法 调节流动相的极性、pH、离子强度等 梯度淋洗,与峰高的关系,与R的关系,选择性系数 a
23、,定义 a =1 时两组分分不开， 改变a的途径 改变固定相 改变流动相 改变温度 改变样品的本身性质,a ，k，N如何控制分辨率?,一、选择合适分析样品的液相方法,根据样品的性质：相对分子量大于2000还是小于2000 样品溶于水还是不溶于水,二、选择合适色谱柱,不同柱填料的用途及适用方法,不同柱填料的用途及适用方法,键合相的选择,。C18/ODS/RP-18,。高非极性，保留基于与疏水样品的相 互作用,。C8/RP-8,。非极性，保留基于与疏水样品的相 互作用,键合相的选择,。苯基,。非极性，保留基于与疏水样品的相 互作用及- 作用，非极性保留接近 C8，但因为与缺电子的官能图作用具 有独
24、特的选择性,。氰基,。中等极性，保留基于与疏水样品的相 互作用及CN官能团的作用，最适合 极性有机物，可作正相及反相分离,键合相的选择,。氨丙基,。极性，正相及离子交换模式 保留基于极性偶极作用或酸碱 相互作用，常用于糖、多糖及有机、 无机离子分析，使用时避免采用醛及 酮，后者与氨基会发生反应,。无键合硅胶,。高极性，正相分离模式 保留基于极性偶极作用及氢键 相互作用,选择合适色谱柱：C18柱物理性质,硅胶纯度 填料硅胶的纯度与残留金属离子浓度 色谱柱尺寸 填料床的长度和内径 颗粒形状 球型或不规则型 粒径 平均颗粒直径, 通常3-10m 表面积 颗粒外表面和内部孔表面的总和, 以m2/gra
25、m表示 孔径 颗粒的孔或腔的平均尺寸, 范围80-300,选择合适色谱柱：C18柱柱长的选择,色谱柱尺寸对色谱分离的影响： 短柱(15-100mm)- 运行时间短、柱压低、高灵敏度，快速分离、快速平衡、低溶剂消耗。 长柱(150-250mm)- 分辨率高,但柱压高、分析及平衡时间长，溶剂消耗大。 窄径柱( 2.1mm)- 检测器灵敏度高，减低溶剂消耗。 宽径柱(3-21.2mm)- 载样量高，上样量大，大口径柱可作制备。,选择合适色谱柱：C18 柱颗粒形状,球形颗粒压力较低，采用黏度大溶剂(50:50甲醇/水)柱寿命较长 无定型颗粒表面积较大，容量较高,选择合适色谱柱：C18 柱颗粒大小,小颗
26、粒密度较高，样品谱带较少扩散，峰比较窄及峰高但小颗粒会造成溶剂压力较高 3.5m 多用于分离复杂多组份样品 分析组份单一的样品多采用5m的粒径,选择合适色谱柱：C18柱表面积的选择,以m2/g为单位，颗粒外表及内里孔面积总和 样品保留随表面积增加，在正相分析尤其明显 大表面积提供较大保留及较高分辨率 高表面积对于多组份样品的分离具有较强的保留能力, 柱容量和分离度。 表面积低的填料通常能迅速达到平衡状态, 对于梯度淋洗尤为重要。,选择合适色谱柱：C18 柱孔径的选择,大孔的填料颗粒可以延长溶质大分子在填料表面滞留的时间, 达到充分分离, 改善峰形 分子量2000选择300 A孔径,选择合适色谱
27、柱：C18柱化学性质,键合类型 单体键合- 键合相分子与基体单点相连 聚合体键合- 键合相分子与基体多点相连 碳覆盖率 与基体物质相连的键合相的量 封端 键合步骤之后, 用短链将裸露的硅羟基键 合后封闭起来,选择合适色谱柱：C18柱键合类型,选择合适色谱柱：C18柱碳覆盖率,一般：3 % 20% 高碳覆盖率：提高柱容量，提高分辨率,分析时间 长 低碳覆盖率：缩短运行时间适合快速分析简单 样品及需要高含水流动相条件样品,选择合适色谱柱：C18柱端基封尾,使用较短烷烃链键合游离硅羟基(二次键合),选择合适色谱柱：C18柱端基封尾,封端：减轻待测组份与硅胶表面残留的酸性硅羟基反应而引起的色谱峰拖尾现
28、象对于极性样品, 未封端与经过封端处理的色谱柱在选择性上有明显差异。 无封尾：对极性样品提供不同选择性。,三、选择合适的色谱条件,1 流动相的极性,反相色谱中用的流动相为极性溶剂，如水、甲醇。不同极性溶剂的洗脱能力是不同的。 选择溶剂除考虑极性外，还要考核溶剂的本低紫外吸收、粘度等性质。,1 流动相的极性,通过改变溶剂来改变选择性,2 在流动相中加入改性剂,改变pH 缓冲盐 乙酸盐、磷酸盐 离子对试剂,3 选择合适的检测器 注意检测器的选择性 4 选择合适的柱温 柱温升高可以降低流动相的粘度，使柱压降低。,5 选择合适的积分参数,峰宽 最小峰面积 阈值,6 其他影响因素,柱外效应 连接管路 进
29、样器、检测器 进样体积 进样量,其他需要考虑的,除分辨率之外，以下几个因素都要考虑。 灵敏度 载样量 分析速度 溶剂损耗,成本 容易使用 色谱柱寿命 效率,四、定性定量与方法学论证,利用标准样进行对比定性 利用色谱峰的光谱性能或其他性能定性,1 定性分析,比较,食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的测定,比较:食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的测定,二极管阵列检测器采集到的二维图谱,苯甲酸,糖精钠,山梨酸,230nm,食品中苯甲酸、山梨酸、糖精钠的测定,苯甲酸,山梨酸,糖精钠,苯甲酸?,标准品色谱图,双波长紫外可见光检测器辅助定性,安赛蜜,糖精钠,苯甲酸,山梨酸,双波长紫外可见光检测器辅助定性,2 定量分
30、析,按积分方式分： 峰高法 峰面积法 按计算方法分： 归一化法 外标法 内标法,3 方法学论证,检出限 回收率 线形关系 稳定性,例:食品中苏丹红的测定,样品前处理,色谱条件,第五节、维护保养,HPLC的日常操作条件：温度：1030；相对湿度80；最好是恒温、恒湿，远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施。,HPLC用水,1 专门的纯水机或超纯水机； 2 去离子水重蒸； 3 二次或三次重蒸水； 4 采用类似家用的纯水机； 5 市场上瓶装的纯净水或蒸馏水； 6 其它途径；,不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质越高放置时间越短。 理想的HPLC用水应为18.2的超纯水，并通过0.22u
31、m的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。 含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。,HPLC六通阀进样器,六通阀进样器是高效液相色谱系统中最理想的进样器，它是由圆形密封垫(转子)和固定底座(定子)组成。美国Rheodyne公司（罗丹尼）的六通阀进样器最为通用，各大HPLC仪器制造商均以此产品作为仪器的进样器。,六通阀进样器,手柄位进样(Load)位置时，样品经微量进样针从进样孔注射进定量环，定量环充满后，多余样品从放空孔排出。 将手柄转动至进样(Inject)位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，推动样品进入液
32、相分析柱进行分析。 虽然六通阀进样器具有结构简单、使用方便、寿命长、日常无需维修等特点，但正确的使用和维护将能增加使用寿命，保护周边设备，同时增加分析准确度。如使用得当的话，六通阀进样器一般可连续进样3万次而无需维修。,手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快转动阀，不能停留在中途。,六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。 使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75，如20l的定量环最多进样15l的样品，并且要求每次进样体积准确、相同； 使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至
33、5倍，即20l的定量环最少进样60至100l的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。 推荐采用100ul的平头进样针配合20ul满环进样。,可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的。 进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0.45m的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。 为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，,泵的保养：,使用流动相尽量要清洁； 进液处的砂芯过滤头要经常清洗； 流动相交换时要防止沉淀； 避免泵内堵塞或有气泡； 每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉
34、污染。,柱子在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动； 当柱子和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净； 要注意流动相的脱气、过滤； 尽量不超过色谱柱的pH使用范围； 每根柱子都有一个流动相方向，不要随意改变流动方向,这将降低柱性能；,柱的保养：,溶剂切换时检查溶剂的相溶性； 尽量控制进样量； 每天分析工作结束后，要清洗进样阀中残留的样品； 每天分析测定结束后，都要用适当的溶剂来清洗柱，使用缓冲盐流动相后，用含有机相的水认真冲洗色谱柱，定期用强溶剂冲洗色谱柱； 若分析柱长期不使用，应用用适当有机溶剂保存并封闭。 色谱柱使用一段时间后柱效会下降，这时可考虑对色谱柱进行再生。,柱的保养：,注意柱接头的兼容性,紫外灯的保养：,在分析前、柱平衡得差不多时，再打开检测器；在分析完成后，马上关闭检测器。 样品池要保养。,压力异常,谢谢！,