电镜超薄切片2.ppt

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1、电子显微术,图1日立H-7500，H-7600,图JEM-2100F 日本电子,图4Sirion场发射扫描电子显微镜,一、 电子显微镜的发展史 1、光学显微镜的极限 光学显微镜的分辨本领大约是可见波长的一半，可见波长为400-800nm，所以光学显微镜的分辨本领大约是0.2um。 2、 1924年，法国科学家德.布罗意证明了任何一种快速运动的粒子，都具有波动性。 1926年德国科学家布许发现，高速运动的电子在电场或磁场下，会发生折射，并且能被聚焦。高速运动的电子具有波动性和折射性是电子显微镜的基础。 20世纪30年代，经过鲁斯卡、克诺尔、马顿等科学家的不懈努力，终于在1938年试制成功第一台实

2、用电子显微镜。,世纪年代电子显微镜问世，年代电镜技术和生物样本制备技术获得进展。后发展了扫描电镜术、冷冻复型术、高压电镜术、线显微分析术、扫描隧道显微术和原子力显微术等。,二、电镜的应用：正常结构；病理诊断；病原；化学；考古。,第一节、透射电子显微术 一、 透射电镜的原理 1 高速运动的并具有波动性和折射性的电子 2 电镜的各种像差 1）球差：是由于透镜不能把所有的入射光线聚集共同的焦点而产生的。 2）像散：这一缺陷主要是由于电子透镜实际上不可能做得完全对称。 3） 色差：可见光的波长不同。 4）畸变:在低倍镜时经常发生.因为图像中心部分和周边部分的放大倍数不同.,二、透射电子显微镜的结构 1

3、 电子枪 2 聚光镜系统 3 样品室 4 成象系统:物镜、 第一中间镜、 第二中间镜、投影镜。 5 观察和记录系统,三、透射电镜的使用 1 加速电压的选择：40-100kV可以一档一档的调节。加速电压对电镜的性能有以下的影响：一般样品薄时40-60KV，一般样品60-80KV，厚时100KV。 1） 电压越高，电子穿透能力越强； 2）对于某些生物制品，电压越高，图象反差越小； 3）电压升高电子枪亮度增加，荧光屏亮度也增加； 4）电压升高对提高分辨率有利。,2 聚光镜光阑和物镜光阑的选择 聚光镜光阑：200-300um;物镜光阑：20-70um. 3 放大倍数的选择 选择放大倍数的两个原则：感兴

4、趣的区域充满整个照相底片；感兴趣的细节特征十分容易测到。,4选视野、调焦和拍照 （1）把要拍照的视野移至屏中心69黑框内。 （2）用OB FOCUS调焦，拍照前使OB置于稍欠焦位置上以增加反差。 （3）核对是否存有像散，核对光斑是否居中，核对灯丝是否饱和对称。 （4）根据事先已在计算机上设定好的最佳光强度，调节BRIGHTNESS，使PAG1上的 EXP TIME为设定值（参考第三章）。 （5）盖上观察窗，按下PHOTO，即自动曝光。,透射电子显微镜生物制品制备技术,The photo of light microscope,冷冻蚀刻法,超薄切片,冰冻蚀刻复型术 冰冻割断术 Freeze et

5、ch replica Freeze cracking,电镜细胞化学术 electron microscope cytochemistry,免疫组织化学技术 免疫电镜术 Immunohistochemistry Immunoelectronmicroscopy,电镜放射自显影术 显微放射自显影技术 Electronmicroscope Autoradiography Microautoradiography,扫描电镜技术 Scanning electron microscopy SEM,现有的透射电镜生物制品制备技术分为两类： 一类是透射电镜的基本制备技术，包括超薄切片和负染色法； 另一类是生物

6、制品的特殊技术，其中包括冷冻蚀刻法、冰冻割断术、电镜细胞化学术 、免疫电镜术、电镜放射自显影技术、X线微区分析技术等。,1、 超薄切片样品的制备 （1） 取材( 基本要求是在活体情况下进行) 取材的原则(快、准、轻、小、冷的原则） 1） 快速：1分钟之内投入固定液。 2） 块小：0.5-1mm3或截面1mm2的长条。 3） 部位准 4） 损伤小：器械应锐利，避免牵拉、挤压，防止组织受机械损伤。 5） 低温：0-4oC,取材的方法 1）动物材料： 对神经组织等要进行原位固定或灌注固定，待组织适当硬化后再取材。,胚胎干细胞的研究,2）培养细胞(Cell culture)： 生长在瓶中的细胞到足够的

7、量，先倒去培养液，然后倒入适量的戊二醛固定液，在冰浴下3-5分钟、弯头吸管吹打或用软器械轻轻地刮下贴壁的细胞，将这种混合液倒入离心管中，2000rpm低速离心15-20分钟，使细胞呈团，弃去上清液，换一次固定液，将其移入修块台，修快成标准块4oC固定、待用。,3）单细胞悬液：精子、血球等其他不易聚集的悬浮游离材料，可加入等量的戊二醛和其他类型的固定液，轻轻地把他们悬浮在固定液中。 经过固定处理后 再离心成团， 在50oC中弃去上清液， 加入适量的经50oC 预温的2%的琼浆， 使团悬浮，将悬浮团 和琼脂液一同在薄片 上展层，固定后 切成1mm3的小块。,（2）固定 (fixation) The

8、 aim is to avoid digestion by enzymes (autolysis) or bacteria and to preserve the physical structure, pieces of organs should be promptly and adequately treated before or as soon as possible after removal from the animals body.,1）Function of fixation,A阻止细胞自溶。 B 稳定细胞物质成分。 C 在一些组分的分子之间以化学反应和物理反应建立铰链，提

9、供一个骨架来稳定各种细胞的空间结构。 D能提供一定的电子反差,理想的固定剂，应具备以下条件：能迅速而均匀地渗入组织细胞内部，稳定细胞内各种成分；能即刻将细胞“杀死”，尽可能保持细胞微细结构，减少死后变化；对细胞不产生收缩及膨胀作用，不产生人工假象及变形；可保存酶的活性，以利于细胞化学测定工作的进行。,2）影响固定效果的因素 固定液的pH值 渗透压 缓冲液的类型 固定的温度和时间 当前采用的是在04下固定1 4小时。,3）常用的几种固定剂 A 四氧化锇（osmium tetroxide,OsO4）亦称锇酸：锇酸实际上不是酸，它的水溶液是中性的，为一种强氧化剂。0.5-1g包装，淡黄色晶体。具有挥

10、发性和毒性，在室温下易挥发，其蒸气对粘膜有刺激作用，在通风橱内配制。,优点对蛋白质、磷酸脂蛋白、核蛋白固定较好； 对脂类固定较好。分子密度高，产生良好的反差，因此锇酸固定本身也起到生物染色作用。 缺点不能固定糖元和核酸，对微管固定较差。扩散慢，穿透能力差。具有挥发性和粘膜毒性。不适于进行细胞化学工作。,B戊二醛（glutaraldehyde,C5H8O2） 特点：纯的容易聚合，目前使用25%水溶液进口分装。存放时间久了容易变质，影响固定。 优点 (1)对组织穿透力强。(2)能保存某些酶的活性，对糖元、细胞膜、核基质等有较好的作用。(3)而且组织块在溶液中可保存较长的时间，适用于进行超微细胞化学

11、研究。,C 甲醛（fomaldehyde）:多用多聚甲醛粉剂配制。其分子小，渗透力强，固定迅速，对酶的活性保存好。,4）固定的方法 A 单固定法：单细胞或固定液易于浸透的组织 1-2%四氧化锇（1-2h）。 B 双固定法：戊二醛（2.5% 4oC 2h）-锇酸（1% 4oC 2h）。 C 原位固定和灌注固定：,附 几种常见固定剂的配制 固定液的PH值6.0-8.0，常用PH值7.2-7.4,对含水较多的组织可用PH值8.0，细菌、病毒可用PH值在7.0以下。 0. 2mol/L磷酸缓冲液的配制 磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6g 磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O） 29g 重

12、蒸水 加到500ml 调PH到7.4,0.2mol/L二甲坤酸盐酸缓冲液 重蒸水 25ml 二甲坤酸钠（Na(CH3)2AsO2.3H2O） 2.14g 0. 1mol/L盐酸 8ml 重蒸水 加至50ml 调PH到7.4,B 固定液的配制 锇酸固定液的配制 2%的锇酸固定液的配制：清洗烘干器皿 1G锇酸+50ml双蒸水（棕色瓶）数日可用。 0.1mol/L磷酸盐缓冲液或二甲坤酸盐缓冲液配制的1%锇酸固定液。 2%的锇酸缓冲液 10ml 0.2mol/L缓冲液 10ml 调节PH应为7.3-7.4,戊二醛固定液的配制 25%戊二醛（ml） 0.4 1 1.6 重蒸水（ml） 4.6 4 3.4

13、 0.2ml/L缓冲液（ml） 5 5 5 戊二醛最终浓度 1 2.5 4 调节固定液PH值到7.3-7.4,思考题,1、要显示脑组织的胆碱脂酶，你选择什么固定液和固定方法？用什么技术方法？ 2、要显示心肌纤维的超微结构，你选择什么方法？为什么？,（3） 脱水(dehydration) 1） 清洗:固定后均用和固定液相同的缓冲液冲洗3次，每次15分钟 2） 脱水：常用的脱水剂为乙醇和丙酮。 How to choose? Why? 乙醇引起组织中脂类物质抽提较丙酮少，且不会使组织变硬、变脆，故为常用脱水剂，然乙醇不容易和用于包埋剂的环氧树脂相混溶，因此在进入包埋剂之前常用中间剂环氧丙烷置换。,脱

14、水程序如下表,经验(experiment)： 脱水剂临时配制。 浓度梯度上升。 脱水时间和浓度。 脱水时的连续性。 脱水剂的选择。,（4）浸透是通过脱水剂稀释包埋剂，最终让包埋剂取代脱水剂，使其渗透到组织中去。,经验(experiment)： 浸透时间。 浸透温度。,（5） 包埋(embeding)： 1)目的:包埋的目的是让包埋剂完全浸透到组织内部，经加温逐渐聚合成坚硬的固体，成为细胞结构的支架，能够承受切片的各种力的作用，有利于切薄片。 2)包埋剂的性质:粘度适中，有良好的切割性能。能耐受电子束的轰击，高温不易升华、不变形。透明度好。对人无害。,3)包埋剂的种类,环氧树脂类： 目前国内使用

15、较多的环氧树脂有进口的Epon 812和国产的618。,原理:环氧树脂具有环氧基和羟基两个主要化学反应基团，环氧基是线型聚合物的末端，易与其它含活性氢原子的化合物如胺类反应，形成首尾相接的长链状聚合物。而单体中的羟基能与酸酐结合，形成分子间的横桥连接。因此，将环氧树脂、胺类和酸酐三者按比例混合，在一定温度条件下，可形成具有三维空间结构的交链状聚合物。,这种聚合物收缩率小、均匀，组织损伤小，耐电子束的轰击。包埋后可保存细胞内的微细结构。其缺点是粘度较大，操作不便、切片较为困难，而且反差较弱。,低粘度包埋剂(Spurr),为适应临床诊断电镜的需要，目前低粘度包埋剂的应用已日趋广泛。这是一种低粘度的

16、树脂，能较好地渗入组织内部，对组织结构保存好，耐电子束轰击，可广泛应用于各种生物材料，尤其适宜于较致密的组织。,水溶性包埋剂：,是进行细胞化学研究较理想的包埋剂。 原理:水溶性包埋剂可以在较低温度的紫外线照射下进行聚合，避免了一般包埋剂必须在高温下聚合而给酶活性带来的破坏，所以是酶活性定位和定量研究十分优良的包埋剂。 包埋剂:DurcuPan、乙二醇甲基丙烯酸脂(简称GMA)、聚乙二醇、Aquon等,所加的固化剂，有十二烯基虎铂酸酐（DDSA）和甲基内次甲基四氢苯二甲酸酐（MNA）,增韧剂为邻苯二甲酸二丁酯（DBP）,加速剂为2,4,6,一三苯酚（DMP30）。,环氧树脂的性能和配制： 618

17、树脂 5ml 十二烯基丁二酸酐 DSA（固化剂） 5ml 苯二甲酸二丁酯 DBP（增塑剂） 0.3ml 2,4.6三苯酚 称DMP30（加速剂） 0.1ml 60oC烘箱内加温使粘度下降，用量杯量取所需要的量，一次加入固化剂、增塑剂、加速剂，边加边搅拌，最后充分搅拌10分钟，至37oC温箱中使气泡逸出。,Epon812的配制 A液： Epon812 62ml DDSA(固化剂) 100ml B液： Epon812 100ml MNA(固化剂) 89ml A液和B液分别配制，使用时用不同比例将二者混合后再加1.5%DMP-30(加速剂)即可。A液和B液的比例：冬季2：8。夏季1：9。B液可以增加包埋块的硬度。,4)包埋的方法,