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1、HBcAg的检测与应用,摘要,HBcAg存在于Dane颗粒的核心，是HBV的结构蛋白即病毒核壳蛋白，具有重要的生物学特性和临床病理意义，HBcAg由HBV基因组的C开放读码区（ORF）编码，具有高度免疫原性，对HBcAg的免疫应答在病毒清除中有重要作用。血清HBcAg阳性可提供肝内HBV合成的信息，是病毒存在的直接标志，HBcAg感染的肝细胞是细胞免疫效应攻击的靶细胞，肝细胞溶解后HBcAg可直接释放入血，故能直接反映肝细胞损害和病情进展的程度。检测肝组织HBcAg有助于确定乙型肝炎病原学诊断和评估肝细胞坏死炎性活动的程度及病变发展的趋向，推测慢性乙型肝炎的预后。血清和肝组织HBcAg检测具有
2、多种实用价值，值得推荐。,0 引言,乙型肝炎病毒（HBV）是嗜肝DNA病毒，完整的HBV颗粒又称Dane颗粒，球形，直径约42urn。HBV核心抗原（Hepatitis B Core Antigen，HBcAg）存在于Dane颗粒的核心，是HBV的结构蛋白即病毒核壳蛋白，主要存在于受感染的肝细胞核内，它反映血清中Dane颗粒的存在及肝内HBV的复制。存在于乙型肝炎患者血液和肝组织内的HBcAg具有重要的生物学特性和临床病理意义。,1 生物学特性 1.1一般特性,HBcAg由HBV基因组的C开放读码区（ORF）编码，从第二个ATG（1 901 nt）起始翻译（终止密码子在2 458 nt）。HB
3、cAg有保守的三维结构，可因血清型不同而有183-185个氨基酸残基（aa），相对分子质量Mr21,000，180个HBcAg形成27nrn的正20面体以构成核心颗粒。HBV核心部分含有环状双股DNA、DNA聚合酶、HBcAg和e抗原（HBeAg），是病毒复制的主体。HBcAg包装HBV DNA，在病毒成熟过程中起重要作用。HBcAg己被证明含有HBV特异性DNA聚合酶，是HBV复制的标志。,1.1一般特性,HBcAg可在受染的肝细胞核中查到，但它主要在胞质中产生，由胞核定位序列（nuclear localization sequences，NLS）介导HBcAg进人细胞核中。胞核定位序列位于
4、HBcAg的羧基末端区（C端区）第145-156位和第172-183位的氨基酸序列，具有与细胞核特异性结合，并将与之相连的蛋白或DNA转运到细胞核中的功能。,1.2免疫反应,HBcAg具有高度免疫原性，在T细胞和B细胞水平上，HBcAg的抗原性较HBeAg强100倍，几乎所有HBV感染者都产生抗-HBc，同时有T细胞免疫应答。对HBcAg的免疫应答在病毒清除中可能有重要作用。这对HBcAg DNA的疫苗研究有重要的指导意义。,1.2免疫反应,Th细胞根据其的分泌细胞因子不同可分为Th1和Th2亚群。Th1细胞主要产生白介素-2（IL-2），干扰素（IFN）和肿瘤坏死因子（TNF）等促进细胞免疫
5、反应；Th2细胞主要产生白介素-6（IL-6）、白介素-4（IL-4）、白介素-10（IL-10）等促进体液免疫反应。Th1和Th2细胞通过分泌的细胞因子相互下调对方的生长分化，刺激自身的增生。,1.2免疫反应,机体的Th1型免疫反应可促进病原体的清除，而Th2型免疫反应则可加重机体的病理损害，在HBcAg诱导下，外周血单个核细胞（PBMC）产生Th1类细胞因子量明显增高；在HBeAg诱导下，Th2类细胞因子量明显增高。慢性HBV感染进行免疫调节治疗的一个目标就是使HBeAg特异性T细胞由Th2细胞主导型转化为Th1细胞型，HBcAg有望打破HBeAg诱导的免疫耐受状态而增强Th1细胞优势表达
6、达到治疗的目的。慢性乙型肝炎患者和HBV慢性携带者体内针对HBV的特异性CTL应答明显低下，纠正这种CTL低反应状态，对于机体有效地清除HBV至关重要。,1.2免疫反应,DNA疫苗（基因疫苗）是近几年免疫学和分子生物学研究的新兴领域，它作为一种全新的高效免疫方法，己在许多难治性感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病和肿瘤性疾病的预防及治疗领域显示出较好的应用前景。DNA疫苗可刺激机体特异性CTL功能的特性给HBV慢性持续感染的治疗带来新的希望。,1.2免疫反应,采用治疗性疫苗打破宿主对HBV的免疫耐受状态来治疗慢性乙型肝炎和慢性乙型肝炎病毒携带者是一新的有效途径。HBV核心抗原区AA1-AA1
7、51段含有多个不连续的抗原表位，对刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫均具有重要作用。Kuhober和Geissier et al作了HBcAg DNA疫苗肌内注射法免疫小鼠的初步观察。该DNA疫苗具有良好的细胞免疫原性，确可刺激宿主产生较强的CTL反应。这一结果为我们进一步探索该DNA疫苗在治疗主要因机体CTL功能低下所致HBV慢性持续感染方面的应用前景奠定了初步的实验研究基础。,2 临床应用 2.1血清HBcAg,HBsAg、HBeAg、抗-HBc等免疫学指标都是体内存在乙型肝炎病毒颗粒的间接标志，而HBcAg则是HBV存在的直接标志。所以，HBcAg测定更能反映HBV的存在及其复制程度
8、，比其他各种免疫学指标更灵敏、更特异。HBcAg是乙型肝炎病毒（HBV）的核心成分，若在血清中检出HBcAg则说明有HBV复制。,血中的HBcAg是作为Dane颗粒内部成分存在，极少有游离的HBcAg，故用常规方法不易检出，在血清中不能直接检出HBcAg，需加用开壳剂，使HBcAg释放于溶液中然后进行测定。检测HBcAg，目前多采用间接的方法，即首先在试管内将Dane颗粒沉淀，再用裂解剂裂解Dane颗粒外壳，使HBcAg暴露游离，并经过多次洗涤处理后，用放免或酶免方法检测。如用EIA微板法检测血清HBcAg，被检标本不须任何处理，直接在微孔板内进行检测，应用于临床，可与乙型肝炎病毒标志物同步检
9、测。,2.1.1检测,2.1.2血HBcAg与HBsAg的关系,HBcAg出现的阳性率与HBsAg的出现密切相关，往往HBcAg（）与HBsAg（）同时存在，而HBsAg（）时不一定会出现HBcAg（）。抗-HBs的出现并不标志着HBV复制的中止，而是复制水平减低。不能以HBsAg阴性就排除HBV感染，临床上HBsAg阴性的患者，只要HBcAg检出阳性，说明仍有乙型肝炎病毒复制。以往认为血清中仅HBsAg阳性者，病毒为非复制相，无传染性，但这种患者中，也有检测出HBcAg、HBV DNA阳性者，故判断单项血清HBsAg阳性者的传染性时应慎重。,2.1.3血HBcAg与e系统的关系,HBeAg阳
10、性是HBV持续高水平复制和传染性强的标志，其与HBcAg、HBV DNA密切相关，并具有明显的平行关系。多年来，一直认为e抗原是复制标记物，由于HBeAg是HBcAg的降解产物，以可溶性蛋白形式存在，在结构上不及HBcAg与病毒颗粒关系密切，对判断病毒复制、评估传染性不及HBcAg敏感可靠。,2.1.3血HBcAg与e系统的关系,一般认为，当HBeAg/抗-HBe转换后，HBV复制趋于减少，没有传染性或传染性很小。HBeAg被公认为是HBV复制的标志物。但部分阴性者HBeAg的血清中仍可检出HBcAg和（或）HBV DNA，说明HBeAg的表达可能不是HBV复制的必然结果，对HBeAg阴性感染
11、者的带毒状态及抗-HBe表达的临床意义必须重新认识，不能忽视其具有传染性的可能。,2.1.4血HBcAg与HBV DNA、HBV DNA-P的关系,在慢性乙型肝炎患者中，血HBcAg与血HBV DNA有很好的相关性；而在急性期，尤其是在肝损害极期时，往往血HBcAg阳性，而血HBV DNA阴性，考虑为HBcAg从受免疫损伤的被感染的肝细胞内释放入血，这种情况甚至在病毒已终止复制后也可出现。对HBsAg慢性携带状态患者，判断HBV复制及传染性，HBcAg的敏感性最高，HBV DNA和HBV DNA-P次之，HBeAg敏感性低。,2.1.5不同肝病的检出率,慢性活动性肝炎中血HBcAg阳性率明显高
12、于ASC（无症状病毒携带者），说明血HBcAg阳性较多见于病变活动较重的慢性肝炎而较少见于病变较静止的ASC。血清中的HBcAg阳性与肝脏病变活动程度有关，且对估计预后有很好价值。HBcAg检出结果是：肝硬化慢性乙型肝炎中型慢性乙型肝炎轻型。,2.1.6检测血HBcAg的临床意义,（1）对血液内HBV的开壳处理，能直接检测HBcAg，能比HBeAg更客观地反映血HBV的存在，以及作出数量多少的判断，可替代HBeAg而作为病毒复制和传染性的敏感指标，是病毒存在的直接标志。它与HBV复制标志呈正相关，可以反映HBV活动的复制程度。HBcAg与乙型肝炎病毒其他五项标志物相比更是反映HBV复制的直接证
13、据。它可与其他的HBV血清学标志物起到相互配合和相互补充的作用。,2.1.6检测血HBcAg的临床意义,（2）有助于对乙型肝炎病情和预后的判断，HBcAg感染的肝细胞是细胞免疫效应攻击的靶细胞，肝细胞溶解后HBcAg可直接释放入血，故能直接反映肝细胞损害和病情进展的程度。在急性乙型肝炎早期HBcAg亦达高峰值，而且病情严重者的HBcAg水平也相应提高。慢性乙型肝炎患者，血HBcAg阴性者比阳性者有明显的临床及生化指标的改善。HBcAg含量与肝脏损害的情况有关，有助于抗病毒药物及免疫治疗的疗效评价。,2.1.6检测血HBcAg的临床意义,（3）从理论上讲，聚合酶链反应（PCR）检测法比固相放射免
14、疫法灵敏度高，但实际上可出现HBcAg阳性而HBV DNA阴性的结果。因此，两种检测方法可以互补使用，以减少漏检。在不具备PCR检测条件的单位，以酶联（ELISA）法试剂盒在检测血清HBV五项标志的同时，检测HBcAg不仅能进一步了解病毒的复制情况，还可了解肝细胞损害和病情进展的程度，且检测费用低廉，有临床实用价值。,2.1.6检测血HBcAg的临床意义,（4）在对献血员的筛选中，单凭HBsAg的测定来判断是否受HBV感染也是不够的，会漏诊HBsAg阴性而HBcAg和抗-HBc阳性的乙型肝炎患者，只有三者同时检测，才能更好地诊断乙型肝炎并防止在输血中传播，降低输血后肝炎的发生率。,2.2肝组织
15、HBcAg 2.2.1分布,HBcAg主要存在于HBV颗粒和受染的肝细胞中，HBV复制时HBcAg表达于肝细胞内，分胞核型、胞质型和胞膜型。Delladetsima et al发现胆管上皮细胞也是HBV的适合宿主，HBV能够在其中复制并表达HBcAg和HBsAg抗原。,2.2.2肝内HBcAg与HBV DNA关系,肝内HBcAg与HBV DNA的分布区域常较一致，有的肝细胞可同时检出HBcAg和HBV DNA，但多数HBV DNA（）肝细胞并不同时含有HBcAg。HBV高复制期HBcAg以胞核表达为主，无或很少在胞质内表达；而低复制期时相反，HBcAg在肝细胞核内而不是细胞质内的表达程度能够精
16、确地反映慢性乙型肝炎患者的病毒复制水平。肝HBcAg与血清HBV DNA水平呈正相关。经干扰素治疗后的慢性活动性乙型肝炎患者，HBcAg发生从核内向胞质的转换。,2.2.3肝内HBcAg与HBeAg关系,HBcAg与HBeAg常同时表达在肝细胞内，但在亚细胞水平有重要差异。在病毒活跃复制的ASC，常有较强的HBcAg胞核表达和HBeAg胞质表达；活动性慢性乙型肝炎时常有HBcAg的胞质表达，因免疫清除而病毒减少，难以检出HBeAg。作为免疫攻击的靶抗原，HBeAg不及HBcAg重要。,2.2.4肝内HBcAg与肝组织炎症活动关系,血清HBV DNA、HBeAg和定位于核内的HBcAg都与肝组织
17、的损害程度无关。慢性HBV感染者肝组织中浆膜型HBcAg的表达强度随肝组织病变活性积分（HAI）评分值的增高而增强，HAI评分值低者核型HBcAg的表达增强。HBcAg在核内或胞质内同时表达的其“炎症活动指数”高于HBcAg在胞质内和膜内表达。,2.2.4肝内HBcAg与肝组织炎症活动关系,光镜下发现浆膜型HBcAg多分布于碎屑样坏死及灶性坏死区，浆膜型HBcAg阳性肝细胞常有各种变化，或明显萎缩，或肿胀变形。增生胞核抗原（PCNA）是再生肝细胞的标志，代表肝组织的炎症活性，PCNA与胞质HBcAg表达程度正相关，但不是胞核型HBcAg的独立影响因素。发生前-C区突变的HBV与未发生突变的野生
18、株相比HBcAg在胞质内表达显著增高，并伴有较明显的肝组织炎症活动。HBcAg在胞质内表达预示预后不良。,2.2.4肝内HBcAg与肝组织炎症活动关系,乙型肝炎引起的肝硬化肝组织中HBcAg、HBV DNA的阳性率较高。HBcAg颗粒在肝组织中主要呈弥漫的浆膜型分布，HBcAg和HBV DNA呈浆、膜型分布者，其肝组织中HBV DNA表达程度、炎症活动度和纤维组织增生程度，明显较呈核型分布者高。HBcAg及HBV DNA阳性的肝组织，炎症活动明显，界面呈碎屑坏死，灶性坏死。,2.2.4肝内HBcAg与肝组织炎症活动关系,观察肝内颗HBcAg粒的分布类型，有助于判断HBV在肝组织中的复制状况；肝
19、组织病变的活动程度。这可能是由于机体对呈浆、膜型分布的HBcAg和HBV DNA具有更加强烈的免疫反应，将肝内含活跃复制的HBV DNA和靶抗原HBcAg表达的肝细胞溶解破坏，以清除病毒所致。,2.2.5合并丁型肝炎时，肝内HBcAg表达特点,HBV合并HDV感染者的肝组织中，HBcAg和HDAg阳性细胞分布关系不密切，HBcAg阳性细胞明显少于HDAg阳性细胞，HBcAg主要呈核型表达，胞质中阳性颗粒较少见到，表达强度也较弱，表明HDV感染者HBV是低水平复制，HDV可能有抑制HBV基因复制或病毒抗原表达的作用，特别是在HDV复制活跃的阶段，即HDAg大量表达时，HBV复制受到的抑制最为明显
20、。,2.2.6儿童肝内HBcAg表达特点,儿童肝内HBcAg主要表达于核内。肝内HBcAg呈弥漫性分布者，多见于10岁以内的较小儿童；而呈局灶性分布者，多见于10岁以上的较大儿童，HBcAg呈局灶性分布比弥漫性分布者，ALT水平较高并伴有较明显的肝脏炎症活动。在儿童慢性乙型肝炎患者中，肝内HBcAg呈弥漫性分布者为病毒感染早期，HBcAg呈局灶性分布并伴随HBeAg阳性者为疾病短期内进展的标志。,2.2.7肝组织HBcAg检测的应用价值,（1）检测肝组织HBcAg有助于确定乙型肝炎病原学诊断，尤其是对于血清乙型肝炎病毒标志物阴性病例，在病原学诊断中弥补血清学诊断乙型肝炎的不足。,2.2.7肝组
21、织HBcAg检测的应用价值,（2）有助于评估肝细胞坏死炎性活动的程度及病变发展的趋向，推测慢性乙型肝炎的预后。肝细胞内HBcAg转阴和肝细胞坏死病变减轻具有一致性。HBcAg浆膜型者显示此种一致性，而核型则否，可能由于肝细胞质、膜上的HBcAg作为靶抗原易受到杀伤性了淋巴细胞的攻击，导致肝细胞损害，而核型HBcAg则不具有此种作用。,2.2.7肝组织HBcAg检测的应用价值,（3）HBcAg检测也是判断HBV复制状态的一项重要指标，肝组织HBcAg与HBV DNA两种病毒复制标志物相关。研究结果证实肝组织HBcAg检测具有多种实用价值，值得推荐。,2.3其他组织的HBcAg表达,国内学者对乙型
22、肝炎孕妇所分娩的死胎进行研究，发现HBcAg在多种脏器内均可表达，其中以肺、肝、肾脏、脐带为最高，胸腺、心脏、脾、胎盘次之，大脑最低。说明HBV有可能在多种组织内复制并表达抗原。这可能是HBV通过产妇传播，导致新生儿乙型肝炎的高发病率、新生儿发育不良和死亡的重要因素。,3 小结,总之，充分认识HBcAg的生物学特点和其在血液、肝组织内表达的规律，有助于我们通过对HBcAg的检测而正确判断是否有HBV的复制以及复制的强度，正确评估肝病活动及肝组织损害的程度，从而指导制定有效的治疗方案。对HBcAg的强免疫原特性的认识，可以指导我们研制更有效的预防或治疗乙型病毒性肝炎的疫苗。,4 HBcAg的EL
23、ISA法检测 4.1试剂,HBcAg ELISA试剂由北京美迪科生物技术有限公司提供，试剂主要包括HBsAb包被板、HBcAg包被板、开壳剂、HBcAb-HRP结合物、底物液TMB等。,4.2 步骤,（1）标本处理：取血清检测。 （2）乙肝病毒Dane颗粒的分离。将HBsAb包被板用蒸馏水洗2次并拍干，每孔加样本、阴阳性对照血清各100ul（空白对照孔不加），用封片纸封好，45温育30分钟，弃去孔内液体并用蒸馏水洗7次并拍干。 （3）加开壳剂释放出HBcAg。将上述的HBsAb包被板每孔加入100ul开壳剂（空白对照孔不加），置45温育30分钟。,4.2 步骤,（4）中和抑制法检测HBcAg。
24、将上述的HBsAb包被板每孔中的开壳液转移50ul至相应的已用蒸馏水洗2次并拍干的HBcAg包被板中（注意每份样品要更换一个吸头，以防交叉污染），然后每孔加入HBcAb-酶结合物50ul（空白对照孔不加），混匀并封板，置45温育30分钟，弃去孔内液体并用蒸馏水洗7次并拍干。,4.2 步骤,（5）显色。将上述的HBcAb包被板每孔中加底物液A、B各50ul，混匀，室温放置10-20分钟。每孔中加入终止液（2MH2SO4）50ul，混匀，选择波长450nm，空白孔调零，上酶标仪测OD值。 （6）结果判定。Cutoff值（界限值）=阴性对照OD均值/2.1。标本OD值Cutoff值，为阳性；OD值Cutoff值，为阴性。,4.2 步骤,（5）显色。将上述的HBcAb包被板每孔中加底物液A、B各50ul，混匀，室温放置10-20分钟。每孔中加入终止液（2MH2SO4）50ul，混匀，选择波长450nm，空白孔调零，上酶标仪测OD值。 （6）结果判定。Cutoff值（界限值）=阴性对照OD均值/2.1。标本OD值Cutoff值，为阳性；OD值Cutoff值，为阴性。,谢谢,