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1、让我们从认识真菌开始 -念珠菌、隐球菌、曲霉菌的生物学特性及致病特点,上海交通大学医学院 附属瑞金医院 临床微生物科，医院感染控制科 倪语星,什么是重症医学科感染常见的病原体？,铜绿假单胞菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,大肠埃希菌,鲍曼不动杆菌,真菌,阴沟肠杆菌,重症医学科有哪些真菌感染问题？,念珠菌,合并多种高危因素,难以诊断,常常需要预防性治疗,病情复杂多样,曲霉菌,侵袭性,概述,重症医学科患者是侵袭性真菌感染的易感人群,重症医学科患者的特点,呼吸机使用的比例显著高于普通病房,广谱抗生素使用的比例及种类显著高于普通病房,合并严重疾病的患者比例显著高于普通病房,患者易出现粘膜屏障功能的破坏，易
2、出现肠道功能障碍,侵入性诊断和治疗手段的应用显著高于普通病房,这些都是侵袭性真菌感染的高危因素,真菌与细菌的区别,真菌属真核细胞，有细胞器和细胞核。细胞膜含固醇，细胞壁不含肽聚糖 细菌是原核生物，无细胞器和细胞核。 细胞膜不含固醇，细胞壁含肽聚糖,真菌细胞基本结构,细胞壁,细胞核 （遗传物质）,细胞质,细胞膜（固醇）,真菌按病原菌生长形态特性分类,双相样真菌,霉菌(molds),类酵母样菌,真菌的分类,在组织内菌丝为主，培养基上产生类似葡萄球菌的菌落 以出芽方式繁殖，如：念珠菌,菌落形态可产生分枝丝状菌丝体 如：曲霉菌、毛霉菌,组织胞浆菌 球孢子菌 皮炎芽生菌,酵母菌(yeasts),单细胞真
3、菌，呈圆形或卵圆形 如:隐球菌、毛孢子菌,一、念珠菌的生物学特性,念珠菌属是重症医学科IFI最常见病原体,医学重要酵母菌分类,白念珠菌(检出率最高) 近平滑念珠菌 热带念珠菌 光滑念珠菌 克柔念珠菌 季也蒙念珠菌 葡萄牙念珠菌,念珠菌属,A,非念珠菌属,B,隐球菌属(检出率最高) 毛孢子菌属 酵母属,10%KOH直接镜检/染色后镜检:直接镜检法简便、快速、实用 孢子：圆形或卵圆形，外观像酵母菌，革兰染色阳性，但着色不均匀 假菌丝/菌丝：假菌丝无隔、无分支，假菌丝节间有明显的狭窄部，某些菌种偶尔可见到分隔的真菌丝，孢子往往集中于菌丝分隔处,念珠菌属的形态学特点：直接镜检,孢子往往集中于菌丝分隔处
4、,念珠菌属的形态学特点：电子显微镜,假菌丝,孢子,孢子 假菌丝,念珠菌属可以出现假菌丝和真菌丝，但并不是所有的念珠菌种都有真假菌丝,假菌丝,真菌丝,芽管,热带念珠菌,白念珠菌,近平滑念珠菌,光滑念珠菌,只有白念珠菌具有 产生芽管的能力,白念珠菌在组织内常呈菌丝体，与孢子相比，不易被吞噬，因此其致病性增加，其他念珠菌形成菌丝能力弱，故致病力也相对较弱,念珠菌属真假菌丝的问题,念珠菌属的微生物学特点,光滑念珠菌 不能产生真假菌丝,Negri M et al. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 2012 Jul;31(7):1399-412.,挑取培养后的菌落进行镜检
5、可以为区分不同的念珠菌种提供一些线索,白念珠菌：镜检有成群的孢子及假菌丝 在米粉琼脂或玉米粉吐温琼脂培养基上接种培养24h可见真菌丝、假菌丝、孢子及很多顶端圆形的厚壁孢子，后者是鉴定白念珠菌的主要依据,光滑念珠菌：单个菌体一般近似卵圆形，与红细胞大小相似 光滑念珠菌为单相型，缺乏形成芽胞和菌丝的能力。因此，它具有的一个特殊形态学特征是成群孢子，其中某些菌体正处在出芽状态,厚壁孢子,念珠菌属的形态学特点：培养后镜检,念珠菌属的菌落特点,念珠菌属的菌落大而厚，圆形，光滑湿润，粘性，颜色单调,白念珠菌在SDA上的菌落特征(3-5d),热带念珠菌在SDA上的菌落特征(3-5d),念珠菌属的显色培养帮助
6、明确菌种,徐红 等.中国真菌学杂志.2006 Oct;1(5):304-307.,根据酶底物法，通过显色来区别不同念珠菌，37培养48小时后，有四种念珠菌可以得到鉴定： 白念珠菌菌落显翠绿色 热带念珠菌菌落显蓝灰色或铁蓝色 光滑念珠菌菌落显紫色 克柔念珠菌菌落显淡粉色 其它念珠菌显白色,CHROM-琼脂色原底物培养基：有助于从单种培养标本(例如尿液或血液)识别多种不同酵母菌型念珠菌,二、曲霉的生物学特性,医学重要的霉菌分类,医学重要的霉菌分类,烟曲霉(检出率最高) 黄曲霉 黑曲霉 土曲霉 构巢曲霉,曲霉属,A,非曲霉属,B,接合菌 镰刀菌属 暗色孢霉等,曲霉的基本结构 菌丝：有隔，多细胞，有分
7、枝；足细胞（接触培养基的部分，厚壁而膨大） 分生孢子梗：从足细胞直立生长 顶囊：孢子梗顶端膨大，半球形或椭圆形 小梗：顶囊上，辐射状，一层或二层杆状 分生孢子：小梗顶端，成串，球形，不同颜色 分生孢子头：菊花样的头状结构,分生孢子头与足细胞是曲霉的特征性结构,曲霉直接镜检生物学特征,直接镜检形态学特点：分生孢子头顶囊球形或近球形，小梗分布于顶囊表面，呈放射状排列,黄曲霉,黑曲霉,土曲霉,烟曲霉,曲霉菌属的形态学特点,黄曲霉,黑曲霉,土曲霉,烟曲霉,菌落特点：菌落大、疏松、干燥、不透明，多呈绒毛状、絮状或网状，可通过菌落颜色鉴别菌种,镜检,培养,三、隐球菌的生物学特性,隐球菌直接镜检生物学特征,
8、圆形或卵圆形，菌体直径215m，革兰染色阳性 菌体外有宽厚荚膜，荚膜比菌体大13倍，折光性强，一般不易染色，常用墨汁负染色法可见圆形的菌体，外绕一较宽阔的空白带(荚膜) 菌体常有出芽，但无真、假菌丝,新型隐球菌各种染色后镜检特点,GMS,葡萄蛋白胨琼脂培养基：25或37 培养,咖啡酸培养基(CAA):37培养,2-5 天即长出乳白色黏液性菌落，表面有蜡样光泽，颜色由乳白、奶油转桔黄,隐球菌的菌落特点,沙氏培养基：室温或37培养,3-4天可见菌落长出生成酵母型菌落，初呈白色，1周后转淡黄或棕黄、湿润粘稠，状似胶汁,经过24-72小时培养； 用于鉴定新生隐球菌；,徐红 等.中国真菌学杂志.2006
9、 Oct;1(5):304-307.,结果阳性的判定在无菌部位和带菌部位意义不同,直接镜检法,在无菌体液的直接镜检中发现真菌常可确立深部真菌病的诊断,但在有菌部位只有发现大量真菌菌丝才具有诊断意义,培养检查法,培养出肯定的致病菌如新生隐球菌或组织胞浆菌时,可确立感染的存在,如果分离出条件致病菌如白念珠菌或烟曲霉菌时,应结合临床情况进行判断,从无菌部位如血液或脑脊液中分离出条件致病菌常提示肯定的感染,但对来自于脓、痰或尿的标本则应谨慎解释结果,单靠一次培养阳性往往不能确定诊断,镜检及培养的重大意义,直接镜检法和培养法是真菌学检查的基本方法,直接镜检法简便、快速、实用 阳性结果可提示真菌感染 但阳
10、性率较低,阴性结果不能排除诊断,培养法： 进一步提高检出的阳性率 验证直接镜检的结果 同时确定致病菌的种类,但所需时间较长,应强调直接镜检与培养检查相结合的重要性,四、三种重要的病原真菌的致病特点,念珠菌的致病特点： 血流感染，易播散,感染途径：多为内源性感染，定植部位的菌体直接由酵母相转变为菌丝相，一旦发生念珠菌血症，菌体及孢子可播散至全身其它器官 致病特点：主要引起念珠菌血症，导管相关血流感染等，易经血行播散，累及全身其它器官 临床： 血液和无菌体液培养，也可以留取肺部合格标本多次送检 不要把浅部念珠菌感染与深部念珠菌感染完全割裂开来，重症感染患者如果疑似深部念珠菌感染，要注意有没有如口腔
11、、尿路、皮肤等浅部感染,以念珠菌最为常见，念珠菌属已经成为美国院内血流感染第4位致病菌，检出率达到9%，念珠菌血流感染死亡率高达39.2%,泌尿系统,腹腔感染,呼吸系统,真菌血流感染,念珠菌感染可累及患者各个部位,其它部位,外科手术 侵入性操作及导管留置 外伤/烧伤 ,人体正常屏障破坏或功能丧失,人体免疫功能受损,应用免疫抑制剂 肿瘤患者放化疗 器官移植后 血液系统恶性肿瘤 ,念珠菌定植,念珠菌感染,念珠菌病的发病机制,原因分析： 念珠菌广泛定植于人体上呼吸道、胃肠道及泌尿生殖道等体腔 正常屏障破坏、免疫功能受损或局部菌群失调可使得定植在这些带菌部位的念珠菌生长繁殖直接造成感染,应用广谱抗生素
12、,菌群失调,念珠菌感染各个部位均易累及：原因分析,曲霉的致病特点： 强烈的嗜血管性,感染途径：曲霉孢子随气流飘荡，易被吸入肺中，可造成过敏和局限性肉芽肿，还可在肺内形成曲霉球和空洞 致病特点：曲霉菌具有强烈的嗜血管性，其菌丝侵入血管壁，形成栓塞，导致器官的梗塞、出血甚至坏死 典型的影像学表现：侵袭性肺曲霉感染的病理基础是曲霉侵犯肺小血管，形成出血性肺梗死，可以出现典型的影像学表现 临床：主要靶器官为肺脏，易在靶器官内形成严重损害,何礼贤 等.侵袭性肺真菌病影像学图集,一项前瞻性、随机对照研究中纳入了277例确诊或临床诊断侵袭性曲霉感染患者(12岁)结果发现超过80%的侵袭性曲霉感染仅发生在肺部
13、,*,*包括脑和其他部位同时侵犯病例； 不包括脑侵犯病例,Herbrecht R, et al. N Engl J Med. 2002;347(6):408-415.,曲霉菌感染主要累及肺部,孢子形成,吸入空气播散的分生孢子,纤毛细胞,基底膜,肺防御力降低时分生孢子萌发,气管管腔,非粒缺患者：类固醇诱导性免疫抑制： 单核细胞(中性粒)聚集，炎症反应，组织损伤,中性粒细胞缺乏： 菌属过度生长，播散感染,Dagenais TR, Keller NP. Clin Microbiol Rev. 2009;22(3):447-465.,原因分析：吸入为主要感染途径,曲霉菌感染主要累及肺部：原因分析,隐球
14、菌致病特点： 肺部吸入，中枢最易受累,感染途径：经肺部吸入孢子是隐球菌的主要感染途径，其它感染途径还包括创伤性皮肤接种和吃进带菌食物等 致病特点：隐球菌不形成菌丝与孢子、不产生毒素，可逃避体内免疫追杀，感染不引起组织破坏、出血、梗死或坏死，侵袭性肺隐球菌病临床常常隐匿起病，且半数以上合并中枢感染 临床： 最易累及部位为中枢，呼吸道标本检出隐球菌，密切观察中枢神经系统 鸽粪是新生隐球菌临床感染的重要来源，可以询问一下鸽粪接触史,何礼贤 等.侵袭性肺真菌病影像学图集,感染途径： 吸入空气中的孢子，此为主要途径； 创伤性皮肤接种； 吃进带菌食物，经肠道播散全身引起感染,32,主要累及中枢神经系统，也
15、可以累及肺部 仅新生隐球菌及其变种具有致病性,Kethireddy S, et al. Drug Metab Toxicol. 2007;3(4):573-81,隐球菌致病特点：主要累及CNS及肺部,吸入空气中的孢子,隐球菌感染主要累及CNS及肺：原因分析,吸入空气中的孢子,在体内能逃避免疫追杀： 隐球菌抗原能够抑制或下调体液与细胞免疫反应 隐球菌荚膜多糖可封闭吞噬细胞的识别系统，从而抑制吞噬作用 荚膜物质也可抑制趋化反应,易侵犯中枢神经系统的原因： 脑脊液中缺乏抗体； 脑脊液中缺乏补体激活系统； 脑脊液中的多巴胺有利于隐球菌生长,注：荚膜作为新生隐球菌毒力的主要决定因素，有抵抗吞噬和下调免疫
16、反应的双重作用 在肺部环境中，新生隐球菌可迅速合成荚膜，使肺泡巨噬细胞对其摄取，吞噬能力减弱,何礼贤 等.侵袭性肺真菌病影像学图集,内容总结,临床常见病原真菌：念珠菌、曲霉菌、隐球菌 直接镜检与培养是鉴别真菌感染的经典方法 念珠菌感染常常为内源性，致血流感染，易引起播散； 曲霉菌具有强烈的嗜血管特性，主要侵犯肺部； 隐球菌能逃避免疫攻击，在肺部常隐匿起病，易侵犯中枢神经系统,五、抗真菌药物的临床应用,抗真菌药物分类,多烯类 两性霉素及其脂质基制剂、制霉菌素、灰黄霉素等 吡咯类 克霉唑、咪康唑、酮康唑、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、泊沙康唑 氟胞嘧啶 5-氟胞嘧啶 烯丙胺类 萘替芬、特比萘芬、布特
17、萘芬 棘白菌素类（-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂） 卡泊芬净（Caspofungin）、米卡芬净（micafungin）、安尼芬净(anidulafungin),抗真菌药物作用位点, (1,3)-D-葡聚糖合成,棘白菌素类,常见抗真菌药物体外抗菌活性比较,真菌 AMB FCZ ITZ VCZ PCZ CF MF AF,白念珠菌 热带念珠菌 近平滑念珠菌 克柔念珠菌 光滑念珠菌 新生隐球菌 荚膜组织胞浆菌 皮炎芽生菌 粗球孢子菌 巴西副球孢子菌 卡氏肺孢子菌 曲霉 镰刀霉 毛霉 根霉,棘白菌素类,三唑类,抗真菌治疗药物选用原则,根据药物特性、抗菌谱、病原菌和本地区流行趋势，病原学诊断依据; 遵循指
18、南和循证医学证据; 兼顾药物经济学因素； 调整药物时应以临床症状改善、真菌学清除为主要依据，参考体外药敏结果。,棘白菌素类抗菌谱,Highly active Candida albicans, Candida glabrata, Candida tropicalis, Candida krusei Candida kefyr Pneumocystis carinii (Pneumocystis jiroveci ) Low MIC ,with fungicidal activity and good in-vivo activity.,Very active Candida parapsilo
19、sis Candida gulliermondii Aspergillus fumigatus Aspergillus flavus Aspergillus terreus Candida lusitaniae Low MIC, but without fungicidal activity in most instances.,Some activity Coccidioides immitis Blastomyces dermatididis Scedosporium species Paecilomyces variotii Histoplasma capsulatum Detectab
20、le activity, which might have therapeutic potential for man (in some cases in combination with other drugs).,念珠菌与棘白菌素类,新IDSA指南中强调了棘白菌素类在治疗严重IC患者和唑类暴露患者中的作用； CLSI 最近为棘白菌素类设立的临床折点是2 g/ml； 这一折点是否会包含可能与耐药有关的fks 突变菌株？,Garcia Effron, et al. Antimicrob Agents Chemother. 2009;53:112.,Anidulafungin,Caspofung
21、in,Micafungin,棘白菌素类对5,346 例IC 分离菌株的MIC 值分布,Pfaller et al. JCM 2008;46:150.,棘白菌素类对5,346例IC分离菌株的MIC值分布,棘白菌素类对念珠菌的MIC分布,ECV for most Candida species,Clinical breakpoint,N=5346,Pfaller et al. JCM 2008;46:150.,MIC (micrograms/mL),棘白菌素类对白念珠菌的MIC分布,N=4266,棘白菌素类对近平滑念珠菌的MIC分布,N=1234,三种棘白菌素类药物对不同曲霉的体外抑菌活性,Thank You !,