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1、第三章 核酸的结构与功能,第一节、核酸的结构,第二节、核酸理化性质,第三节、真核生物的染色体 及其组装,一、 核酸的组份,基本结构单位：核苷酸（碱基、戊糖和磷酸） 碱基：尿嘧啶（Uracil, U） 胸腺嘧啶(Thymine, T) 胞嘧啶(Cytosine, C) 腺嘌呤(Ademine, A） 鸟嘌呤（Guanine, G） 次黄嘌呤、稀有碱基 DNA：A、T、G、C RNA：A、U、G、C 戊糖：核糖（RNA）、脱氧核糖（DNA）,第一节、核酸的结构,Comparisons of names of bases, nucleosides and nucleotides,Purine: A
2、(deoxy)-ribose,Nitrogenous bases,Bicyclic purines:,Monocyclic pyrimidine:,Thymine (T) is 5-methyluracil (U),核苷：戊糖的半缩醛羟基与碱基中的氢失水缩合成N-糖苷键而形成核苷， 核苷酸：核苷的5-位羟基与磷酸通过酯键形成5-核苷酸，不同的核苷酸用碱基第一个字母来命名。 嘌呤和嘧啶：都是含氮杂环化合物，弱碱性，难溶于中性水溶液。杂环上的氮等参与氢键的形成。,Adenosine, guanosine, cytidine, thymidine, uridine,R,Ribose or,2-deo
3、xyribose,Nucleosides,In nucleic acids, the bases are covalently attached to the 1 position of a pentose sugar （戊糖）ring, to form a nucleoside,Glycosidic (glycoside, glycosylic) bond (糖苷键),Nucleotides,A nucleotide is a nucleoside with one or more phosphate groups bound covalently to the 3-, 5, or ( in
4、 ribonucleotides only) the 2-position. In the case of 5-position, up to three phosphates may be attached.,Deoxynucleotides (deoxyribose containing),Ribonucleotides (ribose containing),Phosphate diester bonds,二、多核苷酸链,结构：由核苷酸通过3，5-磷酸二酯键连成的线型分子。 骨架：由磷酸和2-脱氧核糖构成，碱基为侧链 规定：多核苷酸链以连接于5-羟基的磷酸开始，以脱氧核糖的3-羟基终止。
5、 表示：pGpCpApT或pGCTA。,Phosphodiester bonds,DNA/RNA sequence: From 5 end to 3 end Example: 5-UCAGGCUA-3 = UCAGGCUA,3 end: free hydroxyl (-OH) group,5end: not always has attached phosphate groups,三、DNA的双螺旋结构,1953年Watson-Crick发表DNA双螺旋模型之前，人们已经取得的结果：,1、Chargaff(1949)证实不同物种DNA中A=T，G=C，A+G=T+C，物种之间DNA的不同在于（
6、A+T）：（G+C）的比例不同。,2、 MH Wilkins制作了高质量的DNA x-衍射图像，根据该图可推测DNA的分子结构和原子间距，但Wilkins并未对该图做出DNA为双螺旋结构的推论。,伦琴拍的第一张X射线图，1901年诺贝尔奖第一次颁发就给他,用了1年半的时间拼出了双螺旋模型,伦敦威尔金斯（Maurice Wilkins）、富兰克林（Rosalind Elsie Franklin）X射线衍射法做出的DNA晶体结构；三人获1962年诺贝尔物理奖,DNA双螺旋模型特征：,1、 DNA分子是由两条多核苷酸链围绕一个中心轴盘绕而成，两条链方向相反，一条为5-3，另一条为3-5。,2、两条链
7、为右手螺旋。,3 、脱氧核糖和磷酸构成双螺旋的主链、亲水，4种碱基的排列顺序因物种不同而不同，位于双螺旋的内部，疏水，导致DNA形成右手螺旋，二条多核苷酸链依靠碱基的氢键联系。每个螺旋含10个碱基，螺距34 ，相邻碱基对的间距为3.4 。,4、双螺旋中，A与T配对二个氢键，G与C配对三个氢键,5 、相邻的二个碱基对不在同一位置（由于脱氧核糖中连接碱基的C并不正好处在螺旋的相对位置上），使二条链与中心轴的间距不同，在DNA双螺旋的表面形成大沟和小沟，酶等大分子自大沟进入，进行复制，调控等,DNA double helix,Two separate strands Antiparellel (53
8、 direction) Complementary (sequence) Base pairing: hydrogen bonding that holds two strands together,Essential for replicating DNA and transcribing RNA,Sugar-phosphate backbones (negatively charged): outside Planar bases (stack one above the other): inside,中关村环岛的雕塑-DNA双螺旋,Base pairing via hydrogen bo
9、nds,Double helix B form: Right-handed 10 base pairs/turn 34 /turn Diameter: ca. 20 Other forms: A: 11 bases/turn, base plate 20 slant Z: 12 bases/turn, left-handed helical, one groove,C1 Nucleic Acid Structure,四、DNA双螺旋结构的多态性,1、 A-DNA和B-DNA,溶液中天然DNA多为B型，离体时使B型DNA脱水，可变为A型。 体内DNA-RNA、RNA-RNA双螺旋是 A型，这种现
10、象称为DNA结构的多态性（polymorphism） ，B-DNA是基本构象，最稳定。,DNA结构多态性的原因：多核苷酸链的骨架含许多可以转动的单键：磷酸二酯键的两个O-P键上，N-苷链也可转动，使糖环和苷键出现不同的构象。,2、 Z-DNA,美籍华人科学家王惠君和Rich研究寡核苷酸d（CG）x3的x射线分析后发现的（1979）。,当溶液中Na+为高浓度，使DNA磷酸基上的负电荷全部被中和时，B-型DNA变为Z型DNA，左手双螺旋，由于Z-DNA中戊糖-磷酸链在螺旋外的走向呈“Z”型，故名。 在实验室中，由不少于6bp的交替嘌呤-嘧啶序列形成；Z-DNA可能存在于基因表达的调控有关区。,五、
11、RNA 二级结构,单链，没双链DNA样的双螺旋结构,通过分子内部的氢键作用和碱基堆积形成局部区域的双螺旋结构.,tRNA (clover-like),Ribozyme RNA,rRNA,图、 成熟rRNA二级结构及核糖甲基化位点( Bachellerie J P, et al, 1997, TIBS). Fig Location of ribose-methylation sites in the secondary structure of mature rRNAs.,28S rRNA,六、重复序列,真核中有许多，据重复程度，分为三类：,一、高度重复序列（highly repetitive
12、sequence），2-10bp，在基因组可重复105-107次，高度集中，多在异染色质中，特别是着丝粒和端粒处，占基因组的1%-50%，平均15%，高度重复序列中G-C含量与细胞总DNA的G-C含量不同，在CsCl2密度梯度离心时可显示出额外的小峰，称卫星峰，这些DNA称卫星DNA。 其功能不完全清楚。 5-ACAAATT-3 5-ACAAACT-3 5-ATAAACT-3,5 ATAAACTATAAACTATAAACT 3 3 TATTTGATATTTGATATTTGA 5,Drosophila virilis satellite DNA repeat (several million c
13、opies),n,ACAAACT, 1.1x107 bp, 25% genome ATAAACT, 3.6x106 bp, 8% genome ACAAATT, 3.6x106 bp, 8% genome AATATAG, cryptic Satellites comprise more than 40% of the genome,二、中度重复序列,在基因组的重复次数不如高度重复序列高，不很集中，每一基因组约含103。有rRNA和tRNA基因、组蛋白基因，中度重复序列常以迴文顺序出现在基因组，杂以单拷贝序列 -AATTGTGAGCGGATAACAATT- -TTAACACTCGCCTATTG
14、TTAA- 乳糖操纵子中的迴文结构,三、单一序列,多数蛋白质（酶）由单一序列的DNA编码的，数目在一到几个。真核生物基因组中单拷贝序列约占40-70%，其中仅有少数是编码的,四、反向重复序列,真核细胞DNA上有大量的反向重复序列，即正读和反读都是一样的序列。 即在一个假想轴的两侧，碱基序列之间有倒转重复关系，DNA变性后，倒转重复序列之间可以形成十字形结构或发夹结构。,-GCAAATTGTGAGCGGATAACAATTCTA- -CGTTTAACACTCGCCTATTGTTAAGAT-,七、超螺旋DNA,超螺旋DNA（supercoiled DNA）最初在SV40和多瘤病毒中发现 1、松弛态：
15、双螺旋B型DNA分子呈直线时为DNA松驰态，最稳定 2、超螺旋 超螺旋是DNA的三级结构的一种普遍形式，由于受力的不同，可形成两种形式，负超螺旋和正超螺旋，又称为右超螺旋和左超螺旋。,1、正超螺旋：即左旋超螺旋。 B型DNA为右旋双螺旋，如果抓住其两端并向右捻转，使两条链变紧，为解除这种张力，DNA将朝相反方向改变，形成向左的旋转，就形成了左旋超螺旋，即正超螺旋。,Lk = Lko,Relaxed closed circular,Re-join the DNA,Lk = Lko 4 Lk = -4,Break the circular DNA,Untwist 4 x 360o,twist 4
16、x 360o,Lk = Lko + 4 Lk = + 4,DNA isolated from cell negatively supercoiled by 6 turns per 100 turns of the helix. Lk / Lk = -0.06,Negatively supercoiled,positively supercoiled,溴乙锭、放线菌素D等分子扁平状，可嵌入DNA碱基间，使相邻碱基对间隔增加（0.7mm），超螺旋解旋，盘绕数减少，超螺旋向相反方向（右）旋转，为负超螺旋。,当B-DNA向松驰方向捻转时，DNA形成向右旋转的超螺旋，即负超螺旋。可见超螺旋总是向抵消初级
17、螺旋改变的方向发展。 超螺旋不仅使DNA形成高度致密的状态从而得以容纳于有限的空间中，且通过结构的转化以满足功能上的需要。 超螺旋的分离和检测：1）超速离心；2）琼脂糖凝胶电泳,2、负超螺旋的形成：,将螺旋的方向定为向上 则向左转形成正超螺旋 向右转即 负超螺旋,M: DNA/HindIII+EcoR I P：重组质粒pBSK-387bP R：重组质粒pBSK-387bP用酶切割后,第二节 DNA的理化性质,差异很大，分子量106-109，真核常在1010以上 SV40 3-106 T2或T4噬菌体 1.3x109 噬菌体 3.3x107 大肠杆菌DNA 2.2x109 流感嗜血杆菌 8-10
18、8 小鼠线粒体DNA 9.5x106 人第三对染色体 6.4x1010 DNA的长度纳米到厘米 x174为0.6 m， 果蝇巨染色体为4.0 m,一、DNA的分子大小,二、核酸的粘度,DNA分子具有很高的粘度。分子量越大其溶液的粘度越高，线形分子的粘度最大。DNA为线型，其长度与直径之比107，很稀的溶液也有极大的粘度，RNA粘度小得多。,三、核酸的沉降特性,核酸在引力场中可以下沉，超速离心测定核酸的沉降常数和分子量。RNA只有局部双螺旋，浮密度比双链DNA高，沉低；双链DNA高于蛋白质的浮密度，居中，据此可用超速离心分离。 双链DNA变性为单链，浮密度增高；单链DNA受热后，密度不变，可用超
19、速离心鉴定单、双链DNA,Buoyant density （浮力密度）,1.7 g cm-3, a similar density to 8M CsCl， =1.66+0.10 (GC)%,Purifications of DNA: equilibrium density gradient centrifugation,RNA1.89 g/cm3,Protein1.33 g/cm3,DNA1.71 g/cm3,四、核酸的紫外吸收,核酸紫外吸收峰值在260nm处，蛋白质的最大吸收值在280nm RNA浓度（g/ml）= OD260 x 40 x 稀释倍数 DNA浓度（g/ml）= OD260 x
20、 50 x 稀释倍数 测磷的含量可定核酸溶液的光密度，以每升核酸溶液中1g磷原子为标准计算核酸的消光系数，称克原子磷消光系数， e(p) e(p)=A/(CL) e(p)=30.98A/(WL) A为吸光度（光密度），L为比色杯内径，通常为1.0cm；C为每升核酸溶液中磷的摩尔数。W每升溶液中磷的重量（g),30.98为磷的原子量。 DNA的e(p)值为6000-8000，RNA为7000-10000。 核酸变性时e(p)值显著升高，称增色效应， 变性的核酸复性后， e(p)值又回复到原来水平，称减色效应。,核酸的纯度,Purity of DNA A260/A280: dsDNA-1.8 pu
21、re RNA-2.0 protein-0.5,五、核酸的酸碱性质,两个单核苷酸残基间的磷酸解离常数（即pK值，为pk=1.5）较低。当溶液pH4时，核苷酸链中的磷酸全部解离，多阴离子，核酸为多元酸，具有一定的酸性，等电点较低。 pH7.0-11.0时，DNA分子碱基对较稳定，否则DNA变性； RNA的最适PH为4-5。,六、核酸的变性、复性和杂交,（一）变性：对DNA加热时，DNA双键之间的氢键断裂的过程，称DNA的变性或叫DNA的融解。 DNA的变性的温度范围窄，伴随物理性质变化，如粘度降低、功能丧失，光吸收增加。 增色效应：DNA在260NM处紫外吸光值增加的现象。为变性指标。DNA分子有
22、紫外吸收是因为嘧啶、嘌呤碱基；变性时DNA双螺旋内的碱基充分暴露，提高了吸光值。 常把e(p)吸收值到最高值的一半的温度或吸收值增加的中点温度称“熔点温度”（melting temperature,Tm）， Tm值一般在70-85之间,Effect of Alkali & Application,DNA denaturation at high pH,keto form,enolate form,keto form,enolate form,Base pairing is not stable anymore because of the change of tautomeric (异构) s
23、tates of the bases, resulting in DNA denaturation,（酮式）,（烯醇式）,RNA hydrolyzes at higher pH because of 2-OH groups in RNA,Effect of Alkali & Application,RNA is unstable at higher pH,OH,free 5-OH,2, 3-cyclic phosphodiester,alkali,Chemical Denaturation,Urea (H2NCONH2) (尿素）: denaturing PAGE Formamide (HCO
24、NH2)（甲酰胺）and formaldehide (甲醛): Northern blot,Disrupting the hydrogen bonding of the bulk water solution,Hydrophobic effect (aromatic bases) is reduced,Denaturation of strands in double helical structure,影响Tm值的因素,1 、DNA的均一性，均质DNA熔解温度范围较小，异质的较宽,2、 G-C含量：Tm与G-C含量成正比，测定Tm值，可以推算出DNA的碱基的百分组成： G-C%=（Tm-69
25、.3）x 2.44 在Ph7.0、 0.165 M NaCl溶液中DNA的Tm值与G-C含量成正比，G-C含量越多，Tm值越高。,3、 介质中的离子强度：离子强度较低的介质中，DNA的熔解温度较低，离子强度较高的介质中，DNA的Tm值较高，且发生熔解的温度范围较小。因此，DNA制品不应保存在极稀的电解溶液中。一般1M NaCl中保存较为稳定。,（二）DNA的复性：在适当的条件下，变性DNA分子又可彼此重新缔合成双螺旋结构，这一过程称复性或退火。复性后物化性质恢复,1、DNA变性后骤然冷至低温时，不能复性。 2、缓慢冷却时，可以复性 3、变性DNA的片段越大复性越慢。 4、变性DNA的浓度越高越容易复性 5、均质的较异质的变性DNA容易复性 6、真核细胞中的重复序列，复性最快,（三）分子杂交,变性/复性理论的应用：分子杂交（即由DNA复性研究发展而成的实验技术）。 杂交可在DNA之间，或RNA之间。用于估计DNA间的同源性，进化相关性，DNA限制性片段等。,DNA：RNA杂交可经RNA转录本检测DNA中特定基因的存在。,