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1、,第2章 核酸 (nucleic acid),本章主要内容,第一节 核酸的种类、分布和化学组成 第二节 核酸的分子结构 第三节 核酸的理化性质及其应用,教学目标,1掌握DNA和RNA在组分、结构和功能上的差异。 2了解核酸的结构和它们的性质、功能的关系。 3认识核酸在生物科学上的重要性和实践意义。,1869年，瑞士外科医生Miescher从伤口绷带的脓细胞核中分离出酸性很强的物质，称为核质（nuclein)。 1944年，Avery通过肺炎双球菌转化实验证实了DNA是遗传的物质基础。 1953年，Watson和Crick提出DNA的双螺旋结构模型，从此，核酸的研究成了生命科学中最活跃的领域之一
2、。,第一节 核酸的种类、分布和化学组成,核酸与蛋白质一样，是一切生物机体不可缺少的组成部分。 核酸是生命遗传信息的携带者和传递者，它不仅对于生命的延续，生物物种遗传特性的保持，生长发育，细胞分化等起着重要的作用，而且与生物变异，如肿瘤、遗传病、代谢病等也密切相关。 因此，核酸是现代生物化学、分子生物学和医学研究的重要基础之一。,一、核酸的生物学功能,染色体是DNA的载体,DNA可通过复制遗传给下一代,DNA是主要的生物遗传物质,人体23对染色体,分别来自于父母，,生物染色体的有丝分裂(无性繁殖)、减数分裂(有性繁殖) 高等动植物是一次有性繁殖和无数次无性繁殖的结合. 实质上是DNA的复制、遗传
3、及表达。,DNA的组成差异决定了细胞中所有蛋白质、RNA的结构特征,子代利用遗传下来的DNA可以制造与父代相同的RNA、蛋白质，故种瓜得瓜、种豆得豆。 多细胞的DNA控制了细胞分化、个体形成乃至个体的生老病死。 任何一个多细胞生物的体细胞都含有完全相同的DNA。 提问：为什么人体各组织器官的细胞形状各异、功能不同？ 答案：不同细胞不同部分DNA发挥了作用（即表达）,其余DNA休眠。,Clone克隆，人工操作下的细胞无性繁殖过程。,当给予合适的条件时，任何一种体细胞都能变化为一个完整的个体体细胞克隆技术；,白 绵羊的体细胞核,黑 绵羊的去核卵细胞细胞质,植入,山羊子宫,？,多莉（1997.7.2
4、3）,克隆人,提问：为什么要克隆人？ 答案：主要是采集器官，进行器官移植； 由于不同个体器官移植时存在免疫排斥现象； 还可以复制死去的亲人。,动物克隆的目的 保持优良种性的牲畜性能不发生退化； 拯救濒危生物；,克隆人的方法,1.提供卵细胞、体细胞,2. 卵细胞去核并与体细胞融合,3. 代理母亲受孕,4.克隆婴儿的诞生,95个畸形、流产儿 + 5个早衰的克隆人,为什么各国政府均反对克隆人呢？,1.可预见的大量的畸形儿、流产儿 2.从未有过的伦理危机，动摇社会的根基家庭观、权利义务观 一旦流行开来，“父将不父，母将不母，子将不子” 但大势所趋，第一个克隆人将在一、两年内诞生这就是科学的两面性（“福
5、祸相依”）,二、核酸的种类和分布,RNA的种类、分布、功能,除了上述三种RNA外，细胞的不同部位存在的许多其他种类的小分子RNA，统称为非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。,核糖体RNA,核内不均一RNA,核内小RNA,细胞核和胞液,线粒体,功,能,rRNA,mRNA,tRNA,mtmRNA,mttRNA,HnRNA,SnRNA,SnoRNA,scRNA/7SL-RNA,核糖体组分,转运氨基酸,参与hnRNA的剪接、转运,信使RNA,转运RNA,胞浆小RNA,细胞核和胞液,线粒体,功,能,mtrRNA,蛋白质合成模板,rRNA的加工、修饰,
6、蛋白质内质网定位合成 的信号识别体的组分,核仁小RNA,含量,80 5 10-15,成熟mRNA的前体,第二节 核酸的化学组成,元素组成：C、H、O、N、P等,基本单位：核苷酸,核酸的组成,核酸,核苷酸,水 解,核 酸,代表戊糖，对DNA而言为脱氧核糖，对RNA而言为核糖；,代表碱基,代表磷酸基,核苷酸,1. 戊糖,核糖,脱氧核糖,嘌 呤,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤（G）,2. 碱基,嘌呤A、G,嘧啶 C、U、T,尿嘧啶 (U),5,1,NH,O,O,N,2,3,4,6,胞嘧啶,O,N,RNA,DNA,尿嘧啶 U,胸腺嘧啶 T,胞嘧啶 C,鸟嘌呤 G,腺嘌呤 A,稀有碱基,主要存在于RNA 甲基化、
7、氢化、硫化,嘌呤次黄嘌呤、1-甲基次黄嘌呤、 N2、N2-二甲基鸟嘌呤。 嘧啶5-甲基胞嘧啶、5-羟甲基胞嘧啶、 二氢尿嘧啶、4-巯尿嘧啶 都是基本碱基的化学修饰型,鸟嘌呤,次黄嘌呤,1-甲基次黄嘌呤,3. 核苷=戊糖+碱基,嘌呤环上的N-9 嘧啶环上的N-1,腺嘌呤核苷（腺苷）,胞嘧啶脱氧核苷,戊糖的C-1。,糖苷键,稀有核苷： 1、2-0-甲基-核糖-核苷 2、稀有碱基 DHU 3、连接方式 （假尿嘧啶核苷）,假尿嘧啶核苷（）,糖环与尿嘧啶环不是以N-C键相连，而是以C-C键相连,tRNA分子中特有的核苷,稀有核苷,4. 核苷酸=核苷+磷酸,5-核苷酸,2 ,3,核苷酸结构简式,pN,2核
8、苷酸,3核苷酸,5核苷酸,H2O,H2O,碱基,磷酸,戊糖,核苷键,酯键,HO,八种核苷酸,M/单，D/二，T/三；P-磷酸 DNA在单/二/三前加脱氧两字 如AMP称腺苷一磷酸(或腺苷酸） dAMP称为脱氧腺苷一磷酸（脱氧腺苷酸）,甲基化修饰：“m”（methy-） 修饰基团在碱基上： 写在碱基左边 修饰基团在核糖上： 写在碱基右边 右下脚：修饰基团数目 右上脚：修饰位置,m3 G,2,2,7,ATP,5.核苷酸衍生物,ATP的性质,是重要的能量转换中间体 ATP含两个高能磷酸键：水解时可释放大量自由能，推动体内各种需能反应。 ATP也是磷酰化剂：磷酰化的底物具较高能量（活化分子），是许多生
9、物化学反应的激活步骤。,环状核苷酸（cAMP）,cAMP在细胞内起传递细胞外信号的作用，被称为“第二信使” 。,第三节 核酸的分子结构,DNA分子是由核苷酸单体通过3,5-磷酸二酯键聚合而成的多核苷酸长链。包括dAMP、dGMP、dCMP、dTMP。,一级结构是指其脱氧核苷酸的排列顺序。,一、DNA的分子结构,（一）DNA的一级结构,核酸链的表示方式,3,5-磷酸二酯键,1、字母式：ACGU,2、线条式,3、结构式,脱氧核糖,（二）DNA的二级结构,1953年，J. Watson和F. Crick 在前人研究工作的基础上，提出了著名的DNA双螺旋结构模型，并对模型的生物学意义作出了科学的解释和
10、预测。,1902，E. Fischer研究糖和嘌呤而获诺贝尔化学奖。 核酸中的嘌呤和嘧啶主要由Kossel等人所鉴定。 1910，Kossel 因研究核酸的化学特性和化学组成的成就而获诺贝尔生理学奖。 1946，E. Chargaff测定了DNA碱基，提出Chargaff法则。A+G=T+C,1916 -,1928 -,1916 -,University of London London, Great Britain,Harvard University Cambridge, MA, USA,Institute of Molecular Biology Cambridge, Great Bri
11、tain,Great Britain,USA,Great Britain,Maurice Hugh Frederick Wilkins,James Dewey Watson,Francis Harry Compton Crick,DNA双螺旋结构的研究背景,碱基组成分析 Chargaff 规则：A = T G C 嘌呤碱 = 嘧啶碱,已知核酸的化学结构,DNA纤维的X-射线衍射图谱分析,Chargaff DNA碱基组成具有： 生物种的特异性； 无组织/器官特异性； 不受生长发育、营养状况及环境条件的影响。,Chargaff规则： （1）A=T （2）G=C （3）A+C=G+T (含氨基的碱基
12、总数等于含酮基的碱基总数) （4）A+G=C+T(嘌呤的总数等于嘧啶的总数),Franklin, Rosalind Elsie (1920-58), British biophysicist. Born in London, she was educated in physical chemistry at Newnham College, Cambridge. Franklin conducted X-ray diffraction studies on the structure of the DNA molecule, the carrier of hereditary informat
13、ion, while working in the laboratory of British biophysicist Maurice Wilkins. This work enabled American biochemist James Dewey Watson and the British Francis Crick to determine the helical structure of the DNA molecule.,1. DNA的二级结构提出的依据,Chargaff碱基等比规则 A=T, G=C; A+G=T+C,戊糖环与DNA分子纵轴平行，而碱基平面与轴垂直。,X-射线
14、衍射对DNA纤维的研究,1、DNA的双链绕同一轴反向平行形成右手双螺旋，并形成大沟和小沟。,2. DNA的双螺旋模型,2、 双螺旋直径2nm，每周10个碱基对，上升3.4nm，两个核苷酸之间的夹角36,2nm,3.4nm,小沟,大沟,4、两条链上的碱基遵循互补配对原则：其中A=T, GC，A+G=T+C,3、碱基位于螺旋内侧，碱基平面与纵轴垂直，碱基之间的堆积距离为0.34nm。戊糖-磷酸骨架位于双螺旋的外侧，通过3，5磷酸二酯键连接，糖环与纵轴平行。,平面图,3. DNA的双螺旋结构稳定性,稳定的作用力？ 碱基堆积力 氢键 离子键,不稳定的作用力？ 静电斥力 碱基分子内能,4. DNA的双螺
15、旋结构的多态性,Z 型 DNA左旋、细长,A型 DNA 短、左旋,B型 相对湿度92%时的DNA纤维,DNA的类型 类型 结晶状态 螺距 碱基距离 每圈 旋转 (nm) (nm) bp数 方向 A 相对湿度75% 2.8 0.256 11 右手 DNA钠盐 B 相对湿度92% 3.4 0.34 10 右手 DNA钠盐 C 相对湿度66% 3.1 0.332 9.3 右手 DNA锂盐 Z d(GCGCGC) 4.44 0.37 12 左手,5. 三链螺旋,通常是一条同型寡核苷酸与寡嘧啶核苷酸-寡嘌呤核苷酸双螺旋的大沟结合： oligo(Py) : oligo(Pu)oligo(Py/Pu),T=
16、 A : A , CG ： C+ T = A : T CG ： G,第三股与寡嘌呤之间同向平行，并按Hoogsteen配对,（三）、DNA的三级结构,DNA双螺旋通过扭曲和折叠所形成的特定构象。 包括： 不同二级结构单元间的相互作用 单链与二级结构单元间的相互作用 DNA的拓扑特征 超螺旋是DNA三级结构的主要形式。,A.真核细胞染色体的DNA念珠状三级结构,DNA的存在形式,B. 原核生物以及真核生物细胞器环状DNA的超螺旋三级结构,负超螺旋 （右手拓扑结构）,反之，则为正超螺旋 自然界通常为负超螺旋。,DNA形成三级结构及染色体的意义何在？,压缩分子空间,人体每个体细胞DNA长2m,细胞直
17、径0.1mm,细胞核0.05mm,DNA与RNA分子组成的比较,二、RNA的分子结构,一级结构是指其核糖核苷酸的排列顺序。,一级结构特点： 约由7393个核苷酸组成 分子中含有较多的修饰成分（10-20%） 3-末端都具有CCAOH的结构,（一）tRNA,tRNA是单链分子，其二级结构由部分双螺旋结构和环状突起构成三叶草叶形,氨基酸臂：由7对bp组成，富含G， 末端为CCA，接受活化AA 二氢尿嘧啶环（D环） 由812个核苷酸组成 反密码环：识别密码子 额外环：大小是tRNA分类的重要指标 假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核苷环 （T C环）,tRNA的二级结构,tRNA的三叶草型二级结构,1,2,3,
18、叶子,反密码子环,反密码子,载运氨基酸,臂,稀有碱基,四环四臂,tRNA的三级结构,tRNA的三级结构：倒“L”形,（二）rRNA,* rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA,（三）mRNA,5末端帽子结构：m7GpppNmP 3末端有多聚腺苷酸尾巴结构(polyA) 单顺反子（一条mRNA链上有一个编码区）,（1）真核细胞mRNA,真核生物mRNA的共价结构,帽子结构,m7GpppNmP,甲基化修饰：“m”（methy-） 修饰基团在碱基上： 写在碱基左边
19、修饰基团在核糖上： 写在碱基右边 右下脚：修饰基团数目 右上脚：修饰位置,帽子结构：识别翻译起始 polyA：维持mRNA的稳定性,功能,原核生物mRNA为多顺反子，无修饰碱基。 多顺反子mRNA(polycistronic mRNA)：一条mRNA链上有多个编码区,（2）原核细胞mRNA,第3节 核酸的理化性质及其应用,一、一般性质 二、核酸的紫外吸收性质 三、核酸和核苷酸的两性性质 四、核酸的变性 五、分子杂交 六、核酸的显色反应,一、核酸的一般性质,1、分子量大，两性电解质，通常表现为酸性； 2、DNA为白色纤维状固体；RNA为白色粉末状固体； 3、溶解性：均微溶于水；不溶于一般有机溶剂
20、，在70%乙醇中沉淀； 4、粘度：DNA粘度大，而RNA粘度小 5、DNA对碱稳定，而RNA被稀碱水解。,二、核酸的紫外吸收性质,碱基具有共轭双键，因此具有紫外吸收性质，其吸收高峰接近260nm。,DNA 紫外吸收光谱： 1天然DNA;2.变性DNA;3核苷酸中吸收值,OD260的应用： 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚，降低 3.判断DNA是否变性 在D
21、NA的变性过程中，光吸收值增大（增色效应） 在DNA的复性过程中，光吸收值减小（减色效应）,三、核酸的变性、复性和分子杂交,核酸变性指核酸双螺旋区碱基对间的氢键断裂，空间结构破坏，形成单链无规则线团状态的过程。,核酸变性后，260nm的紫外吸收值明显增加，称增色效应。,加热DNA的稀盐溶液，达到一定温度(80100)后，核酸即发生热变性。热变性是核酸的重要性质。,热变性DNA缓慢冷却的过程，称退火。,降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,指增色效应达50%时的温度 一般DNA Tm 值在85 - 90 C之间,Tm：DNA变性时，OD260达到最大值
22、的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度(Tm)。 大小与G+C含量成正比。,均一性高，变性的温度范围越窄 。,Tm值大小与下列因素有关：,（1）DNA的均一性：,测定Tm，可推知G-C含量。 G-C%=（Tm-69.3）2.44,（2）GC含量：,不易用稀电解质保存DNA,（3）介质中的离子强度：,(二)复性（renaturation）,变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成双螺旋复性。,DNA复性,复性的程度、速率与复性条件有关： 热变性DNA骤然冷却（淬火）不可能复性 将变性DNA缓慢冷却（退火）可以复性,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(ann
23、ealing) 。,分子量越大复性越难； 浓度越大，复性越容易；,在退火条件下，不同来源的DNA形成双链，或DNA单链和RNA链形成DNA-RNA杂合双链的过程称分子杂交。,(二) 分子杂交（Hybridization),DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸的分子杂交,RNA,DNA-RNA杂交链,Southern杂交 Northern杂交 Western杂交,四、核酸和核苷酸的两性性质（自学）,核酸和核苷酸分子中既含有酸性的磷酸基团又含有碱性的碱基，因此是两性电解质，在一定pH条件下可解离带电荷而进行电泳。,五、核酸的显色反应（自学）,3.二苯胺反应 用于测DNA的含量，
24、产物呈蓝色。,1.钼蓝反应 是核酸中磷酸的反应，产生呈蓝色，用于测定核酸量。,2.苔黑酚反应 用于测RNA含量，产物呈绿色 。,第4节 核酸研究方法,DNA的酶法测定,一、核酸的核苷酸序列测定,英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构，1958 获诺贝尔化学奖 1975 设计出DNA测序法，1980 获诺贝尔化学奖 合成一段与待测DNA序列互补的DNA片段群。,末端终止法Sanger 2，3双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成链延伸的抑制剂。,MOV : MCB4.0Dideoxy sequencing of DNA,DNA序列分析仪： 四色荧光基团标记的dNTP,五、DNA聚合酶
25、链式反应（PCR）,Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.,很少有在公司工作的科研人员得 诺贝尔奖， Mullis是其中之一,Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， ,Mullis的第一个PCR实验,1983年9月中旬。 Mullis在反应体系中加 入DNA聚合酶后在37
26、 一直保温。结果第二 天在琼脂糖电泳上没有 看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。,1995年K.Mullis发明。基本步骤为： 1.设计一对引物以便有效扩增所需要的DNA序列，并尽量减少可能产生的非特异产物 2.优化反应体系：包括适量模板、引物、4种dNTP、Taq DNA聚合酶和适量Mg2+,3.选择3个温度进行热循环： 变性94，4560s； 退火，根据引物的Tm ，1min； 延伸，72，1min。 循环 4.扩增完成后取出一定量的反应产物，检测扩增结果：先进行凝胶电泳，用溴
27、化乙啶染色，紫外光下检测结果,y=产物；x=扩增效率；n循环次数,模板DNA（单链） 引物 DNA聚合酶（Taq） dNTP Mg2+,MOV:MCB4.0POLYMERASE CHAIN REACTION,1DNA双螺旋结构模型是_于_年提出的。 2核酸的基本结构单位是_。 3DNA双螺旋的两股链的顺序是_关系。 4B型DNA双螺旋的螺距为_，每螺旋有_对碱基，每对碱基的转角是_。 5维持DNA双螺旋结构稳定的主要因素是_，其次，大量存在于DNA分子中的弱作用力_和_也起一定作用。 6mRNA的二级结构呈_形，三级结构呈_形，其3末端有一共同碱基序列_其功能是_。 7真核细胞的mRNA帽子由
28、_组成。,1决定tRNA携带氨基酸特异性的关键部位是： AXCCA3末端 BTC环； CDHU环 D额外环 E反密码子环 3构成多核苷酸链骨架的关键是： A23-磷酸二酯键 B 24-磷酸二酯键 C25-磷酸二酯键 D 34-磷酸二酯键 E35-磷酸二酯键 4与片段TAGA互补的片段为： AAGAT BATCT CTCTA DUAUA,7真核生物mRNA的帽子结构中，m7G与多核苷酸链通过三个磷酸基连接，连接方式是： A2-5 B3-5 C3-3 D5-5 E3-3,（ ）1脱氧核糖核苷中的糖环3位没有羟基。 （ ）2核酸中的修饰成分（也叫稀有成分）大部分是在tRNA中发现的。 （ ）3B-DNA代表细胞内DNA的基本构象，在某些情况下，还会呈现A型、Z型和三股螺旋的局部构象。,