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1、第二章 蛋白质的理化性质及其 分离和提纯,一、氨基酸的性质,(一)两性与等电点,水溶液中存在如下平衡：,具有酸碱性,两性离子,pH=pI时，以偶极离子形式存在,pHpI时，以阴离子形式存在,pHpI时，以阳离子形式存在,不同的氨基酸等电点不同，在一定酸度的溶液中，它们荷电程度不同，分子大小不同，在电场中的移动速度也就不同。借此可以进行氨基酸的电泳分离。,纸电泳 (Paper electrophoresis),练习：,现在有四个氨基酸：苯丙氨酸pI=5.5、脯氨酸pI=6.3、天冬氨酸pI=2.8和赖氨酸pI=9.7，请问在以下pH条件下进行电泳，各氨基酸的主要存在形式是什么？在外电场作用下，移
2、向阳极还是阴极？ 苯丙氨酸 脯氨酸 门冬氨酸 赖氨酸 （1）pH=7.0 （2）pH=6.0 （3）pH=5.0 （4）pH=2.0,正 阴极 正 阴极 负 阳极 正 阴极,负 阳极 负 阳极 负 阳极 正 阴极,正 阴极 正 阴极 正 阴极 正 阴极,负 阳极 正 阴极 负 阳极 正 阴极,基于aa所带基团均可解离； 酸碱滴定法； 得到弱酸弱碱曲线； 根据aa上可解离基团的pK值计算等电点： pK：解离常数。,pI的测定,以甘氨酸为例：,等电点的计算,由式可知解离常数：,两边取负对数： -lg H+ 2 = - lg K1 - lg K2 -lg H+ = pH - lg K1 = pK1
3、- lg K2 = pK2 2 pH = pK1 + pK2 令 pI为等电点时的pH，则 pI = （ pK1 +pK2） Gly：pI = （2 .4 + 9.6) = 5.97,由此可知: 等电点相当于该aa两性离子状态两侧 基团pK值之和的一半。,对侧链R基不解离的中性氨基酸： pI=1/2（ pK1+ pK2） 即：等电点pH值与离子浓度无关，只取决于兼性离子两侧基团的pK值。,对有三个可解离基团的氨基酸：,如：酸性氨基酸、碱性氨基酸的pI计算： a、先写出其解离公式； b、后取兼性离子两侧基团的pK值的平 均值。,如：天冬氨酸,如赖氨酸：,(二) 氨基酸的脱羧反应,（三）与亚硝酸反
4、应,（四）受热反应,（1）-氨基酸受热,二肽（少量）,交酰胺经盐酸或碱处理，可转变成二肽,（2）-氨基酸受热,（3）或-氨基酸受热,生成较稳定的五元环或六元环的内酰胺。,（4）氨基与羧基相隔5个或5个以上碳原子,（五）与茚三酮反应,大多数-氨基酸与茚三酮反应呈蓝紫色，这是鉴别-氨基酸最灵敏、最简便的方法。,-氨基酸与茚三酮反应所生成蓝紫化合物在570nm有强吸收，可进行比色分析，其吸收强度与氨基酸的含量成正比，因此可作氨基酸的定量分析。,天然蛋白质分子的20种氨基酸，以色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有较强的光吸收。其吸收峰在280nm左右，以色氨酸吸收最强。 可利用此性质采用紫外分光光度法测
5、定蛋白质的含量。 紫外吸收性受溶液pH的影响。,（六）紫外吸收性质,二、蛋白质的性质,（一）两性电离与等电点,含有羧基及氨基，因此可以两性电离，存在等电点(pI),等电点时，蛋白质的溶解度、粘度、渗透压、膨胀性都最小，在电场中不移动。 同样，当溶液pHpI时，蛋白质所带正、负电荷相等；当溶液pHpI时，蛋白质带净负电荷；当溶液pHpI时，蛋白质带净正电荷。,蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。,（二）胶体性质,蛋白质颗粒的直径1100nm，属于胶体溶液。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。,布朗运动、弱丁达尔效应、不能透过半透膜、吸附,蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜,
6、物理因素：加热、高压、搅拌、X-射线、紫外线、超声波 化学因素：强酸、强碱、脲、重金属盐、有机溶剂、生物碱等,1、变性,在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变。 实质：破坏次级键，改变其构象,（三）蛋白质的变性与沉淀,变性蛋白质的性质改变： 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。 生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。,蛋白质变性的可逆性： 蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下是不能复性的； 如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严
7、重破坏；或者蛋白质具有特殊的分子结构，并经特殊处理则可以复性。,核糖核酸酶的变性与复性,天然构象,蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的现象称为沉淀,变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。,2、沉淀,特点：盐析法沉淀的蛋白质没有变性，去盐后活性恢复。,沉淀蛋白质的方法： (1) 盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出。 实质：破坏蛋白质分子的水化膜和中和其所带的电荷 盐析浓度：盐析所需盐的最小浓度 常用盐析电解质：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl 溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好 通常不会引起
8、蛋白质的变性,盐溶,分子在等电点时，相互吸引，聚合沉淀，加入少量盐离子后破坏了这种吸引力，使分子分散，溶于水中,盐析,蛋白质脱去水化层而聚集沉淀,盐析（NH4）2SO4）,盐析,向蛋白质溶液中加入大量硫酸铵后蛋白质会沉淀析出,分段盐析： 半饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较大的蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀分子量较小的蛋白。因此，使用不同浓度的硫酸铵溶液就可将分子量不同的蛋白质进行初步分离。,(3) 重金属盐沉淀： 铅、铜、汞等重金属的盐类能使蛋白质凝结变性，所以能使人中毒。万一不慎误服了重金属离子，可立即喝大量的牛奶、鸡蛋清等来缓解毒性，以减少人体内蛋白质中毒的程度。,(2) 有机溶剂沉淀 凡能与水
9、以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。 沉淀原理是： 脱水作用； 使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。,加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。 凝固的蛋白质一定发生变性。,3、凝固,（四）蛋白质的颜色反应,1、黄色反应,2、缩二脲反应,与硫酸铜的强碱溶液呈红紫色。（肽键）,加浓硝酸，沉淀，再加热，变姜黄色。（苯环）,3、茚三酮反应,与茚三酮溶液共热，呈蓝紫色。（-氨基酸）,4、米隆反应,加入米隆试剂（汞和亚汞的硝酸及亚硝酸盐混合物），先析出沉淀，再加热时，沉淀变为砖红色。（酪氨酸酚基）,三、蛋白质分离提纯的一般原则,关于蛋白质我们已知什么？ 如果一个蛋白质过去已
10、从不同的来源纯化得到，它的很多信息可应用到新来源的蛋白质。例如：分子的大小、定位、等电点、疏水性及翻译后的修饰等，应该保持相同。如果蛋白质是一个酶或受体，则根据该蛋白质与底物或配体的关系可以制定出一个成功的纯化策略。,蛋白质需要有多纯？ 蛋白质纯化的程度通常取决于它最后的用途。如果蛋白质是供研究用的，则它应该是非常纯的，如果蛋白质是用于工业的，部分纯化就足够了。,纯化蛋白的量要多少? 对于活性研究用的，只需要比较少量的活性蛋白质；而对于进行结构研究用的蛋白质来说，则需要比较大量的高纯度蛋白质。,蛋白质应该如何进行鉴定? 在蛋白质纯化过程中，为了进行蛋白质的追踪，必须有一个快速、重复性好而且灵敏
11、的鉴定方法。此鉴定方法还应该是经济的，能在小体积下进行操作，而且不要求采用昂贵的仪器。,纯化时间应该多长? 纯化步骤应该很快，以减少蛋白质活力的丧失和蛋白质降解等。一般来说蛋白质的量在纯化过程的各步中均会有损失，因此应当尽量减少纯化步骤，以期获得最大的产率。,蛋白质分离提纯的一般程序,一般程序可分为前处理、粗分级和细分级三步：,前处理：分离提纯蛋白质，首先要求把蛋白质从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然状态，不至于丢失其生物活性。 不同的组织或细胞可用不同的方法破碎； 组织或细胞破碎以后，选择适当的介质（一般用低浓度的缓冲液）把所要的蛋白质提取出来。,有时在肌肉组织中抽提
12、时也用稀碱（肌肉中含有乳酸）； 在提取膜蛋白或包含在体内的蛋白质时，可加入表面活性剂以增加溶解度。 由于在细胞中普遍存在各种蛋白质水解酶，有时需低温操作和加一些相应的蛋白酶抑制剂、螯合剂可防止蛋白质的降解。,粗分级：当蛋白质混合物提取液获得后，选用一套适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白质分离开来。 一般这类的分级用盐析、等电点沉淀和有机溶剂分级分离等方法。 特点是简便、处理量大，既能除去大量杂质，又能浓缩蛋白质溶液。,细分级：样品的进一步提纯。一般使用层析法包括凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析以及亲和层析等。 必要时还可选择电泳法，包括区带电泳、等电聚焦电泳等作为后续的提纯步骤。,结晶：蛋白
13、质分离提纯的最后步骤。 尽管结晶并不能保证蛋白质的均一性，但只有某种蛋白质在溶液中数量上占优势时才能形成结晶。 结晶过程本身也伴随着一定程度的提纯，而重结晶又可除去少量的夹杂蛋白质。由于结晶中从未发现过变性蛋白质，因此蛋白质的结晶不仅是纯度的一个标志，也是断定制品处于天然状态的有力指标。 蛋白质的纯度越高、溶液浓度越浓就越容易结晶。结晶的最佳条件是使溶液略处于过饱和状态，这可以借控制温度、加盐盐析、加有机溶剂或调节pH等方法来达到。,重结晶：将含有杂质的固体有机物在加热下溶解在适宜的溶剂中，使成饱和溶液。趁热过滤，去除其中的不溶物后，冷却使欲纯制的有机物重新结晶出来。,蛋白质的分离,根据蛋白质
14、在溶液中的性质分离蛋白质混合物的方法,根据分子大小不同的分离方法,透析：其原理是溶质在浓度差的驱动下从浓度高的一侧通过分离膜渗透到浓度低的另一侧。利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开。,超滤：在一定的压力下，使蛋白质溶液在通过一定孔径的超滤膜时，小分子量物质滤过，而大分子量的蛋白质被截留，从而达到分离纯化的目的。这种方法既可以纯化蛋白质，又可达到浓缩蛋白质溶液的目的。,按膜的孔径或被分离物的体积大小： （a）5000 nm以上，微粒过滤膜。 （b）1005000 nm，微滤膜，可分离血细胞、乳胶等。 （c）2100 nm，超滤膜，可用于分离蛋白质
15、等。 （d） 10 ，纳滤膜，可用于分离游离酸和糖等。 （e） ，反渗透膜（超细滤膜），可分离 NaCl等。,密度梯度（区带）离心：高分子颗粒的沉降不仅决定于它的大小，也取决于它的密度。如果高分子颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，并且每种高分子颗粒沉降到于自身密度相等的介质梯度时，就停滞不前，最后各种高分子在离心管中被分离成各自独立的区带，并于离心管的底部被收集。,凝胶过滤，即凝胶过滤层析：这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。当不同分子大小的蛋白质混合物流经凝胶层析柱时，比凝胶网孔大的分子不能进入珠内网状结构而被排阻在凝胶珠外，随溶
16、剂在凝胶珠之间的空隙向下移动并最先流出柱外；比网孔小的分子能不同程度地自由出入凝胶珠的内外。这样由于不同大小的分子所经的路径不同而得到分离。,利用溶解度差别的分离方法,等电点沉淀和pH控制：当蛋白质处于等电点pH时，蛋白质的净电荷为零，以至于蛋白质分子之间没有静电斥力而趋于集聚、沉淀，因此其溶解度达到最低点，由此可将蛋白质混合物彼此分开。如此沉淀出来的等电蛋白质保持着天然构象，能重新溶解于适当的pH和一定浓度的盐溶液中。,蛋白质的盐溶和盐析：中性盐对球状蛋白质的溶解度有显著的影响。低浓度时，中性盐可增加蛋白质的溶解度盐溶，其机理为蛋白质分子吸附某种盐离子后，带电表层使蛋白质分子彼此排斥，而蛋白
17、质与水分子间的相互作用却增强。当溶液的离子强度增加到一定数值时，蛋白质的溶解度开始下降，离子强度足够高时，很多蛋白质可从水溶液中沉淀出来盐析。主要是大量的中性盐的加入，使水的活度降低，原来的大部分自由水转变为盐离子的水化水，从而降低蛋白质极性基团与水分子间的相互作用，破坏蛋白质分子表面的水化层。,有机溶剂分级法：与水互溶的有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酮等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。在室温下，有机溶剂不仅能引起蛋白质沉淀，而且伴随着变性。若将溶剂冷却到40C60C，然后在不断搅拌下逐滴加入有机溶剂以防局部浓度过高，变性问题可在很大程度上得以解决。在一定温度、pH和离子强度下，引起蛋白质沉淀
18、的有机溶剂的浓度会有差别，由此控制有机溶剂浓度也可以分离蛋白质。有机溶剂引起蛋白质沉淀的主要原因有二，一是改变了介质的介电常数，即导致了两个相反电荷之间吸引力的变化；二是与蛋白质争夺水化水（同盐析现象类似），促使蛋白质集聚并沉淀。,温度对蛋白质溶解度的影响：在一定的温度范围内（约040C之间），大部分球状蛋白的溶解度随温度的升高而增加，但也有例外。在4050C以上，大部分蛋白质变得不稳定并开始变性，一般在中性pH介质中即失去溶解力。,根据携带电荷不同的分离方法,电泳：在外加电场作用下，带电的蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v）取决于电场强度(E)，所带的净电荷(q)，蛋白质的分子量、分子形状以及
19、与介质的摩擦系数(f),SDS（十二烷基磺酸钠）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质多肽链中的氨基酸残基按大约1 1.4比例结合。 每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。 用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同蛋白质的分子量。,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 （Sodium Dodecyl Sulfate -Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE ）,蛋白质等电聚焦电泳 (isoelectric focusing，IEF),(
20、1) 以不同蛋白质的等电点的差异分离。 (2) 凝胶中含有蛋白质样品和载体两性电解质。 (3) 载体两性电解质： a 是一系列物质的混合物。此混合物各组分的等电点要互不相同，但又不能相差太大（小数点后2位）；最常用为3.0-10.0范围，还有3.0-7.0、5.0-10.0。 b 混合物中各物质在等电点时要有足够大的电导，以保证能顺序排列； c 混合物中各物质在等电点时要有足够大的缓冲能力，构成组分为多氨基、多羧基的脂肪族化合物； d 要求各组分分子量要小，易于与蛋白质分离。,通电后，在介质中由于H+与OH-的相向移动，形成了从3.0-10.0的一系列pH梯度。当两性电解质移动到各自的等电点时
21、，就停止移动，不带电荷，并维持pH梯度（电导、缓冲能力）。即：pH梯度由H+与OH-建立，而由两性电解质来维持。当蛋白质移动到相应的pH值处聚焦成一条窄而稳定的带。,通电,通电,蛋白质,蛋白质双向电泳,银染结果,考马斯亮染色为蓝色,离子交换层析：,利用固定相球形介质表面活性基团经化学键合方法，将具有交换能力的离子基团在固定相上面，这些离子基团可以与流动相中离子发生可逆性离子交换反应而进行分离的方法。 带有酸性可电离基团的称为阳离子交换树脂；带有碱性可电离基团的称为阴离子交换树脂。 带电荷多的蛋白质与固定相结合较强，而带电荷少的蛋白质则较弱。用不同浓度的阳离子洗脱液，如NaCl溶液进行梯度洗脱，
22、通过Na+的离子交换作用，可以将带有不同电荷的蛋白质进行分离。,蛋白质的选择吸附分离 某些物质，如极性的硅胶和氧化铝以及非极性的活性炭等粉末具有吸附能力，能将其它种类的分子吸附在其粉末颗粒的表面，而吸附力的强弱又随被吸附的物质性质不同而异。 吸附层析法就是利用这种吸附力的强弱不同而达到分离的目的。蛋白质分子与各种吸附剂结合的真实性被了解得很少：认为与非极性吸附剂作用可能主要是靠范德华力和疏水相互作用，而与极性吸附剂作用可能是离子吸引和（或）氢键键合。蛋白质提纯中使用最广泛和最有效的吸附剂是结晶磷酸钙Ca10(PO4)6(OH)2。具推测，蛋白质中带负电荷的基团与其的钙离子结合。,根据对配基的生
23、物学特异性的分离方法亲和层析,亲和色谱颗粒,具有极强的专一性,亲和层析金属螯合层析(Metal Chelating Chromatography) 利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进行分离的方法。,固相担体,(N-terminal),MHHHHHHSSGLVPRGSGMKETAAAKFERQHMDSPDLGTDDDDKAMADIGSSRM Target Protein MSRVDLKLAAALEHHHHHH,(C-terminal),CNBr treatment
24、,TGRGDSPA(GVPGV)2GG(GAGAGS)3ASn,重组蛋白氨基酸序列,Target Protein:,Interaction between Ni-NTA and 6His-tagged protein,Ni2+,NTA occupies four of the six ligand binding sites in the coordination sphere of the nickel ion, leaving two sites free to interact with the 6His-tag stably.,Binding capacity: 5-10 mg per
25、 mL of resin,常用方法有：PAGE和SDS-PAGE、毛细管电泳(CE)、IEF、HPLC：包括凝胶过滤、各种反相和离子色谱、疏水色谱等。 按照严格的要求，用电泳法证明蛋白质的纯度，在一种pH下电泳说明该蛋白质是纯的，这是不够充分的。应该取二种pH，它们分布在蛋白质等电点的二侧，在这二种pH下电泳都证明此蛋白质是纯的，这样才可靠。 一些新的有效方法也被引入分析蛋白质的纯度。如质谱等。特别是电喷雾质谱(ESI)的发展，只要p mol级的样品就能作一测定。 此外也用一些化学法，例如观察蛋白质N端或C端是否均一，也是相当有效的方法，有时甚至比常用的HPLC更有效。比如有一个产品在HPLC
26、中已是一对称的峰，但在蛋白质的N端分析中指出纯度可能还不到90有一定量的其他蛋白质存在。用末端分析法检查蛋白质的纯度，在国内目前还没有引起重视，其实在测N端序列的同时，应该也给出N端均一性(蛋白质纯度百分比)的数据。,蛋白质的纯度分析,蛋白质的分子量测定,可采用凝胶过滤法测定蛋白质的分子量。近年来由于解决了分离介质的刚性问题，有了HPLC的凝胶过滤系统，测定分子量只需一小时即可。但在一般实验室应用的常规方法是SDSPAGE，这种方法误差约510，但极为简便。 凝胶过滤是测定完整蛋白质分子的分子量，而SDSPAGE是测定蛋白质亚基的分子量，同时用这两种方法测定同一蛋白质分子量，可以方便地判断样品蛋白质是否寡聚蛋白质。 更新方法是用毛细管电泳(凝胶或无胶筛分)测定蛋白质的分子量，仅需 n g量，而且还可用积分仪或电脑在线精确定量。同时此法对蛋白质的分辨力和准确性比SDS-PAGE方法为好。用SDS-PAGE得到均一的区带，但在毛细管筛分电泳中可能为二个毗邻的峰，分子量有约1000的差异。 80年代，质谱用于测定蛋白质分子量的代表是飞行时间（TOF，time-of-flight)质谱。近年来，高分辨力的磁质谱可精确测定分子量2000以下的多肽；最近由于电喷雾质谱(ESI)有了长足的发展，可以用于测定120万分子量的蛋白质，而且只需 p mol量的蛋白质。,