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1、,基因编辑技术和原理,http:/ 在这位点上剪断靶标 DNA 片段并插入新的基因片段。此过程既模拟了基因的自然突变， 又修改并编辑了原有的基因组， 真正达成了“编辑基因”。,http:/ DNA 双链断裂激活细胞天然的修复机制，包括非同源末端连接和同源重组修复 两条途径。,http:/ ）是一种低保真度的修复过程，断裂的DNA 修复重连的过程中会发生碱基随机的插入或丢失，造成移码突变使基因失活,实现目的基因敲除。如果一个外源性供体基因序列存在，NHEJ 机制会将其连入双链断裂DSB 位点，从而实现定点的基因敲入。,（ 移码突变：在正常DNA分子中，碱基缺失或增加3的倍数，造成这位置之后的一系
2、列编码发生移位错误的改变，这种现象称移码突变。）,http:/ 同源重组修复（HR） 是一种相对高保真度的修复过程，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB，在一个同源供体存在的情况下，可以进行原基因的替换。,http:/ 3 种基因编辑技术， 分别为： 人工核酸酶介导的锌指核酸酶(zinc- finger nucleases，ZFN)技术； 转录激活因子样效应物核酸酶(transcription activator- like effector nucleases，TALE
3、N)技术； RNA 引导的 CRISPR- Cas 核酸酶技术(CRISPR- Cas 9）。,http:/ ZFN 基因组编辑技术,ZFN 技术是第一代基因组编辑技术，其功能的实现是基于具有独特的DNA序列识别的锌指蛋白发展起来的。1986年Diakun 等首先在真核生物转录因子家族的 DNA 结合区域发现了Cys2- His2锌指模块，到1996年，Kim等首次人工连接了锌指蛋白与核酸内切酶。2005年，Urnov等发现一对由4个锌指连接而成的ZFN可识别24 bp的特异性序列，由此揭开了ZFN在基因组编辑中的应用。,http:/ 由锌指蛋白(ZFP)和 Fok核酸内切酶组成。其中，由 Z
4、FP 构成的 DNA 识别域能识别特异位点并与之结合，而由Fok构成的切割域能执行剪切功能，两者结合可使靶位点的双链DNA 断裂(DSB)。于是， 细胞可以通过同源重组(HR)修复机制和非同源末端连接(NHEJ)修复机制来修复 DNA。HR 修复有可能会对靶标位点进行恢复修饰或者插入修饰，而 NHEJ 修复极易发生插入突变或缺失突变。两者都可造成移码突变，因此达到基因敲除的目的。,http:/ 诱导的基因组编辑技术可应用于很多物种及基因位点，具有较好的发展潜力。但是目前有 3 个方面的缺陷制约了该技术的推广:(1)以现有的策略设计高亲和性的 ZFN， 需要投入大量的工作和时间;(2)在细胞中持
5、续表达 ZFN 对细胞有毒性;(3)虽然三联体设计具有一定特异性，但仍然存在不同程度的脱靶效应。,http:/ TALEN 基因组编辑技术,2009 年，研究者在植物病原体黄单胞菌(Xanthomonas)中发现一种转录激活子样效应因子，它的蛋白核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有较恒定的对应关系。随后，TALE特异识别 DNA 序列的特性被用来取代 ZFN技术中的锌指蛋白。它可设计性更强，不受上下游序列影响，具备比ZFN 更广阔的应用潜力。,http:/ 包含两个 TALEN 蛋白, 每个 TALEN 都是由 TALE array 与 Fok融合而成. 其中一个 TALEN 靶向正义
6、链上靶标位点, 另一个则靶向反义链上的靶标位点. 然后 Fok形成二聚体, 在靶向序列中间的 spacer 处切割 DNA, 造成双链 DNA 断裂, 随后细胞启动 DNA 损伤修复机制. 针对不同的TALEN 骨架, 其最适宜的spacer长度不同, 其长度范围一般为1220 bp. 实验结果表明, TALENs在靶向DNA时, 第一个碱基为 T 时其结合效果更佳。,http:/ TALEN 已经成功应用于酵母、 哺乳动物和植物的位点特异性基因打靶， 与锌指核酸酶系统相比有较大的应用优势， 但仍然有些问题需要解决，例如:脱靶效应、TALEN 与基因组进行特异结合与染色体位置及邻近序列有关等。
7、,3. CRISPR /Cas9 基因组编辑技术,http:/ 等在K12大肠杆菌的碱性磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列，随后发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细菌的基因组中。经过几十年的研究，在2007年终于证明这种重复序列与细菌获得性免疫的关系。,http:/ 系统由 Cas9 核酸内切酶与sgRNA构成. 转录的 sgRNA 折叠成特定的三维结构后与 Cas9 蛋白形成复合体, 指导 Cas9 核酸内切酶识别特定靶标位点, 在 PAM 序列上游处切割 DNA 造成双链 DNA 断裂, 并启动 DNA 损伤修复机制. 从不同菌种中分离的 CRISPR/Cas 系统, 其 CrRNA(或者是人工构建的sgRNA)靶向序列的长度不同, PAM 序列也可能不同。,http:/ RNA 便能识别外来基因并将其降解的功能蛋白引起了研究者的兴趣。直到2012 年，Jinek 等第一次在体外系统中CRISPR/Cas9 为一种可编辑的短RNA 介导的DNA核酸内切酶，标志着 CRISPR /Cas9 基因组编辑技术成功问世。,http:/ 还存在构建复杂和价格的问题， 其脱靶效应限制了其在基因治疗等应用上的发展。,http:/