兽医流行病学 刘文博 第十三章 分子流行病学.ppt

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1、第十三章 分子流行病学,第一节 分子流行病学的发展和定义,定义：将分子生物学的理论和技术应用于流行病学调查研究，在分子水平上阐明疾病或医学事件在畜群或环境生物群体中频率分布及其决定因素的学科。,分子流行病学的发展,分子流行病学(molecular epidemiology)最早于1973年由美国Kilboume首先提出 在80年代形成流行病学的一个分支学科。 1、研究内容更加丰富 传染病：传染源、传播途径、病原体检测鉴定 疾病和健康状态相关生物标志的分布、影响因素、群体易感性、防治效果评价及病原生物的进化与变异规律等。,2、研究手段越来越多 初期：质粒图谱、核酸分子杂交、指纹图谱 目前：核酸和

2、蛋白质测序技术、酶技术、生物芯片技术等,3、应用范围不断扩大 预防医学、预防兽医学 基础医学、生物学和环境科学,分子流行病学产生的基础,分子生物学理论：DNA双螺旋模型、遗传中心法则、遗传密码、RNA逆转录、基因表达调控等。,遗传的分子基础双螺旋DNA分子模式,BioTech,核 苷 酸,碱基,脱氧核糖,磷酸酯键,表型的分子基础及蛋白质结构,Mutation Combination,分子生物学技术：各种凝胶电泳、核酸体外扩增、DNA测序、蛋白质测序、分子杂交、基因克隆、色谱分析等，对核酸、蛋白质等生物大分子的检测鉴定水平大大提高。,分子流行病学与常规流行病学不同点,从分子(基因)水平上阐明疾病

3、或其它医学事件的频率分布及其决定因素，常规流行病学从大体或表型上研究； 仅研究疾病或医学事件的生物学方面，因此较常规流行病学的范围要小一些。,第二节 分子流行病学的研究内容,传染性疾病 心血管、肿瘤等慢性疾病 遗传和代谢疾病的研究,（一）传统流行病学研究遇到的难题 1、病原生物的多样性和变异性 流感病毒、艾滋病病毒、口蹄疫病毒、传染性支气管炎病毒、马立克氏病毒等 从20世纪20年代至50年代，猩红热的病死率下降至原来水平的3.3%，近年无死亡病例。,2、新传染病不断出现 如SARS、尼帕病、O157大肠杆菌出血性肠炎等。,过去30年来新发现的部分病毒性人兽共患病,3、耐药性病原体增多 滥用抗生

4、素和磺胺类药物使细菌的耐药性增强。如沙门氏菌、大肠杆菌、葡萄球菌、结核杆菌、痢疾杆菌等。 在1700多种感染性微生物中，近50%是动物源性的。,4、慢性病的因果判断困难 大多具有多病因、多阶段、多基因、长潜伏期等特征。 需要对疾病自然史不同阶段的生物学事件进行深入研究。,基因,环境,囊性纤维性变,糖尿病,爱滋病,疾病 - 基因 - 环境,5、个体的易感性差异 暴露因素作用后，在不同时期体内发生的变化。 致癌因子进入机体使正常细胞转化为癌细胞经历：启动、促进、转化和发展的过程。需研究个体在每一个过程中具有什么区别。,传染性疾病,病原体的分型和分类,1、病原体通常以生物学或抗原特性分型或分类， 2

5、、以上特征往往是蛋白分子特异性导致，由于每一个个体的个体（种别）特性，它总是喜欢给自己一个特征以和其它个体（种别）相区别，这种特征与一些共同的特征相比，往往占据优势。 3、但对于核酸分子，由于它的遗传特性和保守区域的存在在分类上占据一定优势，加上近年来分子生物学的飞速发展，应用越来越广。,牛传染性鼻气管炎病毒,各临床型分离的毒株具有相同抗原性 根据限制性内切酶图谱分析，可分为I、III型，型又可分为a和b两个亚型 I型和a亚型 鼻气管炎 b亚型 外阴阴道炎和龟头包皮炎 III型 脑炎和流产,传染源和传播途径分析,口蹄疫：欧洲、美国都曾发生病毒从实验室外逸造成的爆发。,用于病原体起源和进化研究,

6、犬细小病毒（CPV） 猫细小病毒（FPLV）和水貂肠炎病毒（MEV）重组而来 CPV基因组左端约30与MEV有较大同源性，而其余部分与FPLV有较大同源性。,1984年Holmberg等报道，纽波特沙门氏菌（38Kb质粒耐药）人群肠炎暴发流行 牛饲料中添加了四环素，使耐药菌株在牛群中迅速成为优势菌株。,用于细菌耐药性研究,弯曲杆菌 1997年10月，美国明尼苏达州卫生部报告 从商店随机抽检肉鸡，污染率达79%，其中20%为耐药菌；火鸡污染率为58%，其中80%为耐药菌。,耐药菌发展速度因不同细菌而异。 金黄色葡萄球菌大肠杆菌沙门氏菌 耐药性是否稳定，因不同细菌、抗生素而异。 四环素、氯霉素、磺

7、胺类耐药性相对稳定 红霉素、庆大霉素相对不稳定 葡萄球菌、痢疾杆菌产生耐药性后较稳定。,肿瘤和心血管疾病,肿瘤 心血管疾病 恶性肿瘤和心血管疾病是目前人类死亡的主要原因，也是动物死亡的重要原因之一。 据WHO估计，全世界每年死于肿瘤的有540万人左右，而发生恶性肿瘤的新病例每年有740万人。中国目前有高血压病人6000万，每年脑卒中新病例130万，现患病例500万。 目前，已找到了很多癌基因和高血压相关基因。,遗传和代谢疾病,各种遗传和代谢疾病都有一定的遗传基础，用分子流行病学方法对有害基因分布及遗传规律、高危人群进行研究，对有关疾病的病因学和防治研究具有重要意义。 继乳光牙、短指症致病基因发

8、现之后，我国在人类遗传病基因研究领域取得又一重大进展发现儿童白内障致病基因“热休克转录因子-4”,对一种慢性舞蹈病Huntington氏病(HD)的分子流行病学研究就是一例。对不同家族染色体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析表明，HD基因与4号染色体的基因多态片段有关，从而在病因不明的情况下，通过分子流行病学研究，确立了疾病相关基因的定位,Multiplex PCR analysis for exon deletions in the DMD gene,Two lanes with results typical for deletions,第三节 分子流行病学的研究方法,分子流行病学

9、是将分子生物学的理论和方法应用于流行病学调查研究，其研究方法是分子生物学和流行病学方法的结合。,分子生物学研究方法,核酸电泳图谱分析（质粒图谱和RNA电泳图谱） 核酸酶切图谱分析 寡核苷酸指纹图谱分析 基因探针和核酸杂交 聚合酶链反应（PCR） 核苷酸序列分析 多位点酶电泳 DNA芯片,核酸电泳图谱分析（质粒图谱和RNA电泳图谱）,核酸酶切图谱分析,寡核苷酸指纹图谱分析,基因探针和核酸杂交,实例：NDV和H9亚型AIV的 分子流行病学,新城疫部分,90年代以前全球范围内三次大流行，并被认为正在发生ND 第四次大流行我国ND流行一直严重，以疫苗接种为主的预防工作成为生产常规后没有能很好地控制ND

10、，并出现新的特点免疫鸡群中非典型ND, 九十年代后期，以匈牙利等国科学家组成的研究小组建立了一 种在基因（F）水平上的NDV毒株分类方法，将ND发现以来 的各国NDV株分为 8个基因型，并证明不同基因型分别 在不同时期的流行中占主导地位：,第一次：基因、型 第二次：出现新的基因型和型 第三次：属于b亚型的鸽源NDV是起源 当前许多学者认为基因型NDV正在引起世界范围内第四次大流 行,目的,了解我国鸡群中新城疫流行毒株的同源性与基因型 常规疫苗对其保护力如何？为探索我国新城疫的防制策略打基础。, 实验路线： 不同时间和地区病毒分离（20个） 常规生物学特性研究 选取特定基因的特定片段 PCR 测

11、序 动物保护实验 分子流行病学研究 制订防制对策 执行 评价和修改,材料与方法, 病毒来源：23个鸡源NDV中，标准毒株F48E8、Hert33及LaSota 株由本 实验室保存，20个分离株均由ND发病鸡群中按常规方法分离并通过与H5、 H9亚型AIV的血凝交叉抑制反应确定不含AIV，分离背景见表1 病毒的毒力测定试验：按OIE方法进行 致死鸡胚平均死亡时间（MDT）的测定 1日龄雏鸡脑内接种致病指数（ICPI）的测定 引物设计：参照已发表的NDV毒株的F基因核苷酸序列设计两对引物， P1和P2用于扩增M基因1161nt至F基因889nt间长约970nt的片段， P3和 P4用于扩增F基因8

12、62nt至F基因1700nt间长约839nt的片段。引物由宝生 物工程（大连）有限公司合成，引物序列为： P1 5-GCCGAATTCCCGAATCATCACGACGCTTAA-3 P2 5-GTGAAGCTTGAGTCTGTGAGTCGTAC-3 P3 5-CACCGGTACCCCTATTCTGATCG-3 P4 5-TTAAGCTTGTAGTGGCTCTCATCTGATC-3,表1 实验用20个鸡源NDV分离株, NDV F基因片段的扩增和克隆：扩增和克隆了20个分离株中的18株 病毒纯化 基因组RNA的抽提：参照吴艳涛等酚-SDS法 RT-PCR扩增F基因 克隆载体pGEMR-T Eas

13、y和转化感受态大肠杆菌DH5 重组质粒鉴定 挑取含阳性克隆的菌液，半固体穿刺培养 序列测定：阳性克隆交宝生物工程（大连）有限公司测定 序列分析：另从Genbank和已发表的文献中获取37个NDV参考毒株的 相关序列，以DNAStar软件分析和比较F基因的核苷酸序列及其推导的F 蛋白一级aa序列，参照匈牙利等国科学家方法，分析其基因型 根据F基因47nt至420nt之间的 374nt片段序列绘制NDV遗传进化发生树 分析F基因334nt至1682nt之间的1349nt片段上Hinf I 、BstO I 和Rsa I三种 RE位点分布, NDV遗传进化发生树的绘制：55株NDV分布于树形图上的9个

14、主干分 支，其中8个分支代表了国外已报道的 基因型（见图1） 毒株FJ-1/85、ZJ-1/85、JS-1/97和F48E8在I型和III型之间形成了一个新的主 干分支，彼此之间的同源性99.5100%, 与I型同源性为89.389.9%，与III型 同源性为92.092.5%，差异显著，它们代表了NDV的一个新基因型，定名 为基因型。 其余15株位于已知的和型分支,图1 不同NDV遗传进化发生树,基因型的分支较多，国外已将其分为ae 5个亚型。本试验中，有7个分 离毒株归于基因型，其中XJ-1/91、JX-1/94和XJ-3/97在型分支中形成 一个新的簇，组成了一个新的亚型，定名为基因VI

15、f亚型；同样ZJ-2/86、 ZJ-3/97、Sh-1/97和Sh-2/98组成另一新的亚型，定名为基 因VIg亚型。在 与相邻基因亚型的遗传距离上，f与b间为9.211.5%，f与g间为 6.26.8%，g与d间为2.53.3%。,基因型毒株中已有ad 4个亚型的报道，本实验中归于型的8株 NDV间同源性为93.199.7%，在遗传进化发生树的型主干分支中位于三 个不同的亚分支，其中JS-4/01、JS-5/01、ShD-1/01、XJ-2/97和FJ-2/97归 于d亚型，JS-3/00归于c亚型；JS-2/98和JX-2/99形成了一个新的亚分支， 定名为e亚型。从图1可以看出，该亚型毒

16、株位于b和c亚型之间，与前 者的遗传距离为3.05.0%，与后者的遗传距离为2.76.2%。, 限制性内切酶（RE）位点的分布：NDV 基因型的分类最初是以F基因3341682 nt间三种RE（Hinf I、 BstO I和 Rsa I）位点分布的差异为依据的，有些RE位点可作为鉴别基因型的标志。18个NDV分离株具有特征的RE位点分布（见表3） 表3 IIX基因型NDV毒株的F基因上RE位点分布,736 883 1198 1350,752 953 1116 1478 1601,540 683 872 973 1593 1625,动物保护试验,常规疫苗对各种不同基因型的分离株均有保护力 各种不

17、同基因型毒株之间的交叉保护力为100%,结论,我国存在不同基因型的NDV毒株 不同基因型之间的主要保护性抗原没有发生改变（在我国的国情下考虑该问题）,H9亚型禽流感部分,H9亚型禽流感于1970年首次报道。 20世纪90年代初，该亚型病毒在野鸟和家禽 中的分离率还相对较低，没有造成大面积的流行。 20世纪90年代后期以来，家禽（特别是鸡） 的H9亚型AIV在亚洲和世界其它洲频繁报道。中 国香港于1999年还报道从有明显类流感症状的病 人体内分离到H9亚型病毒。 中国大陆自1994年首次报道鸡群感染H9亚型 病毒以来，该亚型病毒已在我国大部分省的鸡群 中引起该病的流行，且在广东省也报道从有明显

18、类流感症状的病人体内分离到H9亚型病毒,几个研究表明，1999年从香港人体内分离到的H9亚型病毒来源于1997年从香港活鸟市场鹌鹑中分离的A/Quail/Hong Kong/G1/97（简称G1株）。最近日本、巴基斯坦和沙特阿拉伯等也报道分离到与G1株遗传关系很近的H9N2亚型病毒。Guo等对亚洲新形成的H9N2病毒亚系的研究表明，亚洲H9N2病毒可分为三个不同的亚系，其中一个亚系以香港G1株为代表，与香港人体内分离的H9亚型病毒有密切关系，并且对哺乳动物有致病性，氨基酸序列分析还表明这一亚系的毒株HA蛋白具有人受体结合特异性的氨基酸残基。,李建伟等对山东1996年分离的一株H9N2亚型毒株的

19、研究认为，该毒株是从北京1994年的一个分离株A/chicken/Beijing/1/94（H9N2）演化而来，且与香港人体内分离的H9N2毒株的亲缘关系较远。 由此看来，H9N2亚型AIV的感染不仅给养禽业造成了很大的经济损失，还可能给人类的健康构成新的威胁。,实施严格的生物安全措施和在流行地区使用疫苗是控制该病主要的方法。因此，弄清我国大陆H9N2亚型AIV流行株之间的关系以及该亚型病毒在疫苗免疫选择压力下的遗传变异情况对有效控制和消灭本病的流行具有重要意义。,研究内容,对从我国12个省1996年-2001年间分离到的25株H9N2亚型AIV流行株的HA基因全序列进行分析和比较，以阐明这些

20、毒株之间的关系,本研究的25株H9N2亚型AIV为我国大陆1996年-2001年期 间的流行株，分别分离自我国：,研究方法,1. 根据已发表的H9亚型AIV的HA基因序列，借助于Prime Primer5.0软 件设计一对预期扩增HA基因编码区全序列的特异性引物，引物序列为： P1:5CCCAAGCTTATGGAAACATATTCACTA-3 P2:5-CCTGTCGACGTAGAAACAAGGGTGTT-3 2.通过RT-PCR方法扩增出目的片段； 3. 将扩增所得的片段测序，获得了25个HA基因的编码区全序列； 4.从已发表的资料中搜索得到以下序列： （1）10株病毒HA基因编码区全序列；

21、 （2）32株病毒HA基因55-1152碱基区1098个核苷酸序列； （3）73株病毒HA基因613-992碱基区380个核苷酸序列； 5. 基于本研究测得的25个HA基因序列和搜索得到的以上序列，借助DNAStar软件包中Megalign软件进行以下几个方面的比较： （1）比较35个毒株HA基因编码区全序列的同源性； （2）比较57个毒株HA基因HA1上几个重要的氨基酸位点； （3）分别以35个毒株HA基因编码区全序列、57个毒株HA基因55-1152碱基区1098个核苷酸序列和98个毒株HA基因613-992碱基区380个核苷酸序列建立遗传发生树，进行遗传发生关系研究。 6.通过以上几个方面的比较，分析中国大陆毒株之间的关系以及它们与世界其它国家毒株的关系。,结 果,结 论,通过以上的研究可以得出如下结论： 1. 已报道的我国大陆鸡群中1994-2001年期间流 行的H9N2亚型禽流感病毒为同一来源，已形 成了一个稳定的亚系，明显不同于与香港人 H9N2病毒感染有关的病毒； 2. 鸟类的国际贸易在H9亚型禽流感的流行病学 上具有重要意义。,