吉林大学《核医学》2-体外分析技术2016-5-20.ppt

《吉林大学《核医学》2-体外分析技术2016-5-20.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《吉林大学《核医学》2-体外分析技术2016-5-20.ppt（169页珍藏版）》请在三一文库上搜索。

1、吉林大学中日联谊医院 核医学科,体外分析技术 In Vitro Analysis,体内超微量生物活性物质定量分析技术,利用核素及其标记物诊断和治疗疾病的临床医学学科。,待 测 物 质 浓 度 与 检 测 手 段,临床化学分析,pg/mL,ng/mL,mg/mL,mg/mL,g/L,免疫分析,治疗药物,甲状腺激素,性激素,变态反应,肿瘤标记物,传染性疾病,维生素,血清蛋白,常量,微量,超微量,体外分析技术（in vitro analysis techniques） 泛指以离体组织、血液或体液等作为生物样本，在人体外进行的、分析样本中成分或其含量的检测技术。 核医学中指有别于体内进行的放射性核素显

2、像和核素治疗，在体外用放射性核素标记配体（ligand）为示踪剂，以结合反应为基础，在试管内或反应杯中进行的检测微量生物活性物质的免疫标记技术。,定义,分类,标记物,反应机制,4,概述,1,2,3,5,放射免疫分析,免疫放射分析,非放射性标记免疫分析,体外分析的临床应用,主要内容,7,核医学中建立最早、应用最广泛的体外放射分析技术。 充分利用了放射性测定的高灵敏度和免疫反应的高特异性的优点。 特点： 灵敏度高，可分析10-910-18g的微量生物活性物质。 操作简便、成本低。血清、血浆、体液等样本不加提纯就可直接测量。,第二节 放射免疫分析技术（radioimmunoassay, RIA）,B

3、erson & Yalow,1960年美国的Berson和Yalow 将核技术与免疫学技术结合建立了放射免疫分析法。 首先用于测定血浆胰岛素浓度，由于该法对医学的巨大贡献，1977年Yalow获得了Nobel Prize。,Yalow,Berson,History review,Radioimmunoassay,放射免疫分析法 (radioimmunoassay),Dr. Yalow,在体外条件下, 利用Ag与定量的*Ag对限量的特异性Ab的竞争结合反应，通过测定放射性复合物的量来计算出Ag 量的一种超微量分析技术。,放免试剂盒,RIA的基本原理,Ag-Ab + Ag,*Ag,Ab,Ag,+,

4、+,*Ag-Ab + *Ag,(B),(F),*Ag与Ag 免疫活性相同 在一定的反应条件下 *Ag、Ab为恒定量 *AgAg Ab,Ag= * Ag , AgAb=*AgAb,Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag(F),Ag *Ag , *AgAb (B) *Ag (F),B%=B/(B+F),F%=F/(B+F),R=B/F,竞争性结合抑制反应,可逆反应,竞争性结合抑制反应,Ag,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,分离B、F,B%=B/(B+F),F%=F/(B+F),R=B/F,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,浓度,

5、标准曲线的制作,反应达平衡,横坐标,纵坐标,标准曲线,标记物与被测物之间的函数关系可以用标准竞争抑制曲线（标准曲线）来表示。 制作方法： 将药盒中一系列已知浓度（递增）的标准品抗原（标准品），分别加入相应的试管。 加入固定量的*Ag和Ab。 待竞争结合反应达到平衡后，分离抗原的结合部分和游离部分 用放射性测量仪（-计数仪）测定*Ag-Ab（B）或游离*Ag（F）的放射性，在坐标纸或计算机拟合曲线。,-计数仪：实际测量的放射性信号是仪器输出的电脉冲数，单位为：cpm(counts perminute)或者cps(counts persecond)。,标准曲线,常用的有计算方式有B%B%=B/(B

6、+F)100%，称结合率、B/F、B/Bo、F/B、Bo/B等。 这些反应变量都可以用作纵坐标来对应标准抗原的浓度作标准曲线，选用的反应变量不同，标准曲线的形状也不同。但是这些标准曲线都是反映的反应变量对应标准抗原浓度变化而变化的函数关系。,25,50,100,200,400,800,*Ag,Ab,分离B、F,B1%,B2%,B3%,B4%,B5%,B6%,1,2,3,4,5,6,B%,？,Ag,浓度,未知样品的测量,待测抗原与一定量的*Ag与限量特异性Ab发生反应 分离待测抗原的B和F 测量其放射性，求出B%,F%,B/F 标准曲线上查出对应的抗原浓度,60,在实际的操作中，一般要设立： 最

7、大结合管（B0）：标准抗原的量为0，只有标记抗原和特异性抗体时，标记抗原与抗体充分反应后分离B和F，所测得的B的放射性为B0。这是没有标准抗原与之竞争时，标记抗原和抗体的结合达最大值。 非特异结合管（NSB）：标记抗原除了要和特异性抗体结合以外，还要和一些杂质蛋白或容器的管壁等结合，对我们的分析结果产生影响。NSB管是用蒸馏水代替特异性抗体，在相同条件下反应后测得的放射性。,总放射性管（T）：反应后不分离就直接测得的放射性就是总放射性。表示标记抗原抗体复合物和游离的标记抗原的总放射性。 标准管（B1Bn）：放有不同浓度的标准抗原，再加入相同量的标记抗原和特异抗体。一般在反应后分离出沉淀，测定沉

8、淀的放射性作为B。 样品管（Bx）：用同剂量的样品代替标准管中的标准抗原，在相同条件下反应和分离，同样取沉淀测得其放射性，就可以在绘制的标准曲线上找到样品的浓度。,19,20,上述方法检测得出的未知样本的量，是手工操作法。其检测速度、效率和准确度都较低。通常在单一实验室完成，并报告。,随着实验医学技术的发展和计算机运算能力的不断提高，放射性活度的检测几乎抛弃了人工计算这一过程，完全由计算处理。其结果可通过实验室信息系统（laboratory information system，LIS）、医院信息系统（hospital information system，HIS）直接将检测结果传送到医生诊断

9、室，也可通过无线网络，转送到医生的掌上电脑。,21,实验室检测,医院信息系统 （HIS),移动网络平台,手机阅读,平板电脑,诊断室,实验室信息系统(LIS),放射免疫分析的基本试剂,放免分析的三大试剂 特异性抗体（Ab) 标准品抗原(Ag) 标记抗原(*Ag) 此外，还需有将B、F分开的分离试剂（方法）。 因此，放免法就是三大试剂，一大分离试剂（方法）。将四大种试剂组装一起即放免试剂盒。,1.抗体,抗体的制备技术是由试剂公司按国际或国家标准生产的，应用于临床使用的商品化的试剂盒或商品的抗体，他的各项指标必须符合国际或国家标准。 目前使用的抗体有单克隆抗体或多克隆抗体。 RIA法的特异性、灵敏度

10、在很大程度上取决于抗体的质量。 衡量抗体质量的指标有亲和力、特异性和滴度。,1.抗体,亲和力： 特定抗原和抗体之间的结合能力和其牢固性。 亲和力大者反映结合速度快，解离度小。 抗体亲和力大小用亲和常数（K）表示。 特异性： 抗体分别与相应抗原结构类似物结合能力的比较。 如果抗体特异性不高，则抗原类似物也能与抗体结合，成为干扰物质，影响检测结果。 特异性用交叉反应率表示。交叉反应越小，特异性越强。,1.抗体,滴度： 以免疫反应中所需抗血清稀释度的倒数来表示。 稀释倍数越高，滴度越高，所需的抗血清量越少，杂质干扰也越少。 使用抗体的最佳稀释度，由稀释曲线确定。用不同稀释度的抗体制备稀释曲线，选用结

11、合率是50%的对应的抗体稀释度作为RIA的工作浓度。,2.标记抗原,用于标记的抗原必须与待测物是同一物质，且具有较高的化学纯度和免疫活性。 被标记后不改变原有抗原的生物活性（免疫性、特异性等）。 标记用放射性核素的选择： 半衰期足够长，以保证商品试剂盒的制造、运输和一定的储存使用期。 125I标记方法简单，成本低，保持了*Ag的免疫活性，射线极易测量，半衰期是60天，是理想的核素。 目前临床上应用最多的是125I。,2.标记抗原,比活度： 每微克抗原上标记放射性核素的千贝可数（KBq/g）； 定量范围一般在10-1210-9mol； 直接影响方法本身的灵敏度，比活度高，灵敏度亦高。 放射化学纯

12、度： 具有免疫活性的标记抗原占总放射性的百分数； 90%，否则放射性杂质多，影响测定的精密度； 一般标记抗原制备后应在1-2个月使用，时间过长易脱碘（125I），使放射化学纯度降低。,2.标记抗原,免疫活性： 从标记到使用的全过程中各种因素的影响都会造成标记抗原的免疫活性下降，与抗体反应的能力减弱； 蛋白质分子上标记过多的碘原子也可引起免疫活性的变化，一般每个蛋白质分子上只标记12个125I原子为宜。,3.标准品,标准品是已知含量并呈梯度浓度的系列标准抗原，绘制标准曲线进行定量的依据。 要求： 化学结构、免疫活性要与被测抗原完全一致。 放射化学纯度高，影响分析的杂质少。 定量精确。 现多用与患

13、者样品基质相似的校准品替代标准品。,4.分离方法,分离的目的：放射免疫反应达到平衡后，把*Ag-Ab和游离抗原分开，分别测定其放射性。 常用的分离方法： 双抗体法（double antibody method）： 用抗原免疫动物（如兔）产生抗体作为第一抗体，然后用第一抗体作为抗原免疫另一种动物（如绵羊），所产生的抗体成为第二抗体。 在免疫反应完成后，“加二抗”，形成Ag+抗1+抗 2，分子量加大，形成不溶性复合物，通过离心，即可分开。 优点：易分离、特异性强、使用方便。 缺点：易受其他因素干扰、成本高、操作时间长。,4.分离方法,沉淀法（precipitation method）： 利用某些中

14、性盐和有机溶剂在一定的条件下，能使蛋白质沉淀的特性，使*Ag-Ab较快速度沉淀。 最常用：聚乙二醇。 优点：分离速度快，价格便宜。 缺点：分离效果易受温度、PH、蛋白质含量、试剂浓度等因素的影响，非特异性结合较高。 双抗体法+沉淀法： 易分离、速度快、特异性强、价格低廉、使用方便，弥补了操作时间长等不足。,4.分离方法,吸附分离法（absorptive separation method）： 应用特殊处理的吸附剂，吸附小分子物质，而大分子的抗原-抗体复合物则在反应液中，经离心达到分离目的。 最常用：葡萄糖包被的活性炭。 优点：简单快速，经济易得。 缺点：非特异性结合较高，干扰因素较多。,4.分

15、离方法,固相分离法（solid phase separation method）： 将抗体或抗原吸附在固相载体上，免疫反应在固相载体上完成，结合终了弃去液体，即可达到分离目的。 固相材料：纤维素、凝胶颗粒、多孔玻璃微球等。 优点：不需离心，简便快捷且分离效果好。 缺点：分子抗体与固相连接时会造成亲和力下降，灵敏度会受影响。,操作基本步骤,加样：加样总体积要保持一致，所处的介质环境也要一致。 孵育：根据不同的分析对象孵育的温度和时间不同，一般 是37。 分离：选择好的分离方法分离游离抗原和抗原抗体复合物。 测量：测量游离或结合物部分的放射性。 数据处理：绘制标准曲线和待测物浓度的计算。,一个理想

16、的、没有误差的“完美”测定，应该是标本或样品中的分析物无论是在一次测定，还是多次重复测定，甚至在不同实验室进行测定，其测定结果都应该是一样的，它就是该样品中该分析物的真实水平，即真值。 真值是一个变量本身所具有的真实值，它是一个理想的概念，在实际工作中，这种理想的测定是不可能达到的。 即任何一种分析方法都会产生误差。,36,三、质量控制（quality control,QC）,误差的分类和来源,37,1. 系统误差,38,是由于试剂、仪器或操作方法上一个固定的缺陷而造成整批结果倾向性的偏差，影响了结果的准确性。 系统误差大小、方向恒定一致或按一定规律变化，即具有再现性，属于偏差（Deviati

17、on）。 系统误差是可以避免的。即通过理论分析/实验验证其产生的原因或规律，可消除或减少。,由特定原因引起、具有一定因果关系并按确定规律产生。,仪器、试剂、电源、环境、人为因素等。,2. 随机误差：,39,偶然性：原因不明确，其产生无规律。 产生原因主要是温度波动、振动、电磁场扰动等不可预料和控制的微小变化。 随机误差无法避免。 服从统计规律，增加平行测定次数，可以减少偶然误差。,三、质量控制,目的：对整个分析过程中的任何环节造成的误差进行经常性的检查，以保证分析误差控制在可接受的范围内。 实验室内部质量控制（室内质控）：实验室内的专业技术人员通过对整个检测系统的性能评价，评价检测结果的精确度

18、。 实验室间质量评价（室间质评）：由地区性或全国性机构通过发放一定数量的样本给各实验室进行检测，再收集各实验室的结果进行比较，得出共性或个性的信息，促进改进，考察实验室的准确性。,1. 室内质控检测系统性能评价,零标准管结合率(B0%):最大结合率，当标准抗原为零时标记抗原与抗体的结合率。30%50%，特异性抗体稳定性指标。,41,非特异性结合率(NSB%):不加特异性抗体时标记抗原与非特异性物质的结合率。5%10%。,最低浓度管和最高浓度管的结合率之差应大于30%。,标准曲线回归参数：截距a，斜率b值稳定，r0.99。斜率越大，灵敏度越高，但可测范围相对变小。,ED25、ED50、ED75

19、：结合率在25%、50%、75%时对应的抗原浓度值，反映标准曲线的稳定性，有助于批间结果的比较。,2. 室内质控质控品, 指专门用于质量控制目的的标本或溶液，不能用于校准。,42,分定值和不定值两种。,理想的质控品应该具有以下特征： 人血清基质； 无传染性； 添加剂和抑菌剂的量尽可能少； 瓶间差异小； 冻干品复溶后的定性好； 有效期1年以上。,2.室内质控质控图,将所测得的质控品结果按一定的规则逐日绘集在一起。,43,任选高、中、低三水平质控品进行室内质控。,最初使用应每月进行一次修正，重新计算均值和SD，连续23个月后，所控项目即可实现常态化。,按不同水平绘制的质控图,标 准 质 控 图（期

20、望）,真 实 质 控 图,2.室内质控失控的判断,判断失控的标准是质控规则。,46,当质控结果不能满足某一规则要求时，表示该批检测违背此规则。,如13s或22s规则：当一个质控结果超过 3SD 或连续2个结果超过 2SD 时，即为失控。 失控后需查明原因，待纠正后重新检测该批样本。,RIA质量控制常用指标,精密度（重复性）：是指同一个样品多次重复测定所得结果的一致程度。用变异系数（CV）表示，RIA通常要求批内CV5%，批间CV 5%10%。 准确度：是指测量值与已知真实值在数量上的符合程度，可用回收率来表示（回收率=测定值/真实值100%）。90%110%,精密度 准确度,精密度 准确度,精

21、密度 准确度,精密度 准确度,接近真值，准确度好；反之，准确度差 测值集中，精密度好；反之，精密度差,精密度、准确度,RIA质量控制常用指标,灵敏度：测定方法的最小可检出量，即从生物样品中能够检出某物质的最小浓度。RIA的灵敏度是指能够测定的用统计学方法可以与零剂量管相区别的最小量。 特异性：取决于抗体的特异性，交叉反应越少，特异性越好。一般用交叉反应率表示。 稳定性：试剂盒在适宜的保藏条件下（温度、湿度、光线等），在有效期内保持原有性能不变的能力。用间隔1-2周重复测定标准曲线的漂移情况来判断。,RIA质量控制常用指标,可靠性（健全性）：评价标准品与被测物的免疫活性是否相同，应有合理的正常值

22、及正常范围，正常与异常之间有良好的界限，借助标准曲线与样品稀释曲线的平行性来分析方法的可靠性。,51,室间质量评价（EQA）,利用实验室间的比对来确定实验室能力的活动。 常由一个外部独立机构（市、省或国家临床检验中心）按预先规定的条件，由多家实验室对相同样本进行检测，收集检测结果进行分析评价，再反馈信息给参评实验室，以此评价实验室操作的过程。 为实验室确保维持较好的检测水平、保证检验结果有较高的准确性而对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动。,卫生部临床检验中心全国实验室间检验质量评价合格证书,第三节 免疫放射分析,来源于RIA，是非竞争性的结合免疫反应。 特点是放射性核素标记的是抗体，而

23、不是标记抗原，测定对象仍是抗原。 灵敏度和可测范围均优于RIA，操作程序较简单。,（immunoradiometric assay,IRMA）,55,Ab*,+,Ag-Ab* + Ab*,Ag,（B）,（F）,用放射性核素标记抗体，过量的标记抗体与待测抗原混合，待充分反应后，除去游离的标记抗体，其放射性强度与待测抗原呈正比。,（一）基本原理,1. 单位点法,56,（二）IRMA的实验方法,该法在实际运用中需要采用特异性较高的单克隆抗体，而且每一种特定抗原均需专一的标记单克隆抗体，因而单位点法运用范围有限。,57,2.双抗体夹心法（double antibody sandwich method）

24、又称双位点法（Double-locus method）,将固相抗体先与待测物结合，再与125I标记的另一抗体反应，形成固相抗体-抗原-标记抗体复合物，洗去未结合抗体，测固相放射性。 第一抗体Ab1一般是抗原的特异性McAb抗体，以保证该方法的抗原抗体特异性结合。第二标记抗体也是针对抗原的，但却没有单克隆抗体的限制，应用更为广泛。,58,3.标记第三抗体法（labeled third antibody method）又称标记双抗法,夹心法中原来的标记抗体Ab2不再标记，而标记的第三抗体则是针对Ab2抗体的，即用Ab2抗体（若抗鼠）作为抗原去免疫兔（或羊）而得到的抗体。因此，Ab3抗体具有多用性。

25、,59,4.双标记抗体法(double labeled antibody method),利用抗原有多个抗原决定簇，在单抗制备上筛选出3个以上的特异性McAb，其中一个涂饰在固相上，其余两个分别进行125I标记，这样的复合物比活度高，利于提高灵敏度和精密度。,反应速度快：IRMA为非竞争性反应，且抗体是过量的，反应速度快，反应容易达到平衡，温度变化对结果影响不大。,60,特异性强：由于使用的是单克隆抗体，所以特异性一般比较高。,灵敏度高：理论上比RIA高出10100倍。但是要求有良好的分离方法的保证。,稳定性好：标记的是抗体IgG蛋白分子，含有多个酪氨酸或组氨酸残基，标记方法简单，稳定性好。,

26、（二）IRMA的优点,需要特殊的分离方法，目前还主要限于蛋白质和多肽抗原，很多小分子半抗原和短肽还不能应用。 由于IRMA中要分离的是游离抗体和抗原抗体复合物，都属于大分子，非特异的分离方法很难奏效。主要是靠单克隆抗体作为分离剂，因此在IRMA系统中需要两种抗体，至少需要两个抗原决定簇，对小分子的半抗原不合适。,61,（二）IRMA的缺点,RIA法与IRMA法的比较 RIA法 IRMA法 标记物 Ag Ab 原理 竞争性结合 非竞争性结合 抗体量 限量 过量 标准曲线 负相关 正相关 达到平衡的速度 慢 快 可测范围 窄 宽 应用对象 大分子、小分子 大分子 低剂量区不确定因素 有 无,63,

27、RIA法与IRMA法的比较 RIA法 IRMA法 标记物 Ag Ab 原理 竞争性结合 非竞争性结合 抗体量 限量 过量 标准曲线 负相关 正相关 达到平衡的速度 慢 快 可测范围 窄 宽 应用对象 大分子、小分子 大分子 低剂量区不确定因素 有 无,RIA法与IRMA法的比较 RIA法 IRMA法 标记物 Ag Ab 原理 竞争性结合 非竞争性结合 抗体量 限量 过量 标准曲线 负相关 正相关 达到平衡的速度 慢 快 可测范围 窄 宽 应用对象 大分子、小分子 大分子 低剂量区不确定因素 有 无,RIA法与IRMA法的比较 RIA法 IRMA法 标记物 Ag Ab 原理 竞争性结合 非竞争性

28、结合 抗体量 限量 过量 标准曲线 负相关 正相关 达到平衡的速度 慢 快 可测范围 窄 宽 应用对象 大分子、小分子 大分子 低剂量区不确定因素 有 无,第四节：非放射性标记免疫分析技术,近年来非放射性标记免疫分析技术发展很快，应用最广泛的有酶标记免疫分析、化学发光免疫分析、时间分辨荧光免疫分析和固相膜免疫分析等。 非放射性标记免疫测定法原理同于RIA或IRMA,只是使用一些发光物质来标记抗原或抗体，代替放射性核素作为测量的标记物 优点：高灵敏度和特异性，避免放射性免疫分析核污染和因核素衰变所致试剂有效期短的缺点。,酶标记免疫分析技术（enzyme immunoassay，EIA）是以免疫学

29、（抗原抗体反应的特异性）和酶学（酶促反应的生物放大作用）为共同基础发展起来的免疫分析技术。 原理：以酶标记的抗体或抗原与样本中待测抗原或抗体相结合形成酶标记抗原抗体免疫复合物，再利用酶促反应使底物与酶标记免疫复合物作用，使酶底物显色而被测定。 酶标记免疫分析的基本原理与放射免疫分析或免疫放射分析大致相同，不同点在于它是用各种酶标记物的配体（抗体或抗原）替代了放射性核素标记物的配体，与相应的特异分析物进行竞争或非竞争性的结合反应，产生酶标记配体与分析物的结合物。,70,一、酶标记免疫分析技术,应用最多的EIA是酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，E

30、LISA）。 ELISA方法是用聚苯乙烯作微量反应板，酶标记抗原或抗体，通过抗原、抗体的竞争性或非竞争性结合反应，形成特异性抗原-抗体复合物，然后观察在酶的催化作用下底物的显色情况，根据颜色的有无和深浅，可以判断待测标本中特异性抗原或抗体的有无以及其量的多少。 常用的示踪酶有辣根过氧化物酶、碱化磷酸酶和葡萄糖氧化酶等。,71,72,酶标记免疫分析仪器,酶标仪,洗板机,半自动酶标记仪：酶标仪与洗板机分离。,73,全自动酶标记仪：酶标仪与洗板机一体。,基于化学发光反应和免疫反应建立起来的免疫分析技，既具有免疫反应的高特异性，又具有化学发光的高敏感性。 基本原理与放射免疫分析和酶标记免疫分析技术几乎

31、完全相同，其区别仅在于标记物化合物的不同，因而测定方法各异。,74,二、化学发光免疫分析技术,1. 化学发光免疫分析 (chemiluminescence immunoassay，CLIA) 用能产生化学发光的化合物代替放射性标记物，标记抗原或抗体，其他步骤和RIA或IRMA基本相同，反应以后，利用碱性条件下化学发光物质在氧化物作用下可以发生单光子放射。检测光子的数量就可以反映复合物的量。 常用的化学发光物质是异鲁米那和吖啶酯。 缺点：发光时间集中在加入过氧化物或碱的短时间内，必须严格掌握测量时间。,75,76,吖啶酯发光反应原理,吖啶酯在碱性条件下被H2O2氧化时,发出波长为470nm的光，

32、具有很高的发光效率，光子的数量和吖啶酯的量呈正比，而吖啶酯的量反应复合物的量。,2. 化学发光酶免疫分析 （chemiluminescence enzyme immunoassay，CLEIA） 标记物是碱性磷酸酶标记的抗体。经过夹心法免疫反应（和IRMA相似），复合物带有酶标记，加入特殊的底物，酶促反应使底物断裂，使底物发射出光子，产生化学发光。 此法光子发射持续时间较长，可靠性比较好。,77,3. 电化学发光免疫分析 （electrochemluminescence immunoassay，ECLI） 应用电化学发光反应的底物三联吡啶钌作为标记物，标记方法是将其衍生物N-羟基琥珀酰胺（NH

33、S）酯，通过化学反应与抗体或不同化学结构的抗原分子结合，制成标记的抗原或抗体。 测定模式与ELISA相似。,78,电化学发光免疫分析优点,标记物可以循环利用，使发光时间更长、强度更高、易于测定； 敏感度高，可达pg/ml或pmol/ml 水平； 线性范围宽; 反应时间短，20分钟内可完成测定； 试剂稳定性好，25可保持1年以上。,80,不同品牌化学发光分析仪,Roche 601：三联吡啶钌,Abbott i2000：吖啶酯,Siemens XP：吖啶酯,Beckman：金刚烷,时间分辨荧光免疫分析技术（time-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA）是一种特殊的荧

34、光分析法，其原理是将能发荧光的稀土元素（即镧系元素）原子标记抗原或抗体，通过测定荧光量，定性或定量分析抗原或抗体，也可标记蛋白质、多肽、激素、核酸探针等。,81,三、时间分辨荧光免疫分析技术,基本原理：镧系元素在紫外线的激发下可产生持续一定时间、一定光峰的荧光，而其他非特异荧光寿命短，待其他光子衰减后探测特定波长的特异性荧光光子就可以检测复合物的量。,82,荧光衰退时间 铕：730000 ns 钐：50000 ns 一般荧光物质：10 ns,83,时间分辨 荧光免疫分析仪,TRFIA的特点,优点：特异性强、稳定性好、适用范围宽、样品用量少、自动化高、且速度快。,缺点：仪器主要靠进口，试剂品种少

35、，虽然国产的仪器已研制成功，试剂盒可兼容，但有待进一步完善。,胶体金标记分析技术（Colloidal-gold immunoassay, CGIA）是以胶体金为标记物, 应用于免疫组织化学或免疫分析中，对抗原或抗体物质进行定位、定性乃至定量研究的标记技术, 它已成为继放射性核素、荧光素和酶等标记技术之后的又一种新的标记技术。,85,四、胶体金标记分析技术,86,胶体金（Colloidal gold）,氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，金离子被还原后聚合成直径1150nm 的金颗粒, 由于静电作用，金颗粒之间相互排斥而悬浮成为一种稳定的胶体状态，形成带负电的疏水胶溶液, 故称胶体金。 胶体金

36、标记实际上就是蛋白质等高分子物质被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。因胶体金溶液中的金离子所聚合形成的金颗粒直经小，仅以纳米计（1150nm），故又称纳米金。因此，CGIA又称为纳米金标记技术。,87,胶体金试纸条示意图,有4个组分： 样品垫：为吸水滤纸。 胶体金垫：为玻璃纤维膜，膜上吸附着干燥的金标抗体。 硝酸纤维素膜：膜上包被着抗原或抗体条带和能与标记物直接起反应的质控物条带（检测带）。 吸水垫：为吸水滤纸。,胶体金标记分析技术的优缺点,POCT,POCT 是Point of Care Testing 的简称，是体外诊断（IVD） 行业的子行业。通过简化设计和技术创新，POCT实现便捷、快速

37、在患者身边现场检查，快速取得诊断结果。 与其他体外诊断产品相比，POCT产品具有三个方面的鲜明特色：检测时间，POCT产品缩短了从样本采集、检测到结果报告的检测周期；检测空间，POCT 属于在被检测对象身边的检测；检测的操作者，POCT 的操作者可以是非专业检验师，甚至是被检测对象本人。 由于POCT仪器便携、操作简便、结果及时准确等一系列优点，POCT 产品的应用极为广泛。从检测项目来分，主要集中在血糖检测、血气和电解质分析、快速血凝检测、心脏标志物快速诊断、药物滥用筛检、尿液分析、干式生化检测、怀孕测试、粪便潜血血液分析、食品病原体筛查、血红蛋白检测、传染病检测、甘油三酯和胆固醇等血脂项目

38、的检测等13 大项目。特别是对重症病人，POCT应用已深入到了到了检测生理功能的方方面面。,90,五、放免和非放免标记分析技术性能比较,非放射免疫分析的缺点,仪器价格昂贵（EIA除外） 配套药盒少、普及困难，只在大医院应用。,第五节 体外分析的临床应用,体外标记免疫分析技术应用范围十分广泛，其应用可概括以下几方面： 蛋白质和肽类激素：肌红蛋白，白蛋白、糖蛋白，免疫球蛋白等 ；甲状腺激素、甲状旁腺激素、垂体激素、性激素、肾上腺激素、心钠素等。 肿瘤标志物：AFP、CEA、CA系列等。 维生素类：叶酸、维生素B12、维生素D等 药物类：地高辛、苯巴比妥等 半抗原、病原体抗原,常规开展的检测项目,甲

39、状腺检测,甲状腺是最大的内分泌腺体，生产分泌甲状腺素、参与能量代谢。T4（95）和T3（5）。在体内T4可转化形成T3。 循环中大部分T4、T3因与甲状腺结合蛋白结合而无生物活性。极少数未结合的游离型激素具有极强的生物活性，尤其是FT3。,FT3T3 FT4T4,甲状腺,垂体前叶,下丘脑, 发病率不断上升(人群发病率9.9%) 饮食和其他生活习惯的改变 精神压力的变化 平均期望寿命的提高 检测的灵敏度不断上升 甲状腺疾病与其他疾病密切相关,甲状腺疾病（常见病）,甲状腺功能性、炎症性、免疫性、占位性疾病,在中国每15人中即存在1位甲减患者！全世界有近98%的甲减患者并不知道自己已经患病，甲状腺疾

40、病在女性和老年人中更常见 症状通常缓慢出现不引人注意，甲状腺疾病常被误诊为心脏病、抑郁月经问题绝经或者高脂血症。 美国最近的一项研究表明 “ 9.9%的人有甲状腺异常而绝大部分都被忽视 。”甲状腺疾病很常见不易发现且可能导致不良的后果 .。,甲状腺疾病 依赖“实验室检测”而诊断的疾病,检测体系的性能直接关系诊断的准确性,甲状腺检测菜单, 甲状腺功能 甲状腺自身抗体检测 甲状腺癌监测, Free T3（游离T3） Free T4 （游离T4） Total T3 （总T3） Total T4（总T4） TSH（促甲状腺激素） TgAb （甲状腺球蛋白抗体） TPOAb（甲状腺过氧化物酶抗体） TR

41、Ab （促甲状腺受体抗体） Tg（甲状腺球蛋白） PTH（甲状旁腺素） CT（降钙素）,甲状腺素 甲状腺素是在甲状腺滤泡内由酪氨酸碘化生成,T3：T4脱碘 35%,甲状腺合成 65%。99.6%与TBG 结合。 FT3 0.3 %,有活性。,甲状腺素由T4、T3、FT3、FT4组成 ，由甲状腺合成并分泌入血。FT3 、FT4是有生物活性的激素；T3、T4是甲状腺素的储存形式、测定血清T4、T3、FT3、FT4含量用于判断甲状腺的功能。甲状腺素参与机体的能量代谢。,超灵敏促甲状腺素（sTSH-first）,甲 减,亚 临 床 甲 亢,严 重 Graves 病,4.0 3.0 2.5 1.0 0.

42、5 0.4 0.1 0.01,轻 度 Graves 病,甲 减 风 险,甲 减 治 疗,妊 娠 上 限,低危DTC治疗,高危DTC治疗,甲 亢 风 险,TSH是反应甲状腺功能变化最敏感的指标，TSH灵敏度对检测至关重要。,甲状腺自身抗体,甲状腺抗体是指由于自身免疫紊乱产生的针对甲状腺某些成分的免疫球蛋白。 临床主要分为两大类： 针对甲状腺细胞内容物的抗体 甲状腺球蛋白抗体（TgAb） 甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb） 针对甲状腺细胞表面TSH受体的抗体 TSH受体抗体（TRAb）,甲状腺球蛋白抗体、甲状腺过氧化物酶抗体,甲状腺球蛋白抗体（TgAb)和甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb)，是由于

43、甲状腺细胞受损，胞浆内的“甲状腺球蛋白”及“过氧化物酶（合成甲状腺激素的关键酶）”溢入血液刺激机体而产生的，是自身免疫性甲状腺炎的标志性抗体，其水平升高表明甲状腺组织处于免疫性炎症活跃状态。 TPOAb与TGAb的临床意义相同，但TPOAb无论是敏感性还是特异性都要优于TGAb，是诊断甲状腺自身免疫性疾病的首选指标。为了提高检出率，临床通常采取两种抗体联合检测。,甲状腺球蛋白抗体、甲状腺过氧化物酶抗体,临床意义 病因诊断：此类抗体是诊断自身免疫甲状腺疾病（AITD）的主要依据，显著升高（强阳性）主要见于慢性淋巴细胞性甲状腺炎（桥本氏甲状腺炎）患者，中等程度升高常见于Graves病；还可用于AI

44、TD与非AITD的鉴别诊断，例如，原发性甲减与继发性甲减的鉴别，前者TPOAb、TgAb均阳性，后者则呈阴性。 疗效观察：Graves病患者经治疗后TPOAb及TgAb转阴或滴度下降提示疗效较好；如果抗体持续阳性且滴度较高，说明效果不好，停药后病情容易复发。 预后判断：TPOAb、TgAb升高，提示患者将来发生甲状腺功能减退的风险增加。 TgAb还可作为分化型甲状腺癌（DTC）的监测指标。正常情况下，分化型甲状腺癌患者TgAb水平会在根治术后逐渐降低，并在14年内转阴，如果TgAb水平再次升高，往往提示肿瘤复发。,TSH受体抗体（TRAb）,体液免疫B淋巴细胞产生的一类针对TSH受体的甲状腺特

45、异免疫球蛋白 甲状腺刺激抗体(TSAb)：与甲状腺滤泡膜上的TSH受体结合，刺激甲状腺肿大，增强其功能活性，是导致Graves病（毒性弥漫性甲状腺肿）的主要病因。 TSH刺激阻断抗体(TSBAb)：与TSH受体结合后，可抑制甲状腺功能，引起甲低。,TSH受体抗体（TRAb）,临床意义 TRAb对于Graves病的诊断、治疗以及预后评估具有重要价值。 Graves病患者TRAb阳性率可达95%以上，故TRAb阳性可以作为Graves病的诊断依据，临床也常用于Graves病与其他甲状腺病的鉴别。Graves病患者经过治疗甲功恢复正常后，如果TRAb（指刺激性抗体，即TSAb）也随之转为阴性，则停药

46、后复发的可能性小；若药物治疗后TRAb仍持续阳性，则说明治疗效果欠佳，停药后复发的可能性大。 对患有Graves 病的孕妇检测TRAb，有助于预测新生儿甲亢。TRAb能够通过胎盘，刺激胎儿甲状腺，引起新生儿一过性甲亢（发生率12%）。 有助于甲功正常的Graves眼病的诊断。临床上有些突眼病人，虽然甲状腺功能正常，但TRAb强阳性，这种情况同样可以诊断为Graves眼病。 TRAb在甲减和自身免疫性甲状腺炎患者也可出现阳性，检测TRAb有助于上述疾病的病因学诊断。, Tg是甲状腺合成的基质，正常情况下，外周血循环中含量极少，只有当甲状腺细胞大量破坏时才会从甲状腺细胞中释放入血。 对于甲状腺癌的

47、治疗后监测极其重要。 在甲状腺炎中可以增高。,甲状腺球蛋白,甲状旁腺素（PTH） 由甲状旁腺主细胞合成和分泌，和降钙素相互作用以维持血钙水平的稳定性，血钙升高抑制PTH的分泌，血钙降低则促进PTH的分泌。 PTH 原、继发甲旁亢 肾性骨病 异位性PTH分泌瘤 PTH 非甲状旁腺的恶性肿瘤和维生素D中毒引起的高钙血症 甲旁腺功能减退 特发性甲旁腺机能低下 甲旁腺损伤,降钙素（CT） 由甲状腺滤泡旁C细胞分泌的，主要功能是抑制破骨细胞介导的骨质吸收。 CT 甲状腺髓样癌的诊断 继发性甲状旁腺机能亢进，是CT分泌过多所致 异位CT的分泌，其它部位的肿瘤如肺燕麦样细胞癌 高胃泌素血症、胰腺 CT 甲状腺缺如 手术切除后,肿 瘤 标志物,恶性肿瘤诊断方法,肿瘤标志物（Tumor Marker，TM）的定义,存在于肿瘤细胞内或细胞膜表面物质，由肿瘤细胞表达分泌入血液等组织。 由机体对肿瘤发生免疫反应而产生并进入体液或组织中的物质。 这两类物质都可以被临床检测到，并用于指导肿瘤的诊断和治疗。 敏感度（sensitivity）：肿瘤患者检测结果为正确阳性的百分比。 特异度（specificity）：健康的或良性病变的个体检测结果为阴