真菌耐药监测2014.ppt

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1、真菌耐药监测,真菌概述 临床真菌学 抗真菌药物 真菌耐药机制 真菌耐药监测,临床微生物检验 郑碧英,真菌 Fungus,一大类真核细胞型微生物。细胞核高度分化，有核膜和核仁，胞浆内有完整的细胞器。细胞壁由纤维素、几丁质或葡聚糖组成，不含肽聚糖。含叶绿素，无根、茎、叶的分化。 从外界获取碳源，有性或无性繁殖，行腐生或寄生生活。 真菌与动物、植物、细菌的区别,真菌细胞的结构 fungal cellular structure,细胞壁 cell wall： 含几丁质、葡聚糖、甘露聚糖 细胞膜 cell menbrane： 含麦角固醇类化合物 ergosterol 细胞质 cytoplasm: 完善的

2、细胞器，其中核糖体ribosome 80S 细胞核：,单细胞真菌 Single-cell fungi： 多细胞真菌 Multicellular fungi： 两相性真菌 dimorphic fungi：,P99,根据细胞形态和结构分类,单细胞真菌 single-celled fungi,酵母菌 yeasts,酵母菌出芽繁殖 Yeasts reproduce by budding,酵母菌 yeasts,类酵母菌yeast-like fungi,假菌丝pseudohyphae,孢子spore,Budding 出芽繁殖,单细胞真菌 single-celled fungi,多细胞真菌 Multi-ce

3、llular fungi,孢子spore,菌丝hypha,丝状菌filamentous fungus或霉菌molds,菌丝的形态有助于真菌菌种鉴定,厚膜孢子、关节孢子和大分生孢子的形态有助于真菌菌种鉴定,二相性真菌 单细胞型： 酵母菌 多细胞型： 丝状菌,机体内寄生37,含动物蛋白培养基,沙保培养基25,普通培养基25,真菌的检验方法,镜检真菌形态 真菌分离培养与鉴定： 真菌抗原检测 真菌核酸检测 真菌代谢产物检测 免疫学检测 动物实验,临床标本,直接检查,直接镜检,核酸检测,分离培养,染色标本： 革兰染色 墨汁负染色法 乳酸酚棉兰染色法 荧光染色法,菌丝型,沙氏培养基,病理组织标本,真菌的检

4、验程序,不染色标本KOH法,动物试验,检测抗原,检测抗体,37,观察菌落,酵母型,25,小培养,镜检,生化反应,皮肤、指（趾）甲、毛发： 血液 脑脊液、胸腹水、脓液等 口咽、痰、泌尿生殖道标本（注意避开正常菌群的污染！） 浅部真菌感染：皮屑、指（趾）甲、毛发 深部真菌感染：痰、血液、脑脊液、分泌物,一、标本的采集,二、标本的直接检查,1. 不染色标本的检查：观察孢子和菌丝。 取皮肤癣屑、感染的毛发、指趾甲+10%20% KOH溶液（使角质软化）+盖玻片： 镜下观察观察孢子和菌丝。,菌丝,孢子,2. 染色标本的检查,1）革兰氏染色： 真菌比细菌大，直径5m以上。真菌革兰染色阳性，但着色不均。 2

5、）乳酸酚棉兰染色 3）墨汁负染： 4）荧光染色,三、真菌的分离培养,培养条件： 低营养、低温度（浅部真菌，2028，深部真菌为37）、低pH(4.0-6.0)、高湿度和氧 培养基： Sabouraud沙保培养基,酵母型真菌菌落,类酵母型真菌菌落,菌落：湿润、柔软而致密， 形态似一般细菌菌落,丝状菌落,四、真菌的鉴定,形态学检测及代谢试验 动物接种 病理组织检查 免疫学检查 核酸检测 真菌抗原测定 真菌代谢产物检测 假丝酵母菌显色培养基,真菌抗原测定,隐球菌抗原 乳胶凝集法检测新型隐球菌病患者的荚膜多糖抗原 GM试验（半乳甘露聚糖）：阳性提示曲霉感染 *半乳甘露聚糖是曲霉细胞壁的成分 G试验（-

6、D葡聚糖）: 阳性提示真菌感染 *-D葡聚糖是多种真菌细胞壁的成分 G试验无特异性，不能确定种属 G试验不能检测接合菌（毛霉、根霉）和隐球菌,浅部感染真菌Superficial fungi 引起皮肤表面真菌病、表皮真菌病、皮下真菌病 cause superficial mycoses，cutaneous mycoses, subcutaneous mycoses 深部感染真菌Systemic（Deep）fungi 引起深部真菌病deep mycoses,按感染的部位分类 Classification Based on Site,浅部真菌感染,侵犯皮肤角蛋白组织（表皮角质层、毛发，甲板），引起癣

7、病 浅部真菌分：皮肤癣菌和角层癣菌 感染源：接触患者、患畜或染菌物品,是指除表皮、毛发、甲床真菌感染以外侵犯内脏、皮下组织、皮肤(角质层以下)和粘膜的真菌引起的感染 深部真菌感染的病原主要可分为 致病性真菌如组织胞浆菌、球孢子菌、类球孢子菌、皮炎芽生菌、着色真菌、足分支菌、孢子丝菌等，感染多呈地区性流行 条件致病性真菌如念珠菌、隐球菌、曲菌、毛霉菌、放线菌、奴卡菌等属，在防御免疫功能低下者易获感染,深部真菌感染,口腔白假丝酵母菌 （1000）,外阴白假丝酵母菌 （1000）,临床真菌感染现况,随着移植、肿瘤和免疫缺陷患者的增多，侵袭性真菌感染（Invasive fungal infection

8、s ，IFI）越来越多 IFI：系指真菌侵入人体组织、血液，并在其中生长繁殖引致组织损害、器官功能障碍、炎症反应的病理改变及病理生理过程。 IFI的病原菌主要包括假丝酵母菌、曲霉,常见的真菌病,曲霉菌病 假丝酵母病 新生隐球菌病 浅部真菌病：皮肤癣菌病 真菌毒素中毒,常见的抗真菌药物的作用机制及其耐药性,抗真菌药物,按作用机制分类 1.作用于真菌细胞壁： 2.作用于真菌细胞膜： 3.作用于真菌核酸： 4.作用于真菌蛋白质合成： 5.其他：大蒜新素、冰醋酸、中草药,1）作用于真菌的细胞壁：,真菌细胞壁中含有甘露聚糖、几丁质、葡聚糖等主要成分 作用于1，3D葡聚糖合成酶类抗真菌药物：棘白菌素类药物

9、 作用于真菌细胞壁几丁质的药物：多氧菌素D和尼可霉素Z和X 研究中的作用于真菌细胞表面结构的其他抗真菌药物：,棘白菌素类抗真菌药物,抑制真菌细胞壁-(1,3)-D-葡聚糖的合成而干扰细胞壁合成 目前有卡泊芬净、米卡芬净和阿尼芬净3个品种。 对于念珠菌，曲霉等均有良好的抑制活性，对于一些双相真菌如组织胞浆菌、粗球孢子菌、皮炎芽生菌等也有抑制作用，但是对于新生隐球菌、镰刀菌、接合菌和白吉利毛孢子菌等无抑制活性。 不良反应较轻微，相对安全,棘白菌素类药物产生耐药性的主要机制,细胞壁的合成障碍: 细胞生长和形态改变过程中，细胞壁的合成和修护受到严密的调控，细胞壁在许多抗真菌药物的刺激下会产生适应性改变

10、而耐药； 在棘白菌素类药物的作用下，耐药真菌的部分受体Wsc1 和Mid2 会介导细胞壁出现相应的反应。,2）作用于真菌的细胞膜：,多烯类药物： 两性霉素B及其酯类制剂 吡咯类抗真菌药： 咪唑类、三唑类 烯丙胺类药物： 盐酸特比萘芬和盐酸荼替芬,（1）多烯类药物（polyenes）,直接和细胞膜上的麦角固醇结合，导致细胞膜的通透性增加而导致细胞死亡。 主要用于深部真菌感染。 包括：两性霉素B及其三种脂化两性霉素B、制霉菌素等；,两性霉素B,由链霉菌产生的抗真菌药物。 抗菌谱广： 念珠菌、隐球菌、组织胞浆菌、酵母菌、皮炎芽生菌、球孢子菌属等有效； 部分土曲霉天然耐药； 皮肤和毛发癣菌通常耐药。

11、作用强，耐药相对较低，是侵袭性真菌感染的标准治疗药物,两性霉素B,优点 抗真菌谱广，疗效确切，耐药真菌 少，半衰期长(24h)可一日一次用药 缺点 蛋白结合率高90%血药浓度相对较 低，不进入脑脊液，毒性大， 不良反应多(即刻肝、肾、血液、低 钾、心脏等) 给药需从小剂量递增 对某些真菌效差或无作用(曲菌、毛 霉菌、皮肤、毛发癣菌),两性霉素B剂型改进,两性霉素B脂质体L-AmB 两性霉素B脂质复合物ABLC 两性霉素B胶体分散体ABCD 作用：抗真菌作用与两性霉素B同，肾毒性低 适应症： （1）IFI的经验及确诊治疗。 （2）无法耐受两性霉素的患者。 （3）肾功能严重损害不能使用两性霉素B常

12、规制剂的患者,制霉菌素,制霉菌素口服不易吸收，主要用于局部用药。 用于皮肤、膀胱、口腔及阴道等的念珠菌感染, 体内过程和抗菌作用与两性霉素B基本相同, 但毒性更大且具有不溶解性。,制霉菌素脂质体减少了毒性,解决了制霉菌素的溶解性问题, 开发前景看好。 制霉菌素脂质体具有广谱抗真菌活性, 体外试验显示其可有效对抗一系列真菌菌株, 如念珠菌属、镰刀菌属、曲霉菌属等，对新型隐球菌属效果明显, 其中某些菌株对现有抗真菌疗法耐药。,制霉菌素脂质体(Nyotran),多烯类药物产生耐药性的主要机制,通过编码5，6-甾醇去饱和酶的基因发生突变，使其细胞膜中的麦角甾醇结构发生了改变，导致细胞膜的流动性改变，降

13、低了药物对细胞膜的亲和力。 对两性霉素B耐药菌的出现频率仍非常低。,通过抑制真菌细胞色素P450 依赖的-羊毛甾醇14 -去甲基化酶作用，导致麦角固醇合成受阻，使真菌的细胞膜合成受阻，导致真菌细胞破裂死亡。,（2）咪唑类抗真菌药物,吡咯类抗真菌药,包括咪唑类和三唑类衍生物两大类： 咪唑类: 酮康唑、克霉唑、咪康唑和益康唑等 （口服吸收差，目前均作为局部用药） 三唑类: 氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑,三唑类药物,1） 氟康唑抗菌谱窄,对大多数念珠菌、隐球菌有效，对曲霉无抑制活性,对克柔念珠菌天然耐药； 2）伊曲康唑较氟康唑抗菌谱宽,并对曲霉有抑制作用； 3）伏立康唑较氟康唑抗菌谱宽,并对曲霉、镰刀

14、菌和其它透明丝孢霉有抑制作用； 4）泊沙康唑抗菌谱最宽,对念珠菌,曲霉、镰刀菌、接合菌和其它透明丝孢有效。,吡咯类药物耐药作用机制,改变靶位蛋白与抗真菌药的亲和力： 唑类药物作用的靶酶是14-去甲基化酶，由ERG11 基因编码。ERG11 的突变可以改变14-去甲基化酶的氨基酸序列，当这种改变足以影响酶分子的空间构型时，酶分子与药物分子间的亲和力可能被削弱，导致菌株耐药。,由于甾醇去饱和酶的失活使真菌细胞膜对抗真菌剂的通透性下降，使药物不能进入真菌内。 真菌对药物的外排的作用增强，使唑类药物在细胞内的浓度达不到有效作用浓度。,吡咯类耐药的多药耐药泵,多药泵相关基因:（CDR1，CDR2）和MD

15、R1的过度表达有关 MDR1、CDR1、ERG11一定的次序出现：NDR1编码的mRNA出现于耐药的早期 EGR11编码的mRNA出现于耐药的中后期 CDR1基因编码的mRNA升高出现于耐药的后期；,（3）丙烯胺类抗真菌药物,抑制角鲨烯环氧化酶而干扰麦角固醇的生物合成，最终引起细胞死亡。 包括：萘替芬、特比萘芬 浅表真菌感染的外用药物：对皮肤癣菌如发癣菌（红色发癣菌、须疮癣菌、断发癣菌、堇色发癣菌）、犬小孢子菌和絮状表皮癣菌有杀菌活性，对念珠菌有抑菌活性。,3）作用于真菌核酸合成：,5氟胞嘧啶（5FC） 灰黄霉素,5氟胞嘧啶（5FC）,通过真菌细胞的渗透酶系统进入细胞内，转换为氟尿嘧啶，替代尿

16、嘧啶进入真菌的脱氧核糖核酸中，从而阻断核酸的合成。 抗真菌谱窄，仅对酵母菌(新型隐球菌)和酵母样菌(念珠菌属)有较高的活性。 临床上很少单独使用，常同与其他抗真菌药物合用,真菌耐药性的产生机制：,（1）真菌细胞内药物累积减少； （2）药物靶酶产生增多或靶酶结构改变； （3）靶酶的缺失，导致细胞代谢途径的改变； （4）生物被膜形成； （5）细胞壁的合成障碍； （6）细胞应激反应。,真菌药物体外敏感试验,测定病原真菌对抗真菌药物的敏感性或者测定抗真菌药物对病原真菌的抑制活性的体外试验方法 方法：稀释法、琼脂扩散法,体外活性测定指标,最低抑菌浓度（MIC）：是抑制某种细菌或真菌生长的最低药物浓度。常

17、用MIC90和MIC50来描述。 - MIC90是指某种药物能够抑制90%被测菌株生长的MIC - MIC50是指某种药物能够抑制50%被测菌株生长的MIC 最低杀真菌浓度（MFC,minimum fugicide concentration ） -杀死一定百分比（经典杀灭率为90%、98%、99%）真菌的最低药物浓度。,16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 .0625 .0313 C1 C2,MIC & MFC,MIC,MFC,真菌药敏试验测定方法,肉汤液基稀释法CLSI M27-A2，M38-A 琼脂稀释法 纸片扩散法CLSI M44-A Etest法,标准化药敏方法需考虑,

18、培养基 菌接种量 培养条件/方法 药物 质控,标准化的药敏方法,NCCLS（美国临床实验室标准化委员会），现已改名临床和实验室标准研究所（CLSI）制定的标准是普遍接受的标准 M27A2 酵母菌肉汤稀释法体外抗真菌药敏试验参考方法 M38A 丝状真菌肉汤稀释法体外抗真菌药敏试验参考方法 M44A 酵母菌纸片扩散法抗真菌药敏试验EUCAST标准（European Committee for Antibiotic Susceptibility Testing）,肉汤稀释法,可以提供更多的有关菌体对各种不同抗生素的定量信息，特别是可以给出相关抗生素的具体的抑菌浓度。 -使用肉汤稀释法进行不同药物的抗

19、菌活性的检测时，需将待测菌加到一系列试管中，其中含有定量浓度的经倍比稀释的药物，如稀释前的药物浓度为64ug/ml,其后每次取出前一管体积一半的液体加入等体积的培养基再次进行稀释，即倍比稀释使药物含量变为32ug/ml,如此反复。,16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 .0625 .0313 C1 C2 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 0.125 C1 C2,倍比稀释（Two-fold dilution）,新型隐球菌 72小时 其余菌株48小时 读取MIC结果,+,纸片扩散法,是将含有定量抗真菌药物的纸片置于接种定量真菌的平皿中，在一定温度下经过一定时间孵育后

20、，通过测量抑菌圈的大小来判断受试真菌对于该药物的敏感性； 该方法简单直观，已有商品化试剂； 缺点是不能精确量化。,琼脂稀释法,是将一定量的真菌接种于含有不同浓度抗真菌药物的平皿中，在一定的温度下经过一定时间孵育后，判断受试真菌对于该药物的敏感性 该方法简单，但用药量大，而且难以精确量化，尤其对于抑真菌剂,E-test真菌药敏试条,生产商 AB BIODISK，瑞典 原 理 属琼脂扩散法的改良，培养基采用RPMI 1640加2%的葡萄糖和1.5%的琼脂糖，用MOPs调节pH到7.0。药敏纸片采用包被梯度浓度抗真菌药物的试纸条。 适用范围 念珠菌、隐球菌和丝状真菌 检测药物 包括两性霉素B、5-氟

21、胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑和酮康唑,MIC,E-test 检测曲霉的MIC,将不同量的抗真菌药物包被在特殊试剂条上， 该方法操作简单、直观，与NCCLS法有较好的一致性,判断抗真菌药敏试验的结果,真菌对抗真菌药物是敏感还是耐药的判断，主要是通过将试验得出的MIC值同确定的药折点（break point）进行比较分析得出，不同药物的折点有不同的标准，常用的是是由NCCLS/CLSI制定的标准。 折点是根据抗真菌药物抑制真菌生长所需要的MIC。结合常用剂量时该药在人体内所能达到的血药浓度划分病原真菌对各种抗真菌药物敏感和耐药的界线。 是根据体外试验对药物在人体的临床疗效作出的预测。,根据折点判断结果

22、,敏感(S) 耐药(R) 中介(I) 剂量依赖性敏感（S-DD）,S-DD： Susceptible-Dose Dependent 剂量依赖性敏感，是指提高给药剂量后， 血液及组织中的药物浓度仍可 高于MIC浓度，即体内敏感。,判断抗真菌药的敏感性和耐药性,NCCLS/CLSI肉汤稀释法测定念珠菌体外敏感试验的临界浓度判读,判断抗真菌药的敏感性和耐药性,NCCLS/CLSI纸片扩散法测定念珠菌体外敏感试验 的临界浓度判读,抗真菌药的疗效受多种因素的影响,体内组织浓度 感染部位的病原菌浓度 疾病诊断的准确性 疾病的严重性，有无并发症 机体的免疫功能 不良反应的耐受性 其它的治疗措施,抗真菌体外药

23、敏试验的临床意义,药敏试验对临床有一定指导意义 抗真菌药敏试验与抗真菌治疗疗效的相关性尚未明确 不能单纯根据其MIC值来预测临床疗效 真菌体外药敏试验方法尚未完全成熟 由于疾病和人体的复杂性，很难确定体外抗菌活性和临床治疗结果之间的关系,体外抗真菌药敏试验与体内疗效,“90-60原则”MIC值与临床疗效 药敏试验敏感菌株：90%对治疗有效 药敏试验耐药菌株：60%对治疗有效,临床抗真菌药物耐药现况,在临床上，真菌感染率的上升，提高了对抗真菌药物的使用率，随之而来耐药菌株也不断增多，给临床的治疗带来一定的困难； 最近科学家证实：某些能够引起致命感染的曲霉菌对目前的抗真菌药已有耐药性，而且这种耐药

24、性正以惊人的速度蔓延。,抗真菌药物的化学分类,医院药房现有的抗真菌药,抗真菌药物现状,早期开发的抗真菌药物，如灰黄霉素、克霉唑等，因毒性大、抗菌谱窄、穿透力差，主要用于局部用药。 后期开发的新型抗真菌药物，如氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑等，在抗菌活性、抗菌谱、安全性以及生物利用度等方面都有了明显改善，目前在临床上正广泛使用。,真菌细胞壁 cell wall,细胞壁的主要成分为多糖，其次为蛋白质、类脂。 真菌细胞壁多糖主要有几丁质(甲壳质 ) 、葡聚糖、甘露聚糖等。 在不同类群的真菌中，细胞壁多糖的类型不同。酵母菌以葡聚糖为主，而丝状真菌则以几丁质为主。,真菌细胞壁结构分为有形微纤维部分和无定形基质部分。 微纤维部分都以几丁质（或以纤维素）为主构成细胞壁 骨架，而基质部分则犹如骨架上的填充物，包括葡聚糖、 甘露聚糖和一些糖蛋白质。,真菌细胞膜cell membrane,主要由蛋白质和脂类组成 真菌细胞膜中脂类含麦角固醇类化合物，易被抗真菌药物多烯族化合物结合（如两性霉素B）,真菌细胞质 cytoplasma,含有丰富的酶蛋白、各种内含物以及中间代谢物等，是细胞代谢活动的重要基地。 具有完善的细胞器，如核蛋白体、内质网 、高尔基体、 溶酶体 、微体等； 真核细胞的核蛋白体比原核细胞的大，其沉降系数一般为80S ，它由60S和40S 的2个小亚基组成。,