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1、生 物 化 学 Biochemistry,第三周 第二讲 2010.9.30,蛋白质章节测验1,班级、学号、姓名 问题一： 如何通过样品中的含氮量（N%）来大致地推测样品中粗蛋白的含量（Pro%）？ 解释这样推测的依据是什么？ 问题二： 维持蛋白质一、二、三级结构的主要作用力分别有那些？ 问题三： 凝胶过滤分离蛋白质的依据和原理？,通过本章的学习应该明确以下几个问题：,1、核酸的种类、基本组成单位是什么？ RNA的三种主要形式是什么？ 它们分别承担什么样的生物功能？ 2、DNA和RNA的一级结构和二级结构分别有何特征？ 3、什么是DNA的变性和复性？有何特征？,第一节 概述 一、核酸的发现与发
2、展,1869年核酸最早分离自外科绷带脓细胞的细胞核，当时发现这种物质含磷量之高超过当时发现的任何一种有机物，并且含有很强的酸性，故得名核酸。 1909年其组成被研究清楚，1944年生物功能初步澄清，后来在X射线衍射技术支持下建立双螺旋结构模型。,核酸的分类及分布,存在于细胞核和线粒体内。,存在于胞核、胞液和线粒体。,携带遗传信息，决定细胞和个体的遗传型(genotype)。,参与遗传信息的复制与表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。,遗传信息传递的中心法则,染色体的结构 示意图,第二节 核酸的组成,核酸,核苷酸,水 解,核酸的化学组成 除含C、H、O、N外，还含有较多的磷和少量的硫，含磷
3、量在910,一、磷酸（phosphate） OH HO-P=O OH,二、戊 糖,（构成RNA）,核糖(ribose),（构成DNA）,脱氧核糖(deoxyribose),嘌呤,嘧啶,碱基,腺嘌呤（A）,鸟嘌呤（G）,胞嘧啶（C）,胸腺嘧啶（T）,尿嘧啶（U）,DNA、RNA均有,DNA有,RNA有,每种核酸都含有四种碱基 。,三、碱基（nitrogenous base）,嘌呤(purine),腺嘌呤(adenine, A),鸟嘌呤(guanine, G),碱 基,嘧啶(pyrimidine),胞嘧啶(cytosine, C),尿嘧啶(uracil, U),胸腺嘧啶(thymine, T),四
4、、核苷（nucleoside) 核苷是核糖与碱基(嘌呤碱或嘧啶碱)结合物。 嘌呤核苷是嘌呤的第9位N与核糖或脱氧核糖第1位碳连接； 嘧啶核苷是嘧啶的的第1位N与核糖或脱氧核糖第1位碳连接；,碱基和核糖（或脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷(nucleoside) （或脱氧核苷）。,核苷酸： AMP, GMP, UMP, CMP 脱氧核苷酸： dAMP, dGMP, dTMP, dCMP,核苷（脱氧核苷）和磷酸以酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。,核苷酸是核苷的磷酸酯。 核糖核苷酸的磷酸酯有三种形式 (2、3和5位)； 脱氧核糖核苷酸的磷酸酯有两种形式 (3和5位)。,八种核苷酸如下表所示,M-单
5、(D-二、T三）；P-磷酸 RNA的名称为某苷(一磷)酸，DNA在某前加脱氧两字。 例如：AMP称腺苷一磷酸(或腺苷酸）， dAMP称为脱氧腺苷一磷酸（脱氧腺苷酸）。 稀有核苷酸与上类似；,多磷酸核苷酸： NMP，NDP，NTP,六、稀有组分（Minor components） 稀有组分是稀有碱基和稀有核苷的总称。 1、稀有碱基（Minor bases） 次黄嘌呤(I)、黄嘌呤(X)、5-甲基胞嘧啶(m5C)、二氢尿嘧啶(Dhu )、 5-羟甲基胞嘧啶(hm5C) 2、稀有核苷（Minor nucleoside） 假尿嘧啶核苷()、次黄嘌呤核苷、二氢尿嘧啶核苷。,一、核酸的一级结构 核酸的一级
6、结构是指核苷酸的组成及排列顺序（即碱基序列）。 DNA、RNA都是由许多核苷酸通过3、5磷酸二酯键将前一个核苷酸与后一个核苷酸连接起来，形成无分支的多核苷酸链。 在链的一端的一个戊糖的3位上OH是游离存在的，另一端的戊糖其5位上连有一个磷酸基团呈单磷酸酯状态，这两个末端分别称为3末端及5末端。,第三节 核酸的结构,核苷酸之间以3 , 5 -磷酸二酯键连接形成多核苷酸链，即核酸。,C,G,A,DNA一级结构的简写形式,核苷酸顺序又称碱基顺序，是蛋白质与RNA结构的生物语言。,A,核苷酸,首端,末端,书写方法,DNA 与RNA的区别,二、 DNA的二级结构 双螺旋结构,DNA双螺旋结构模型的要点
7、(1) DNA分子是由两条反平行的多聚脱氧核苷酸链，绕同一中心轴盘旋形成的右手螺旋结构； (2) 每条主链由脱氧核糖与磷酸通过3、5磷酸二酯键连接而成，并位于螺旋外侧。碱基位于螺旋内侧，碱基平面与螺旋中心轴垂直。螺旋表面有两条螺旋形的凹槽大沟和小沟。,(3) 两链间的碱基以氢键互相配对。A与T配有两个氢键，G与C配有三个氢键。 DNA分子所含嘌呤碱基的总数等于嘧啶碱基的总数(即A+G=T+C)碱基当量定律。 (4)维持双螺旋稳定的因素：横向为氢键，纵向为碱基间的堆积力。,DNA碱基组成的Chargaff规则 （1）腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等，即AT （2）鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数也相等，即GC
8、 （3）含氨基的碱基(腺嘌呤和胞嘧啶)总数等于含酮基的碱基(鸟嘌呤和胸腺嘧啶)总数，即A+C=G+T （4）嘌呤的总数等于嘧啶的总数，即A+G=C+T,所有DNA中碱基组成必定是A=T，G=C这一规律暗示A与T, G与C相互配对的可能性，为Watson和Crick提出DNA双螺旋结构提供了重要根据。,DNA双螺旋结构的多样性,Z型DNA,B型DNA,A型DNA,DNA的三级结构 DNA的三级结构是指双螺旋DNA的扭曲或再螺旋。,生 物 化 学 Biochemistry,第四周 第二讲 2010.10.9,RNA（核糖核酸） 主要分布在细胞质中，与蛋白质合成密切相关 Ribosomal RNAs
9、 (rRNA，核糖体RNA)占80%以上：与蛋白质构成核糖体，是合成蛋白质的场所 Messenger RNAs (mRNA，信使RNA) 占5%：合成蛋白质的模板 Transfer RNAs (tRNA ，转运RNA)占15%：在蛋白质合成中运输氨基酸,三、RNA的结构,RNA分子的基本结构是一条线性的多核苷酸链，由四种核糖核苷酸以3，5-磷酸二酯键连接而成。,（一）、信使RNA的结构与功能,2、其结构模式为 5-帽子-5非编码区-编码区-3非编码区- 3多聚A,1、真核mRNA链翻译产生一条多肽链。,5-帽子结构,(1) 大多数真核mRNA的5末端均在转录后加上一个7-甲基鸟苷，经焦磷酸与m
10、RNA的5-末端核苷酸相连，形成5，5-磷酸酯键。同时第一个核苷酸的C2可能也是甲基化，形成帽子结构（甲基鸟苷三磷酸）：m7GpppN-。,* mRNA结构特点,(2) 大多数真核mRNA的3末端有一个多聚腺苷酸 (polyA)结构，称为多聚A尾。,多聚腺苷酸（多聚A)的尾的作用可能是延长mRNA的寿命，从而可以增加蛋白质合成的数量。 此外，还可能有助于mRNA穿过核膜，进入细胞质执行其模板功能.,mRNA核内向胞质的转位 mRNA的稳定性维系 翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,mRNA的功能：作为蛋白质合成的模板。,* tRNA的一级结构特点 含稀有碱基较多 3末端为 CCA-OH
11、5末端大多数为G 由70-90个核苷酸组成,(二）、转运RNA的结构与功能,稀有碱基,* tRNA的二级结构 三叶草形,氨基酸臂,额外环,* tRNA的三级结构 倒L形,* tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,* rRNA的结构,（三）、核糖体RNA的结构与功能,* rRNA的功能 参与组成核糖体，作为蛋白质生物合成的场所。,核糖体的组成,第四节 核酸及核苷酸的性质,一、一般理化性质 核酸为多元酸，具有较强的酸性； DNA是线性高分子，粘度极大 均为极性化合物，难溶于有机溶剂。,嘌呤碱和嘧啶碱均含有共轭双键，因此，核苷、核苷酸、DNA和RNA在240290nm范围内均
12、有紫外吸收。 最大吸收峰在260nm左右。,二、紫外吸收性质,核酸的紫外吸收性质可以用于鉴定DNA和RNA的纯度，常用A260/A280比值来判断。 纯DNA A260/A280=1.8 纯RNAA260/A280=2.0 若样品的蛋白质含量增加，A260/A280比值怎样变化？,增色效应(hyperchromic effect)当核酸变性或降解时，其紫外吸收显著增强，这就是核酸的增色效应。 减色效应(hypochromic effect)当变性的核酸在一定条件下恢复其原有的性质时，其紫外吸收的强度又可恢复到原有的水平，这种现象称为减色效应。,三、核酸和核苷酸的两性解离,在核酸和核苷酸分子中，
13、既含有可以给出H+的磷酸基团，又含有可以得到H+的碱性基团(碱基上的-N=，如嘌呤的N1和N7，胞嘧啶的N3)，所以核酸和核苷酸是两性化合物，有等电点。,5 脱氧腺苷一磷酸,四、核酸的变性、复性和分子杂交 1、变性 (1) 概念 核酸变性是指核酸分子中双螺旋区域的碱基对之间的氢键受某些理化因素的作用而破坏，变成单链的过程。,核酸变性不涉及共价键的断裂，所以变性后相对分子量不变，但其理化性质和生物功能都会发生变化，最重要的表现为 溶液粘度降低 沉降速率增加 紫外吸收显著增强DNA可增加20-25% RNA可增加10%左右。 生物功能丧失或减弱。,DNA变性的本质：双链间氢键的断裂,(2) 引起核
14、酸变性的因素 高温 极端pH (pH10或pH4) 变性剂(如尿素等) (3) DNA的变性温度(Tm): DNA的变性不是随温度升高而逐步发生的，而是当温度达到某一数值时，在很窄的温度范围内，变性突然发生并迅速完成，就象晶体物质达到熔点时突然融化一样，这一温度就称为DNA的变性温度，也称为DNA的熔点，用Tm来表示。,实际上，Tm是增色效应达到最大值的50%时的温度。也就是说，DNA溶液的温度达到Tm时，将有50%的DNA双链处于解链状态。 DNA的Tm一般为8295。 Tm随DNA分子中G-C碱基对含量的增加而升高。它也与溶液的离子强度有关，一般情况下，离子强度低，Tm值小。,2、DNA的
15、复性 变性的DNA在适当条件下，两条彼此分开的互补单链又可以恢复碱基配对，重新成为双螺旋，这个过程称为DNA的复性（DNA renaturation）。 复性后的DNA的某些理化性质和生物活性也可以得到部分或全部恢复。如减色效应。 退火（annealing）: 即DNA由单链复性变成双链结构的过程。来源相同的DNA单链经退火后完全恢复双链结构，不同源DNA之间、DNA和RNA之间退火后形成杂交分子。,一定条件下，去除变性因素后，核酸恢复二级结构及生物活性的现象,退火（annealing）,(1) 降温速度。若热变性的DNA从高温(Tm)迅速冷却至低温(4以下)，则不能复性，此过程称为淬火。 (
16、2) DNA溶液的浓度越大，互补DNA链片段碰撞机会越多容易发生复性。 (3) DNA片段越大，DNA内部的顺序越复杂，扩散速度也越慢，互补链的相遇机会也越小，复性也越难。,与复性有关的因素,3、分子杂交（Hybridization ） 不同来源的变性DNA，若彼此之间有部分互补的核苷酸顺序，当它们在同一溶液中进行热变性和退火处理时，分子间部分配对成双链，这个过程称为分子杂交。,将胶浸泡在碱溶液中使DNA进行变性，然后将变性DNA转移到硝酸纤维素膜上（硝酸纤维素膜只吸附变性DNA)，在80烤46小时，使DNA牢固地吸附在硝酸纤维素膜上。,然后与放射性同位素标记的变性后的DNA探针进行杂交。 杂
17、交须在较高的盐浓度及适当的温度(68)下进行数小时或十余小时。,Southern印迹法 (Southern blotting),应用类似的方法也可用于分析RNA、蛋白质。 将RNA变性后转移到硝酸纤维素膜再进行杂交，这方法称Northern印迹法(Northern blotting)。 根据抗体与抗原可以结合的原理，也可以分析蛋白质。这个方法称Western印迹法(Western blotting),核酸分子中含有核糖和磷酸，它们可以分别与专一性的化学试剂发生颜色反应，作为定性、定量检测核酸的依据。,六、核酸的呈色反应,(1) 核糖的地衣酚(3，5-二羟基甲苯)反应 用于定量测定RNA的含量。,(2) 脱氧核糖的二苯胺反应 用于定量测定DNA的含量。,(3) 核酸中磷酸的定量测定经典的钼蓝法 磷酸与钼酸铵作用产生磷钼酸，其在还原剂的作用下形成蓝色的钼蓝 RNA和DNA的含磷量分别为9.2%和9.5%。,核酸的分离和纯化 核酸碱基顺序分析 聚合酶链式反应 （自学内容）,Frederick Sanger,Kary Mullis,