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1、1,2,毒理学 TOXICOLOGY,3,第四章 毒作用机制 Mechanisms for Toxicity,4,毒理学研究的三个主要研究领域：,机制毒理,管理毒理,描述毒理,5,化学暴露后毒性发展可能存在的阶段,河豚毒素,乙二醇,组织坏死、癌症和纤维化,6,第四章 毒作用机制,第一节 终毒物的形成 第二节 与靶分子的反应 第三节 细胞功能障碍 第四节 修复障碍 第五节 表观遗传机制,7,第一节 终毒物的形成,8,概念： 终毒物（ultimate toxicant）是指直接与内源靶分子（如受体、酶、DNA、微丝蛋白、脂质）反应或引起机体生物学微环境改变、导致机体结构和功能紊乱并表现毒物毒性的物
2、质。,9,终毒物可为机体所暴露的原化学物（母化合物）；而另外一些毒物的毒性主要是由于其代谢物引起，生物转化为有害产物的过程称为增毒（toxication）或代谢活化（metabolic activation）。 最为多见的情况是增毒形成：亲电子、自由基、亲核物、氧化还原性反应物。,10,毒物的转运过程毒性 发展的第一阶段,吸收,分布到靶器官,重吸收,增毒作用,暴露位点 皮肤、胃肠道、呼吸道 注射/叮咬位点、胎盘,毒物,转运,进入大循环前清除,由靶部位向外分布,排泄,解毒作用,终毒物,靶分子,（蛋白质 脂质 核酸大分子复合物）,靶部位,11,终毒物主要类型：,外源化学物在体内经生物转化为终毒物的
3、过程称为增毒（toxication）。,12,1.亲电子剂的形成,亲电子剂是含有一个缺电子原子（带部分或全部正电荷）的分子。该缺电子原子中的部分或全部正电荷使其很容易通过共享电子对的方式与亲核剂中富含电子的原子反应。 化学物在代谢活化时形成非离子亲电子剂。亲电子剂经常是在外源化合物被细胞色素P-450或其他酶氧化成酮类、环氧化物及芳烃氧化物、,-不饱和酮及醛类、醌类或醌亚胺类以及酰基卤等过程中形成的。,13,苯并(a)芘benzo (a) pyrene，BaP,7,8-环氧苯并(a)芘,7,8-二羟-BaP,7,8-二羟基-9,10-环氧BaP,P-450,环氧化物 水解酶,(终致癌物),苯并
4、(a)芘benzo (a) pyrene，BaP,7,8-环氧苯并(a)芘,7,8-二羟-BaP,苯并(a)芘benzo (a) pyrene，BaP,7,8-环氧苯并(a)芘,7,8-二羟基-9,10-环氧BaP,7,8-二羟-BaP,苯并(a)芘benzo (a) pyrene，BaP,7,8-环氧苯并(a)芘,14,亲电物的形成涉及许多化学物的增毒作用，这种产物常常是通过插入一个氧原子而产生，该氧原子从其附着的原子中抽取一个电子，使其具有亲电性。 另一种情况是共轭双键形成，它通过氧的去电子作用而被极化，使得双键碳之一发生电子缺失（即成为亲电子的）。 汞氧化为二价汞离子；CrO42- Cr
5、3+等 化学键的异裂（C-O,N-O),亲电子剂的形成,15,2.自由基形成,自由基（free radicals）是外层轨道中含有一个或多个不成对电子的分子或分子片段。自由基主要是由于化合物接受一个电子、丢失一个电子或共价键发生均裂而产生。其共同特点是：具有顺磁性、其化学性质十分活泼、反应性极高，因而半减期极短，一般仅能以s计，作用半径短。,16,自由基的来源与类型,以氢为中心 以碳为中心 以硫为中心 以氮为中心 以氧为中心 过渡金属离子,H原子（一个质子，一个 原子） 三氯甲基自由基CCL3 （由H 抽出形成膜脂质中的碳中心 自由基L ） 烷留自由基R-S 苯基二肼自由基C6H5N=N 无机
6、：超氧阴离子（O2 ） 羟基自由基( OH) 有机：烷氧自由基（LO ) 过氧自由基（LO2 ) Cu+/Cu +。Fe +/Fe +. Ti()/Ti（）,从含碳化合物抽出H原子常启动自由基的 链式反应。例如，HO+能通过从膜脂质的 脂肪酸侧链抽出H而启动脂质过氧化L-H+OH -L+H2O CCL4毒性的主要原因 硫基化合物氧化时产生的活性自由基（由过渡 金属促进） 参与苯肼的红细胞毒性 氧化应激的主要动因：-OH十分活跃，O2-较 弱。由L与O2反应产生（LO和LO2);任何碳 中心自由基通常迅速与O2反应产生过氧自由基。 如CCL3+O3-O2CCL3 接受和供给电子的能力使它们成为自
7、由基反应 的重要催化剂,2,2,3,注：O2本身是自由基；双原子氧分子有2个不配对电子，所以氧经单电子还原02-（一个不配对电子）故H2O2不是合格的自由基，虽然它能形成OH而成为重要的氧化剂。,17,在与生物体有关的自由基中，最主要的是氧中心自由基，这类自由基持续不断地在机体内产生。活性氧(reactive oxygen species,ROS)这个术语实际上是一个集合名词，不仅包括氧中心自由基如O2-，和OH，而且也包括某些氧的非自由基衍生物，如H2O2、单线态氧和次氯酸，甚至还包括过氧化物、氢过氧化物和内源性脂质及外来化合物的环氧代谢物，因为它们都含有化学性质活泼的含氧功能基团。,18,
8、自由基形成 自由基在生物体内来源有二：一是细胞正常生理过程产生；二是化学毒物在体内代谢过程产生。 许多外来化合物可通过各种不同途径产生自由基，但其中最主要的途径是通过氧化还原反应（redox cycling）。它通过加入一个单电子使化学物还原为不稳定的中间产物，随后这个电子转移给分子氧而形成超氧阴离子自由基(O2-)，而中间产物则再生为原化学物。如：百草枯(PQ+)、阿霉素(DR)和硝化呋喃托英(NF)可从还原酶接受一个电子形成自由基。,19,20,亲核物在过氧化物酶催化下失去一个电子而形成自由基：酚类，氢醌，氨基酚等 共价键的均裂：水在电离辐射作用下均裂为OH，CCl4形成CCl3，H2O2
9、均裂为OH和 OH,21,3.亲核物的形成 亲核物的形成是毒物活化作用较少见的一种机制。例如： 苦杏仁经肠道糖苷酶催化形成氰化物；丙烯腈环氧化和随后谷胱甘肽结合形成的氰化物；以及硝普钠经巯基诱导降解后形成氰化物，等。,22,4.活性氧化还原反应物 除了上述那些机制外，还存在着一种特殊的产生氧化还原活性还原剂的机制。引起高铁血红蛋白的亚硝酸盐，既可在小肠中由硝酸盐经细菌还原生成，也可由亚硝酸酯与谷胱甘肽反应而生成。还原性化合物如抗坏血酸等以及NADPH依赖性黄素酶等还原酶可使Cr6+还原为Cr5+，Cr5+反过来又可催化HO生成。,23,二 解 毒,消除终毒物或阻止终毒物生成的生物转化过程称为解
10、毒（detoxication）。 在某些情况下，解毒过程与代谢活化过程竞争同一外源化学物。,24,（1）无功能基团毒物的解毒：,一般情况下，苯和甲苯等不含功能基团化学物的解毒分两相。首先，通常由细胞色素P450将羧基和羟基等功能基团引入分子中。随后，通过转移酶将内源性酸如葡糖醛酸、硫酸或氨基酸结合到这些功能基团上。除了某些例外，多数化合物的最终产物无反应活性，是易于排泄的高度亲水的有机酸。,25,（2）亲电子剂的解毒：,亲电性毒物较为普遍的解毒方式是与亲核剂谷胱苷肽结合。该结合反应可以是自发的，也可由谷胱甘肽-S-转移酶催化。Ag+、Cd2+、Hg2+和CH3Hg+等金属离子易与谷胱甘肽结合而
11、解毒。亲电子剂较为特殊的解毒机制是环氧化物和芳烃环氧化物被环氧化物水化酶催化分别生成二醇类及二氢二醇类化合物。,26,其他的解毒方式还有，由DL-黄递酶催化氢醌的双电子还原反应；醇脱氢酶催化,-不饱和醛还原成醇，或醛脱氢酶催化,-不饱和醛氧化成酸;金属硫蛋白与有巯基反应活性的金属离子形成复合物；具有氧化-还原活性的亚铁离子可为铁蛋白结合解毒。,27,（3）亲核剂的解毒：,亲核剂一般通过亲核性功能基团的结合反应进行解毒。如羟基化合物与硫酸或葡糖醛酸结合，硫醇类与葡糖醛酸结合，胺类和肼类化合物被乙酰化。这些结合反应可防止过氧化物酶催化亲核剂生成自由基，也可防止酚类、氨基酚类、儿茶酚类以及氢醌类化合
12、物经生物转化形成亲电性醌类及醌亚胺类化合物。,28,（4） 自由基的解毒： 酶性抗氧化系统 a SOD：是一类含有不同辅基的金属结合酶家族，如Cu、Zn-SOD与Mn-SOD。它们在细胞内定位变化很大，Cu、ZnSOD存在多种脏器内如肝脏、红细胞，而Mn-SOD主要在线粒体。它的唯一生理功能是歧化超氧阴离子(O2-)，生成H2O2和O2。 b 过氧化氢酶（CAT）：位于肝细胞和红细胞内过氧化小体中，其主要功能是将H2O2转化为水。,29,超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽氧化酶（GPO）和过氧化氢酶（CAT）对超氧阴离子自由基（O2）的解毒作用。,30,c GSH-Px（GPO）：在机体内广泛
13、存在，能特异地催化谷胱苷肽过氧化物的还原反应，使过氧化物转化为水或相应的醇类。可阻断脂质过氧化的链锁反应。 d 谷胱苷肽还原酶（GR）：其分布同GSH-Px，主要功能是产生还原型的谷胱苷肽(GSH)，以保护机体解毒功能的执行。 e 心肌黄酶(DT diaphorase):葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。,31,非酶性抗氧化系统 在生物体系中广泛分布着许多小分子，它们能通过非酶促反应而清除氧自由基。例如，维生素C、维生素E、GSH、尿酸、牛磺酸和次牛磺酸等。,32,蛋白质毒素的解毒,胞内或胞外的蛋白酶可能在毒性多肽的解毒中起作用。在蛇毒中发现的几种毒素(如,-银环蛇毒素，永良部海蛇毒素，磷酯酶)中含有分
14、子内二硫键，这些二硫键是其保持活性必不可少的。硫氧还蛋白可使上述几种蛋白失活。硫氧还蛋白是一种可还原必需二硫键的内源性二巯基蛋白。,33,解毒过程失效,解毒能力耗竭：毒物可能使解毒过程失效，引起解毒酶耗竭、共底物（cosubstractes）的消耗、胞内抗氧化剂如谷胱甘肽耗竭，最终导致终毒物的蓄积（溴化苯 ）。 解毒酶失活：偶尔可见某种具有反应活性的毒物使解毒酶失活。例如，ONOO使Mn-SOD失效。正常情况下，Mn-SOD对抗ONOO的形成。 某些结合反应可被逆转。 解毒过程有时产生潜在有害副产物，如自由基解毒过程中产生的谷胱甘肽自由基和谷胱甘肽二硫化物。,34,第二节 与靶分子的反应,35
15、,毒理学上相关的靶标是大分子，如核酸（特别是DNA）和蛋白质。在小分子中，膜脂质最为常见。 内源性分子作为一个靶分子必须具有合适的反应性和（或）空间构型，以容许终毒物发生共价或非共价反应。为了发生这些反应，靶分子必须接触足够高浓度的终毒物，因此，处于反应活性化学物邻近或接近它们形成部位的内源性分子常常是靶分子。,36,共价结合（convalent binding）: 指化学毒物或其具有活性的代谢产物与机体的一些重要大分子发生共价结合，从而改变核酸、蛋白质、酶、膜脂质等生物分子的化学结构与其生物学功能。加合物(adducts)指活性化学物与细胞大分子之间通过共价键形成的稳定复合物。 亲电子剂对亲
16、核原子表现出某些选择性，取决于它们的电荷/半径比。一般而言，软亲电物较易与软亲核物（二者均具有较低的电荷/半径比）反应，而硬亲电子较易与硬亲核物（二者均具有较高的电荷/半径比）反应。,反应的类型：,37,中性自由基如HO、NO2和Cl3C也能共价结合于生物分子。Cl3C加入到脂质的双键碳或脂质自由基产生含有氯甲基脂肪酸的脂质。 HO加入到DNA碱基导致许多产物的形成，包括8-羟嘌呤、5-羟甲基嘧啶以及胸腺嘧啶和胞嘧啶的乙二醇。,共价结合是不可逆的。,38,反应的类型：,非共价结合（nonconvalent binding）: 通过非极性交互作用或氢键与离子键的形成，具有代表性的是毒物与膜受体、
17、细胞内受体、离子通道以及某些酶等靶分子的交互作用。 去氢反应； 电子转移： 酶促反应,39,毒物对靶分子的影响,毒物对靶分子的影响主要包括两种主要机制： （1）通过作用于靶分子，引起靶分子功能失调 （2）破坏靶分子的结构,40,（一）靶分子的功能失调,以蛋白质为靶 与酶结合；与受体结合（活化或抑制）；与微管蛋白或肌动蛋白结合；毒物与蛋白质交互作用而改变其结构时，蛋白质的功能即发生损害 以DNA为靶： 干扰DNA的模板功能:如黄曲霉毒素、化疗药多柔比星,41,（二）靶分子的结构破坏,毒物通过与内源性分子形成加合物、发生交联和断裂而改变内源性分子的一级结构。 某些靶分子在外源化学物作用下引起自发性
18、降解。自由基（如CL3COO和HO）引起脂肪酸脱氢而启动脂质的过氧化降解。 毒物可引起几种形式的DNA断裂。,42,（三）新抗原形成,尽管外源化学物及其代谢产物与生物大分子的共价结合对多数个体免疫系统并不产生严重后果，但在某些个体，与外源化学物共价结合的蛋白质作为新抗原，激发免疫应答。,43,靶分子的属性： 反应性 易接近性 关键功能,终毒物,靶分子,反应类型 非共价结合 共价结合等,结果 功能障碍 结构破坏 新抗原形成,44,第三节 细胞调节功能障碍,45,毒性发展的第三阶段：细胞调节或维持功能的改变,靶分子作为效应的决定因素,靶分子 的作用,细胞调节 （信号）,细胞 维持,基因表达的 调节
19、障碍,瞬间细胞功能 的调节障碍,损害内部的维持,损害外部的维持,不适当 细胞分裂形成肿瘤，形成畸胎 凋亡组织退化，形成畸胎 蛋白合成如，过氧化物酶体增生,如，不适当的神经肌肉活动 震颤，抽搐，痉挛，心律失常 昏迷状态，麻痹，感觉异常,损害整合系统功能 如，止血功能损害出血,损害 ATP合成 钙离子调节 蛋白合成 细胞损伤/死亡 微管功能 膜功能,46,细胞功能障碍的发生遵循一定的先后次序，通常细胞在受到外界有害刺激下，首先会发生细胞应激；若细胞损伤进步加重，则会引起细胞调节功能障碍，最终导致细胞稳态失调，甚至出现细胞死亡。,47,一、细胞应激,概念：细胞处于不利环境和遇到有害刺激时产生的防御或
20、适应性反应。 热应激、缺氧应激、氧化应激、内质网应激和遗传毒性应激。,48,导致机体细胞应激的情况： 接触某些外源性物理因素，化学物或生物因素（应激原） 机体某些必需物质的缺乏 机体内环境失平衡,49,应 激 原,DNA损伤性应激原,非DNA损伤性应激原,基因毒性应激,紫外线、化学致畸、致癌和致突变剂等,非基因毒性应激,缺氧、创伤、感染、 热应激等,50,热应激 氧化应激 缺氧应激 内质网应激 遗传毒性应激,51,细胞应激意义,是机体面对有害因素刺激的防御性反应，有利于维持机体内环境的相对稳定； 引起细胞信号转导的迅速改变， 某些重要的信号分子或信号通路改变可能损害细胞的正常功能。,52,二、
21、毒物引起的细胞调节功能障碍：,（一）基因表达调节障碍：,1.转录调节障碍： 遗传信息从DNA转录给mRNA 主要受转录因子（TFs）与基因的调节或启动区域间的相互作用所控制。通过与这一区域的核苷酸序列相结合，激活的转录因子促进前起始复合物的形成，促使相毗邻的基因的转录。外源化学物可与基因的启动子区域、转录因子或前起始复合物的其他元件交互作用，然而，转录因子激活作用的改变似乎是最常见的方式。,53,54,模拟天然配体：TCDD与AhR；Cd2+模拟Zn2+；DDT与雌激素受体结合等 通过配体激活的TF介导引起毒性 通过作用于配体激活的TF使其活化而致基因的过度表达：PCB可以使细胞色素氧化酶诱导
22、,55,56,2、信号转导调节障碍： 细胞外信号分子，如生长因子、细胞因子、激素和神经递质能利用细胞表面受体和细胞内信号转导网络激活TFs。这些TFs控制着影响细胞周期进展、决定细胞结局的基因的转录活性，如c-Fos 和c-Jun蛋白等。,57,58,化学物可通过多种途径引起信号转导的异常，最常见的是通过改变蛋白磷酸化，偶尔也通过干扰G蛋白（Ras）的GTPase活性、破坏正常的蛋白质蛋白质交互作用、建立异常的交互作用、改变信号蛋白的合成与降解。,59,60,3. 细胞外信号产生的调节障碍 脑垂体前叶激素通过作用于细胞表面受体，促进外周内分泌腺细胞有丝分裂并调控外周腺体激素的分泌；而外周腺体激
23、素负反馈调控脑垂体激素的产生。 除草剂amitrole抑制甲状腺激素分泌、苯巴比妥促进甲状腺激素代谢，继而降低甲状腺激素水平，通过反馈调控增加垂体促甲状腺激素（TSH）的分泌，过量TSH刺激甲状腺细胞的分裂，导致甲状腺肿或甲状腺肿瘤的发生。,61,（二）细胞瞬息活动的调节障碍：,特定细胞正常运行的控制是通过作用于膜受体的信号分子来实施的，这些受体通过调节Ca2+进入胞浆或刺激细胞内第二信使的酶促形成而传递信号。 Ca2+或其他第二信使最终改变功能蛋白质的磷酸化，改变其活性，随后几乎立即引起细胞功能的变化。毒物可通过中断信号连接过程中的任何一个步骤而影响细胞的瞬息活动。,62,电可兴奋细胞的调节
24、障碍:,其他细胞活动的调节障碍,63,三、毒物引起的细胞稳态失调,（一）细胞稳态失调的机制,1. 危害细胞存活的原发性代谢紊乱：ATP耗竭、细胞内Ca2+蓄积、ROS/RNS过度生成 ATP耗竭： ATP作为生物合成的重要原料和能量的主要来源，在细胞维持中起核心作用。它对肌肉收缩和细胞骨架的聚合作用、细胞运动、细胞分裂、离子，囊泡转运提供能量和维持细胞形态都是必不可少的。,64,65,细胞内Ca2+持续升高 ROS与RNS的过度产生 原发性代谢紊乱之间的相互关系 ATP耗竭与细胞内高钙 细胞内高钙与ROS、RNS产生 ROS、RNS产生与ATP,66,(二）细胞稳态失调的后果： 细胞稳态失调
25、细胞损伤 细胞死亡 坏死（necrosis） 线粒体Ca2+摄取、m下降、ROS和RNS生成、ATP耗竭和原发性代谢紊乱（如：无机磷、游离脂肪酸和溶血磷脂的蓄积）均是引起线粒体内膜渗透性（称之为MPT）突然升高的重要因素。,67,细胞凋亡（apoptosis） 对细胞能量代谢、Ca2+稳态和氧化还原状态造成不良影响并最终引起细胞坏死的外源化学物也可诱发另一种形式的细胞死亡细胞凋亡。 引起细胞凋亡的途径主要有：线粒体途径，死亡受体途径和内质网应激途径,68,ATP的利用度决定细胞死亡的形式 ATP的利用度是决定细胞死亡形式的关键。Ca2+暴露的肝细胞、Fas刺激的T淋巴细胞和HOOH暴露的内皮细
26、胞等不同实验模型中，当细胞耗竭ATP时出现坏死，但当提供ATP生成的基质而使ATP耗竭得以缓解时，则发生凋亡。,69,细胞坏死 细胞和细胞器肿胀、核染色质边集 细胞膜、细胞器膜和核膜破裂、崩解、自溶,细胞凋亡 细胞和细胞器皱缩，胞质致密，核染色质边集 胞质分叶状突起并形成多个凋亡小体，并与胞体分离，邻近巨噬细胞等包裹、吞噬凋亡小体,70,受损细胞命运的“决定方案”,71,细胞程序性坏死,72,细胞外部维持的损害,毒物也能干扰给其它细胞、组织或整个机体专门提供支持的细胞。 例如，肝细胞产生并释放多种蛋白质和营养素进入血液循环，将循环中胆固醇和胆红素分别转化为胆汁酸和胆红素葡萄糖醛酸酯，这些过程发
27、生障碍对机体和肝脏自身均是有害的 ；杀鼠灵灭鼠机制,73,靶分子作为效应的决定因素,靶分子 的作用,细胞调节 （信号）,细胞 维持,基因表达的 调节障碍,瞬间细胞功能 的调节障碍,损害内部的维持,损害外部的维持,不适当 细胞分裂形成肿瘤，形成畸胎 凋亡组织退化，形成畸胎 蛋白合成如，过氧化物酶体增生,如，不适当的神经肌肉活动 震颤，抽搐，痉挛，心律失常 昏迷状态，麻痹，感觉异常,损害整合系统功能 如，止血功能损害出血,损害 ATP合成 钙离子调节 蛋白合成 细胞损伤/死亡 微管功能 膜功能,74,第四节 修复障碍,75,一 损伤修复机制,76,二 修复障碍,首先，修复机制保真度并非绝对，某些损
28、伤的修复可能被遗漏； 其次，损伤程度超过机体修复能力时，修复失效； 此外，修复所必需的酶或辅因子被消耗时，修复能力耗竭； 最后，某些毒性损害不能被有效地修复，例如当出现外源化学物共价结合于蛋白质时，机体不能有效地修复,（一）修复障碍,77,DNA修复失效,细胞凋亡失效,终止细胞增生失效,非遗传毒性致癌物,78,化学暴露后毒性发展可能存在的阶段,河豚毒素,乙二醇,组织坏死、癌症和纤维化,79,第五节 表观遗传机制,80,表观遗传调控机制,表观遗传学是研究从基因演绎为表型的过程和机制的一门遗传学分支学科。 表观遗传信息提供何时、何地和如何应用遗传信息指令，在时空顺序上调控基因表达。 表观遗传修饰不
29、涉及DNA序列改变，但可以通过细胞分裂遗传给子代细胞。,81,真核细胞的表观遗传调控机制,DNA甲基化 组蛋白修饰 染色质重塑 非编码RNA,82,毒物毒作用的表观遗传机制,化学致癌的表观遗传机制 胚胎发育毒性损害的表观遗传机制,83,Summary,the mechanisms of toxicity may be considerably complicated. First, the toxicant is delivered to its target or targets, after which the ultimate toxicant interacts with endoge
30、nous target molecules, triggering perturbations in cell function and/or structure, which initiate repair mechanisms at the molecular, cellular, and/or tissue levels. When perturbations induced by the toxicant exceed repair capacity or when repair becomes malfunctional, toxicity occurs.,84,Actually,
31、one chemical may yield several ultimate toxicants. On the other hand, one ultimate toxicant may react with several types of target molecules. In addition, reaction with one type of target molecule may induce a number of consequences. Therefore, the toxicity of one chemical may involve several mechanisms which can interact with and influence each other in an intricate manner.,85,谢谢,