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1、体外试验与生物新技术在毒理学中的应用,分类,依据体外试验在决策过程中所起的作用 筛选试验。它仅提供决策过程的最初的资料，还需要进行更权威的试验，无论是整体还是体外试验。 附加试验。它可为协作部门或法律部门的最终决策过程提供有用的资料，如机理的研究，但仅有它是不够充分的。 替代试验。它是在大量实验的基础上，使体外毒性试验能替代整体动物试验，以提供更多的信息。,基本原理,体外试验的基本原理是所观察到的毒理学效应均是毒物和或反应活性代谢产物在敏感性细胞上或敏感细胞内某一分子靶部位作用的结果。,体外毒性试验系统的优点,能控制环境因素 可排除相互作用的系统如免疫系统、神经内分泌系统的影响 每一剂量水平可
2、利用大量的生物样品，如细胞，细胞器等 试验间的误差较少 可同时和或反复多次取样 可做成复杂的互相作用的试验系统，如复合细胞培养等 较为快速和经济 需要较小量的受试化合物 产生较小量的有毒废物 可以利用人体细胞 减少整体动物的使用,体外试验系统,脏器灌流 肝脏灌流 肠灌流 膈肌-膈神经标本 脏器切片 原代细胞培养 肝细胞原代培养 巨噬细胞 淋巴细胞 脑细胞 心肌细胞 细胞培养 组织匀浆,亚细胞组分 细胞膜 微粒体 线粒体 酶,哺乳动物细胞制备和培养,体外系统分离的细胞包括悬浮液中的新鲜游离细胞、原代培养细胞、细胞株、细胞系及复合培养的细胞 在毒理学中以哺乳动物细胞作为实验动物的替代系统的原因 来
3、自公众要求减少实验中使用动物数量的压力 整体动物实验可显著地减少常规整体动物实验所需的高额费用 人们越来越不满意实验动物与人体结果之间相关性的缺乏。,体外系统细胞在毒理学中应用的优、缺点,优点 改善效率，减少费用 使用实验动物较少 仅需少量的受试物 较大程度控制细胞族的性状 直接控制胞外基质、化学物浓度及接触时间 排除可能的混淆因素如激素；神经系统或免疫系统的影响 可从同一实验体系重复取样 缺点 缺少整个器官的形态学观察 选择性丧失整体器官特异性功能，如毒性代谢酶的丧失 缺乏可能的调节影响因素如激素，神经系统或免疫系统， 一般为静态系统，将导致营养物质的逐渐减少和代谢终产物的逐渐累积。 多为短
4、期试验，对亚慢性或慢性毒性的评估价值不大,毒理学研究中常用细胞,各种物种的成纤维细胞 淋巴母细胞 腹水瘤细胞 淋巴细胞 角质细胞 肝 细 胞 肝癌细胞 肾脏髓质和皮质细胞,肺的各种类型细胞 培养的背根胶质细胞 培养的睾丸细胞 膀胱细胞 心脏细胞 脊髓微血管细胞 脂肪细胞,细胞实验方法,建立正在迅速生长的细胞株，用以观察受试物对整体细胞的一般毒作用和正在分裂组织的毒作用 利用已高度分化的细胞，无论是原代培养或是特定的细胞株，研究受试物对已分化成熟的细胞或其功能的特殊毒作用；,细胞培养的基本条件,无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器， 洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外 灯，电热
5、干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：纯水蒸馏器，纯水仪，培养板，培养瓶， CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪 ，微孔板震荡器，高 速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐 实验室安全：生物实验室安全，P1,P2,P3实验室安全,风淋室: 风淋室是生物洁净室的理想配套设备，它不仅可以清除人体和物品表面附着的尘埃，减少带入洁净室的灰尘量，而且兼有气闸室的功能，可防止非洁净空气的侵入。,传递窗: 该装置是一种洁净室的辅助设备，主要用于洁净区与洁净区，洁净区与非洁净区之间小件物品的传递，以减少洁净室的开门次数，把对洁净区的污染降低到最低程度。,超净工作台,超净工作台
6、的工作原理是利用鼓风机驱动空气，通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,培 养 板,培养瓶,酶标仪 微孔板震荡器,培养细胞生长的条件,1 细胞的营养需要 2 细胞的生存环境 温度: 37 ，O2 CO2: 5%，CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 渗透压 3 无污染 4 无毒,细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000
7、 ml,胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用,消化液：,培养基：,培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 天然培养基： 天然培养基有血清、血浆和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限。 成分复杂，影响对某些实验
8、产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染,合成培养基,主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 。 缺点： 缺少某些成分不能完全满足细胞生长需要。 如 TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。,无血清培养基尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清。 一般说来，含5小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死，但支持细胞生长一般需加 10血清,血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清有胎牛血洁、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，
9、无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟 血清的消毒：过滤除菌,抗菌素的使用： 在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位方便、广谱、稳定。,基础培养基 80一95 血清 5一20 碳酸氢钠 2.0 g/L 青、链霉素 各100单位毫升,完全培养基的组成,RPMI-1640培养粉 1袋 碳酸氢钠 2.0 g 青、链霉素 各100单位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 过滤除菌； 调节pH值至7.2； 加血清（终浓
10、度 10）。,培养基的配制,主要培养基,MEM：低限量Eagle培养基 DMEM：贴壁细胞 IMDM：密度低、生长困难细胞，杂交瘤细胞 RPMI1640：悬浮、肿瘤、原代、传代等细胞 199、109培养基：原代培养、难以培养的细胞,细胞培养基本技术,无菌操作技术,体外培养细胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是决定培养成功或失败的首要条件。,【培养前准备】 在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。,【操作与消毒】 无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭
11、拖洗地面次(专用拖布)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，物品不要重叠放置。移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。,【火焰消毒】 首先要点燃酒精灯。按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。,【操作】 进行培养时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动。,培养细胞的观察,肉眼观察培养物颜色及混浊度 倒置显微镜观察细胞生长状态,细胞计数,培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以
12、每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。 血细胞计数器：手工计数细胞,细胞计数： 1、将计数板及盖片擦拭干净，将盖片盖在计数板上。 2、吸少许细胞悬液，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。 3、静置3分钟。 4、镜下观察，计算计数板四大格细胞总数，压线细胞只计左侧和上方的。然后按下式计算： 细胞数/ml4大格细胞总数/ 410000 注意：若两个以上的细胞团，按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，需重新制备细胞悬液。,根据细胞生长的恃点，传代方法有3种： 1悬浮生长细胞传代 离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。 直接传代法：悬浮细胞沉
13、淀在瓶壁时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。,细胞传代方法,2半悬浮生长细胞传代（Hela细胞） 此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代。 3贴壁生长细胞传代 采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力 检测的细胞： 组织分离的细胞 复苏后的细胞,培养细胞活力测定,1台盼蓝法 活细胞不被染色，死细胞染成蓝色； 方法： 1、将细胞悬液以0.5ml加入试管中； 2、加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟； 3、镜检计细胞活力。 死细胞深兰色，活细胞呈无色
14、透明状。,2四唑盐（MTT）比色法 四唑盐（MTT）商品名为噻唑蓝； 原理：活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物，而死细胞没有这种功能。二甲亚砜（DMSO）能溶解蓝紫色，溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。酶标仪测定OD值。,细胞冻存和复苏,细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。 冻存和复苏的原则：慢冻快融 慢冻程序： 将冷冻管放入纱布袋内，通过线绳将纱布袋固定于液氮罐罐口，按每分钟温度下降12的速度，在40分钟内降至液氮表面，停30分钟后，直接投入液氮中。常用的低温保护剂是DMSO,细胞复苏方法,（1）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）
15、； （2）5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上； （3）低速离心10分钟； （4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,培养细胞的生物学特征,植物輸導水分的細胞,哺乳類的肌肉細胞,人類脊髓神經細胞,体外培养细胞的分型,（一）贴附型： 大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞，大致分成以下四型：,培养细胞的生长和增殖过程,（一）培养细胞生命期（Life Span of Culture Cells） 所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。,1原代培养期 即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。各细胞的遗传性
16、状互不相同，依存性强，独立生存性差。,2传代期： 初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。呈二倍体核型的细胞称二倍体细胞系。为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。一般情况下当传代1050次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。,3衰退期： 生存，但增殖慢或不增殖；最后衰退凋亡。 由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，主要发生在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。,（二）组织培养细胞一代生存期,所谓细胞“一代”一词，系仅指从细胞接种到分离再培养时的
17、一段时间，这已成为培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（Generation）或倍增Doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：,2指数增生期（Logarithmic growth Phase）： 这是细胞增值最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期细胞分裂相数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。一般以细胞分裂指数表示，即细胞群中每1000个细胞中的分裂相数。一般细胞的分裂指数介于0.1%0.5%，初代细胞分裂指数低，连续细胞和肿瘤细胞分裂指数可高达
18、3%5%。,在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（Contact Inhibition）。 细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（Density Inhibition），导致细胞分裂停止。,特点： 是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段 培养物中细胞数量呈指数增长,
19、细胞群体均一 是理想的实验用细胞。,判断细胞生长的指标： 指数生长期内细胞分裂活动的程度(增殖活性)可作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标 1.有丝分裂指数(MI): 指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。 一般细胞的MI约为0.10.5%；原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%5%。,判断细胞生长的指标： 2.细胞群体倍增时间: 培养物中细胞数量翻倍的平均时间 3.MTT法：反映细胞内一种酶活性程度 4.标记核苷酸(3H-TdR)掺入量：反映DNA,细胞生长一定阶段(指数生长期一般持续35 d）,即可 长满培养器皿，相互汇合
20、成片(铺满 confluence) 当细胞相互接触连接成片，出现接触抑制，接触抑制以后，虽然运动受抑制，但只要营养成分充足，仍可短期的分裂增殖，只有当细胞密度增大到一定程度，细胞便不再分裂增殖。为密度依赖性细胞生长抑制 当细胞分裂停止后，细胞数量即不再增加进入平台期,3停滞期（Stagnate Phase）： 细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（Plateau）。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损
21、，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。,概述 细胞铺满后再1-2倍增, 进入细胞达饱和密度, 可存活仍有代谢活动，但基本不分裂， 细胞数量维持在某一水平上，生长活动停滞,特点 (1)细胞数量： 细胞达饱和密度，出现密度抑制。 停止生长原因: 细胞数量多、生长地区占满、营养消耗、培养液中代谢废物积聚渐多，细胞停止生长。 即使经常更换培养液，细胞也会变性,从生长基质表面脱落、死亡唯有进行传代方可缓解。,(2)细胞活动小, 细胞膜的 活动小 (3)生长组分下降: 010% (4)及时传代：细胞已中毒，即使传代，也会影响下一代细胞的功能状况,?,体
22、内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。,体外培养细胞的种类,（一）初代培养 初代培养又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。,（二）细胞系 初代培养物开始第一次传代培养后的细胞，即称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（Finite Cell Line）；已获无
23、限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（Infinite Cell Line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。无限细胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性；有的不仅有永生性，异体接种也有致瘤性，说明已恶性化。,（三）细胞株 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（Substrain）,（四）二倍体细胞 细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同
24、（2n细胞占75或80以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。二倍体细胞在正常情况下具有限生命期，故属有限细胞系。但随供体年龄和组织细胞的不同，二倍体细胞的寿命长短各异。人胚肺成纤维细胞可传50代土10代，人胚肾只有810代，人胚神经胶质细胞1530代。由不同年龄供体取材建立的二倍体细胞系可供研究衰老之用。为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或25代即大量冻存作为原种（Stook Cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。,（五）遗传缺陷细胞 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工
25、方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。,（六）肿瘤细胞系或株 这是现有细胞系中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系多由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞系或细胞株的命名,HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌） CHO：中国地鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary） 宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立 NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3105细胞毫升。,基本技术,仪器与
26、设备 1. 培养箱 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4) ，冷柜(20) 3. 显微镜 ，相差显微镜或荧光显微镜，并附有照相装置或摄影装置。 4. 超净工作台 5.电热干燥箱消毒 器皿的清洗可用超声波洗涤器。 6. 培养器皿 ；多孔培养板，其规格有4孔、6孔、24孔及96孔，它体积小，适于少量细胞或单个细胞克隆的生长；培养皿，培养瓶，；其它：冻存细胞的塑料安瓿及微量加样器头，。 吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用规格有l0ml，5ml和lml；玻璃瓶， 离心管， 7. 液氮贮存器 8. 水纯化装置 但是，在细胞培养中，不宜使用去离子纯水，因其不能有效地去除有机物。 9. 滤过消毒装置,三、培养细胞的鉴
27、定,目的： 观察培养有无变化，以决定是否终止培养，并从冷冻贮存的样品重新建立新的培养细胞； 培养条件(如培养液)变化，对培养细胞的影响。 鉴定 污染鉴定 生存指标 细胞性质(如细胞形态、生长特性、染色体数目及结构等)。,污染鉴定,细胞培养中常见的污染有真菌、细菌和支原体等，此外有化学物和非同一种细胞的污染。 污染表现： 细胞培养可明显地改变生长特性， 引起pH变化和生长迟缓 培养液表面起泡或起膜， 培养液中的絮状物及细胞生长表面的斑点，摇动培养器皿可消失。,肉眼见不到的污染可影响细胞的代谢。,细胞特性鉴定,1. 形态学检查：评价细胞正常与否的最简单方法是形态学检查 。 “成纤维样” “上皮样
28、2.生长特性的检查 主要通过测定更换培养液的时间和传代的时间来完成 接种效率= 小于30表示生长不正常 3.其它检查 除上述指标外，在细胞培养时，可进行染色体分析，包括染色体的数目和结构以及DNA、RNA和蛋白质的含量测定，来判断培养细胞的特性。,细胞培养在食品毒理学中应用,一般毒性：主要为急性细胞毒性 器官特异性毒性：利用有代表性细胞类型如肝细胞、肾近曲小管细胞、神经细胞及心肌细胞等： 毒作用机理 生物转化、毒性代谢产物的形成 遗传毒性，如程序外DNA合成测定 繁殖毒性 联合毒性 不同物种间的比较毒性 光敏毒性,毒性指标的选择,依据不同的试验目的和试验条件，可选择不同的观察指标。下列指标在毒
29、理学中经常采用： (1) IC50：即经3天培养后，引起生长速率减至对照组一半时所需受试物的浓度生长速率可用蛋白总浓度来表示，可用于细胞毒性的常规筛检。此外，前述评价细胞特性的指标，如形态学和接种效率等，均可采用。 (2) 细胞膜损伤：可选择台盼蓝摄取、胞浆酶漏出、Ca2+的释放以及钙泵的变化等指标来评价细胞膜的损伤。 (3) 大分子物质合成与降解的改变：可选用14C亮氨酸蛋白试验和3H尿嘧啶参入RNA试验等指标，以判断受试物对培养细胞的大分子合成与降解的有无作用。 (4) 代谢能力：除可选择ATP浓度、NADPNADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指标外，还有毒物代谢酶的活性、细胞膜脂质过氧
30、化作用及14C-葡萄糖氧化代谢成14CO2的速率，均可反映出细胞的代谢能力。 (5) 形态学观察：通过光学显微镜和电子显微镜观察，可了解受试物对培养细胞的形态改变情况。,毒理学中应用细胞培养技术时应注意的几个问题,1. 细胞类型的选择 细胞类型的选择取决于实验的目的。 一般性筛选系列化合物的一般毒性时，应选择生长迅速且易于处理的细胞系。 机理研究多不用细胞系，因为培养的细胞会逐渐丧失许多功能，如细胞色素P-450的活性。 细胞培养的优点之一是可选择来源于人体的组织细胞，可减少试验结果的物种差异。成纤维样细胞和上皮样细胞均可选用。 常用的细胞系有CHO、V79、Hela、BHR及L929等。,2
31、. 代谢活化,细胞经8-24h培养后，细胞色素P-450活性将迅速下降。 而在CHO细胞系中，涉及代谢活化的酶活性下降。所以，培养细胞对需代谢活化的化学物不能够敏感。 解决方法， 一是加S9。 S9需要NADPH才具有代谢活化作用，故在培养液中应加有NADPH生成系统(葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡萄糖-6-磷酸和NADP)。 与原代肝细胞复合培养。与原代肝细胞进行复合培养时也可采用其它不同的细胞系，如V79、中国地鼠肺成纤维细胞和人成纤维细胞。,3. 受试物的给予,许多受试物由于水溶性较低，在加入培养液前，常需溶于有机溶剂，有机溶剂对细胞有损害作用，故应限制有机溶剂浓度在1以下。 在试验中可设立
32、适当的有机溶剂对照和培养液对照。,4.设立阳性对照组,实验系统的重现性应该用阳性对照物来检查。阳性对照物指采用经过研究或公认有特定作用的化学物。,亚细胞组分制备及其检测方法,微粒体的制备 肝微粒体制备 肝外组织微粒体的制备 线粒体的制备 亚线粒体颗粒的制备,设备,设备 匀浆器 离心机： 低温高速离心机，最大转速为18 00024000rpm， 超速离心机，最大转速为5000075000rpm。 匀浆介质和缓冲液 最常用的匀浆介质为等渗的蔗糖(0.25molL)和氯化钾(0.154molL) 生物样品 实验动物如大鼠、小鼠、金黄地鼠应迅速处死，常用的方法是断头处死。 应避免使用麻醉剂，如乙醚、巴
33、比妥类药物，它们将影响毒物代谢酶的活力。,肝微粒体制备,肝匀桨,离心，10000g 20 min,上清液 沉淀,离心，10500g 1h,沉淀 （微粒体） 上清液弃去,线粒体的制备,肝匀桨,离心，460g 10 min,上清液 沉淀(包括细胞核，红细胞,离心，12500g 10 min 及大的细胞碎片),沉淀 （含有线粒体） 上清液 弃去,整个制备过程应在1h内完成,细胞碎片和红细胞,大量完整的线粒体和一些溶酶体,一些破的线粒体和微粒体,细胞程序性死亡及其检测方法,细胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)是一种与遗传机制有关的、主动的自发性死亡方式，并在形态和生化上
34、出现一系列特征表现。具有这些特征表现的细胞称为细胞凋亡(apoptosis)。 细胞凋亡：而细胞凋亡的特征表现是胞内水分丢失，胞浆浓缩，胞膜结构完好，细胞核浓缩聚集于核膜边缘，形成新月形。到晚期，细胞核碎裂成小片，胞浆分割，形成由细胞膜所包绕的含有核碎片的小体，称为凋亡小体(apoptotic body)。 细胞坏死(necrosis) ：坏死是指体内、外致损伤因素作用达到一定强度、持续一定时间后，所导致的细胞死亡，它表现为细胞及细胞器肿胀、碎裂和溶解等。,细胞程序性死亡的检测方法,1. 形态学观察法 主要依靠光学显微镜或电子显微镜观察细胞凋亡的形态学特点。 观察材料可以是石蜡切片、冰冻切片或
35、细胞涂片。 形态学观察可用HE染色或荧光染料PI、DAPI等染色。,normal,扫描电镜,透射电镜观察,电泳检测法,原理是在细胞发生凋亡时，由于内源性核苷酸酶的激活，DNA被有规律地切割成约180bp或其倍体的双链DNA片段，在凝胶电泳上可形成梯带，即具有凋亡的特征DNA梯带(DNAladder)。,，,单细胞凝胶电泳,将细胞包埋于低熔点琼脂糖内，置于碱性裂解液中，使细胞裂解后，琼脂糖凝胶电泳，经EB染色，观察细胞DNA的断裂情况。,末端转移标记法,末端转移标记技术是利用在发生凋亡时，DNA链被激活的内源性核酸内切酶切割成许多180bp左右的双链DNA片段。 这些片断均含有3-OH末端，在末
36、端转换酶或DNA多聚酶，(TdT酶)作用下，加入已标记的核苷酸或核苷酸混合物，再经过酶显色或用荧光抗体使之显示出来。,细胞分析仪检测法,常用的细胞分析仪有两类， 流式细胞分析仪，可对单个细胞悬液中的单个细胞进行检测。 借助细胞标记技术和计算机分析技术，可快速检出发生凋亡的细胞。其原理是在正常增殖状态的细胞，处于不同周期时相，即G0Gl，S1，G2M期，其DNA含量分布在2n4n之间；。 细胞形态分析仪，可对载玻片上单个细胞进行检测。,二、细胞凋亡相关基因,现已报道，有25个癌基因与细胞凋亡有关。 细胞凋亡相关基因大致可分为两大类，即凋亡促进（apoptosis on）基因和凋亡抑制（apopt
37、osis off ）基因。它们分别起着促进凋亡和抑制凋亡的作用，彼此之间还存在一定的相互关联。 1凋亡抑制基因 凋亡抑制基因包括bcl-2、ced-9、bcl-X，其中最主要也是当前研究最多的是bcl-2，bcl-2是癌基因的一种，在人体多种形态的肿瘤中过度表达，可抑制由多种剌激包括化疗和放疗引起的细胞凋亡。bcl-2常在淋巴细胞系统和神经系统中表达，抑制该部位的细胞凋亡。淋巴性白血病细胞中bcl-2也是过度表达的。,2凋亡促进基因 凋亡促进基因有ced-3,4、p53、ICE、Bax、bcl-Xs、TGF等。其中ced-3，4是在线虫索中发现的，而p53、ICE等存在于哺乳动物中。 p53为
38、肿瘤的抑制基因，分为两型，一型是使细胞周期停止在GI期，抑制细胞繁殖的野生型；另一型是具有突变能力的变异型。野生型p53可诱导易感细胞发生凋亡。 白介素1转换酶（interlukin 1-converting enzyme, ICE）,与线虫细胞凋亡相关基因ced-3有较高的同源性，具有直接诱导细胞凋亡的作用。 c-myc是典型的原癌基因，在许多肿瘤中它有多种失活形式。c-myc的表达驱动细胞凋亡，这与细胞所处的条件有关,凋亡基因之间的相互作用,bcl-2能妨碍依赖p53的凋亡，但不影响依赖p53的生长停滞，可是将bcl-2与c-myc共表达时，这两者都被阻断。一个主要显性癌基因c-myc与一
39、个抗凋亡基因bcl-2的协同作用会导致肿瘤向恶性表型进展，并对肿瘤治疗的抗性增加，而p53和bcl-2间的相互拮抗作用则有利于抗肿瘤治疗。,凋亡细胞特有的生化改变,(1)Ca2+活化胞浆蛋白酶，称为ICE已发现至少10种，参与凋亡的级联反应，例如caspase-3，称为CPP32/YAMA/apopain，可降解DNA修复有关的酶PARPpoly(ADP-ribose)聚合酶。 (2)细胞内Ca2+增高，活化核酸内切酶，切割染色体以核小体DNA(约200 bp)为单位的DNA片段，此切割是非随机的，它与坏死时DNA随机降解有明显的不同。 (3)与胞浆蛋白质交联有关的转谷氨酰胺酶活性的增加。 (
40、4)细胞膜内层的磷脂酰丝氨酸外翻至膜外，从而有利于巨噬细胞的识别和吞噬。,定量检测细胞凋亡的方法,1.DNA片段化的定量。包括分离胞浆片段化DNA的定量和以流式细胞仪(FACS)分析细胞的亚二倍体峰。 2.抗组蛋白抗体经Elisa测定胞浆核小体。 3.PARP的Western印迹法测定凋亡的早期事件。113 000的PARP降解为89 000及24 000的片段，这是凋亡蛋白酶caspase-3/CPP 32的作用所致。 4.膜联蛋白-5(annexin-5)荧光法。以FACS直接分析凋亡与坏死，这是因膜内的磷脂酰丝氨酸在凋亡时转至膜外而被标记。 5.原位细胞死亡测定(TdT-mediated
41、 dUTP-Xnick end labeling, TUNEL)。这是基于核酸内切酶将DNA链切出缺口的原理。,（二）细胞周期,细胞周期（细胞分裂周期），是指一个细胞经生长、分裂而增殖成两个所经历的全过程， G0=静止期 G1=可变的DNA合成前期， (12h几天) S=DNA合成期(24h) G2=DNA合成后期， (24h) M=分裂期(12h),细胞周期特异性药物是指那些仅对恶性肿瘤细胞增殖周期中某一期细胞有杀灭作用的药物。例如：羟基脲、阿糖胞苷、巯嘌呤、甲氨喋呤等，能干扰DNA的合成，对恶性肿瘤细胞的S(DNA合成)期有特异性杀伤作用；长春新碱和长春花碱，则可特异地杀伤处于M(有丝分裂
42、)期的细胞。,细胞周期非特异性药物是指对处于细胞增殖周期中的各期(G1、S、G2、M)或是休止期的细胞(G0)均具有杀灭作用的药物。它们大多能与细胞中的DNA结合，阻断其复制。从而表现其杀伤细胞的作用。抗肿瘤药物中的烷化剂及阿霉素、博莱霉素等抗癌抗生素即属于此类药物。,（三）端粒与肿瘤,端粒酶在正常体细胞中无活性或检测不出其活性，而在大多数肿瘤细胞中活性高，且其功能是添加端粒重复序列至DNA末端阻止端粒随细胞分裂而缩短，起着稳定DNA的作用。因此，许多学者推测端粒酶可能是肿瘤治疗的最佳靶点之一。 FENGJL等（1995），用端粒酶RNA组份的反义核苷酸转导入HeLa细胞中后，细胞端粒酶活性丧失，端粒也随着细胞分裂而逐渐变短，经2026个倍增时间，细胞发生衰老死亡。,1.端粒酶的生化特性,端粒酶：蛋白起催化端粒合成的作用， RNA作为端粒合成的内模板 端粒酶的功能即为添加端粒重复序列5TTAGGG3至DNA末端，阻止端粒随细胞分裂而逐渐缩短，从而稳定染色体的末端，在保持细胞“永生”性起着重要的作用。,2端粒酶抑制剂,2.1直接抑制剂：逆转录酶抑制剂 2.2间接抑制剂 2.2.1细胞分化抑制端粒酶活性 2.2.2蛋白激酶C抑制剂,