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1、高效液相色谱方法及应用,主讲人：王英特,第一章 绪论,色谱分析法是分析化学中获得广泛应用的一个重要分支，是一个具有强大生命力的分离分析技术。,第一节 高效液相色谱法的特点,一、与经典液相色谱法比较 二、与气相色谱法比较 三、高效液相色谱法的特点 1分离效能高 2 选择性高 3 检测灵敏度高 4 分析速度快,第二节 高效液相色谱法的分类,按溶质在两相分离过程中的物理化学原理分类 1、吸附色谱（Adsorption Chromatography） 2、分配色谱（Partition Chromatography） 3、离子色谱（Ion Chromatography） 4、体积排阻色谱（Size Ex
2、clusion Chromatography） 5、亲和色谱（Affinity Chromatography）,按分离过程物理化学原理分类的各种液相色谱法的比较,第三节 基本原理,一、色谱过程 二、分配系数与保留行为的关系 1分配系数及容量因子 2保留时间 3tR与K的关系 4分配系数不等是分离前提,第二章 高效液相色谱仪简介,1.贮液瓶 2.高压输液泵 3.进样器 4.色谱柱 5.检测器 6.记录装置,第一节 流动相及贮液罐 一、贮液罐 二、流动相脱气 （1）吹氦脱气法 （2）加热回流法 （3）抽真空脱气法 （4）超声波脱气法 （5）在线真空脱气法,第二节 高压输液泵及梯度洗脱装置,一、高压
3、输液泵 高压输液泵可以分为以下两类： 1恒流泵：可输出恒定体积流量的流动相。 （1）注射式泵（又称注射式螺杆泵） （2）往复型泵 2恒压泵：恒压泵又称气动放大泵，是输出恒定压力的泵。,二、输液系统的辅助设备 1管道过滤器 2脉动阻尼器 三、梯度洗脱装置 1低压梯度（外梯度） 2高压梯度（内梯度） 3影响梯度洗脱的因素,第三节 进样装置,一、停流进样装置 二、六通阀进样装置 三、自动进样器,第四节 色谱柱,一、柱材料及规格 1柱材料 2柱规格 二、柱连接方式 三、柱温控制 四、柱填充技术,第五节 检测器,常用的检测器为紫外吸收检测器（UVD）、折光指数检测器（RID）、电导检测器（ECD）和荧光
4、检测器（FD）。 近几年出现的蒸发激光散射检测器（ELSD）有望成为高效液相色谱全新的通用灵敏的质量检测器。,一、检测器的性能指标 （1）噪声 （2）基线漂移 （3）灵敏度 （4）线性范围 （5）检测器的池体积,二、紫外吸收检测器 1固定波长紫外吸收检测器 2可变波长紫外吸收检测器 3光二极管阵列检测器 三、折光指数检测器 四、电导检测器 五、荧光检测器,第三章 键合相色谱法,根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，可将键合相色谱法分为正相键合相色谱法和反相键合相色谱法。在正相键合相色谱法中，键合固定相的极性大于流动相的极性；在反相键合相色谱法中，键合固定相的极性小于流动相的极性，其应用范围比正
5、相键合相色谱法更广泛。,第一节 分离原理,一、正相键合相色谱法的分离原理 二、反相键合相色谱法的分离原理 以下简述三种影响溶质保留值的因素： 1溶质分子结构对保留值的影响 2烷基键合固定相特性对保留值的影响 3流动相性质对保留值的影响,第二节 固定相,使用键合固定相应注意的问题： 1硅胶键合相的稳定性 2键合相色谱分离的重现性 3键合相色谱分离的选择性 4键合相色谱柱的再生,第三节 流动相,一、在键合相色谱中选择流动相的一般原则 二、改善色谱分离选择性的方法 1调节流动相的极性 2向流动相中加入改性剂 （1）离子抑制法 （2）离子强度调节法 三、溶质保留值随溶剂极性变化的一般保留规律,第四节
6、离子对色谱法,一、分离原理 二、固定相、流动相和对离子 三、影响离子对色谱分离选择性的因素 1溶剂极性的影响 2离子强度的影响 3pH值的影响 4温度的影响 5离子试剂的性质和浓度的影响,第四章 建立高效液相色谱分析方法的一般步骤,通常在确定被分析的样品以后，要建立一种高效液相色谱分析方法必须解决以下问题： 根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。 选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。 选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。 由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。,第一节 样品的性质及柱 分离模式的选择,一、样品的溶解度 二、样品的分子结构和分析特性 1同系物的分离 2、同分异构体的分离 3、对映异构体的分离,第二节 分离操作条件的选择,一、容量因子和死时间的测量 二、样品组分保留值和容量因子的选择,下列优良常规操作能够最大限度降低维修费用： 使用HPLC级试剂和流动相 清洁的仪器、流动相和样品，如果必要，进行过滤 保证溶剂的相溶性 如果必要，冲洗整个系统，去掉盐，防止污染 对仪器的使用、维护和保养进行记录,谢谢！,