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1、重庆科技学院毕业设计（论文）题 目 黄酮类化合物的研究进展 院 （系） 化学化工学院 专业班级 生物制药技术07-01 学生姓名 学号 指导教师 职称 副教授 评阅教师_ _ 职称_ 2010年 6 月 8日重庆科技学院专科生毕业设计（论文）黄酮类化合物的研究进展院（系） 化学化工学院 专业班级 生物制药技术07-01 学生姓名 指导教师 2010年 6 月 8 日重庆科技学院专科生毕业论文 中文摘要摘 要黄酮类化合物广泛存在于自然界中，数量之多列天然酚性化合物之首，属于植物在长期自然选择过程中产生的一些次级代谢产物。主要存在于双子叶及裸子植物的叶、果、根、皮中；在植物中主要与糖结合成苷的形式
2、存在。黄酮类化合物可以分为：黄酮、黄酮醇、异黄酮、双氢黄酮、双氢黄酮醇、噢弄、黄烷酮、花色素、查耳酮、色原酮等10多个类别。黄酮类化合物已达5000多种。黄酮类化合物具有抗氧化、抗衰老、增强机体免疫力、抗癌、调解内分泌系统、调节心血管、抗炎、抗过敏、抑菌、抗病毒等多方面生物活性。在医药、食品等领域应用广泛。对该类化合物的研究已成为国内外医药界研究的热门课题，黄酮类化合物是一类具有广泛开发前景的天然药物。本文综述了近年来黄酮类化合物的提取、纯化、含量测定、生物活性以及在医药、食品方面的应用，并对未来的研究进行了展望。关键词：黄酮类化合物 提取 纯化 含量测定 生物活性 重庆科技学院专科生毕业论文
3、 英文摘要AbstractFlavonoids exist extensively in nature, as much as the number of natural phenolic compounds listed first, are plants in the long process of natural selection produced a number of secondary metabolites. Mainly in dicotyledonous and gymnosperm leaves, fruit, roots, bark; in plants mainly
4、as glycosides with the sugar-binding form. Flavonoids can be divided into: flavonoids, flavanols, isoflavones, flavanone, flavonol dihydrotestosterone, oh get, flavanone, anthocyanin, chalcone, chromone, more than 10 categories. Has reached more than 5000 kinds of flavonoids. Flavonoids have antioxi
5、dant, anti-aging, enhancing immunity, cancer, mediating endocrine system, cardiovascular conditioning, anti-inflammatory, anti-allergic, antibacterial, antiviral and other aspects of biological activity. In medicine, food and other fields is widely used. Compounds of the domestic pharmaceutical indu
6、stry has become a hot research topic, Flavonoids are a class of broad development prospect of natural medicine. This paper reviews recent flavonoids extraction, purification, determination, biological activity, as well as in medicine, food-related applications, and future research were discussed. Ke
7、y words: Flavonoids; determination; extraction; purification; biological activity.重庆科技学院专科生毕业论文 目录目 录中文摘要.英文摘要.1.绪论.12.黄酮类化合物的结构、理化性质与分布.22.1黄酮类化合物的结构.22.2黄酮类化合物的理化性质.42.3黄酮类化合物的分布.53.黄酮类化合物的分离提取工艺.63.1热水提取法.63.2有机溶剂提取法.73.3碱性稀醇提取法.73.4微波提取法.73.5超临界流体萃取法.73.6超声波提取法.83.7酶解法.93.8半仿生提取技术.94.黄酮类化合物的分离纯化
8、.104.1pH梯度萃取.104.2高速逆流色谱分离法.104.3柱色谱法.104.4大孔吸附树脂114.5高效液相色谱法.125.黄酮类化合物的测定分析方法.135.1平面色谱法135.2分光光度法.135.3 高效液相色谱法.145.4极谱.145.5气相色谱法145.6液相色谱与质谱联用法.155.7毛细管电泳法.156.黄酮类化合物的生物活性.166.1清除氧自由基、抗肿瘤作用.166.2调节心血管系统作用166.3抗氧化、抗衰老作用176.4抑菌、抗病毒作用.186.5免疫调节作用186.6抗炎、镇、痛抗过敏作用.186.7对内分泌系统的作用.187.黄酮类化合物的应用.207.1在
9、药学方面的应用.207.2 在食品方面的应用.218总结.22参考文献.23致谢.26重庆科技学院专科生毕业论文 1 绪论1 绪 论我国是世界上植物资源最丰富的国家之一，约有三万余种高等植物，据普查其中已发现药用植物一万一千多种，这些药用植物资源是开发新药的不竭源泉。据专家统计，做过药理研究的只有一千余种，较为深入研究的不过二百种，可见天然药物的研究开发和利用具有巨大的潜力。对植物药的研究与开发，我国主要是寻找单一活性化合物或以其为先导化合物开发新药。当今世界植物药的研究开发和使用，主要有药品、保健品、饮食补充剂和化妆品等形式，大体有植物药标准化提取物和单一成分及以其为先导化合物的合成、半合成
10、的衍生物。其发展趋势表现为一些大的制药公司和研究机构纷纷成立天然药物研究部门。认识到天然药物有着千变万化和包罗万象的新结构类型的化合物，是筛选活性化合物和寻找先导化合物的重要源泉。利用现代的分离手段和结构测定的先进技术以及现代活性筛选体系，发现新的活性化合物和先导化合物，是创制新药的重要途径。据资料统计，目前已知生理活性黄酮类化合物有5000多种，各方面的研究也越来越广泛与深入，提取和分离出具有较高生物活性的黄酮类化合物对医药、食品工业的贡献是巨大的，是当前植物药研究开发的热点之一。1重庆科技学院专科生毕业论文 2 结构2 黄酮类化合物的结构、理化性质与分布2.1 结构黄酮是一类植物化学物质的
11、简称，全称为黄酮类化合物(Flavonoids)，又称物黄酮(Bioflavonoids)或植物黄酮。黄酮类化合物泛指拥有15个碳原子的多元酚化合物，其中两个芳环(A环、B环)之间以一个三碳链相连，其骨架可用C6-C3-C6表示1。基本结构如图2.1。 A B图2.1黄酮（A）和异黄酮（B）的分子结构根据中央三碳链的氧化程度、B环连接的位置（2-位或3-位）以及三碳链是否构成环等特点，可将主要的天然黄酮类化合物分类2。如图2.2。2重庆科技学院专科生毕业论文 2 基本类型图2.2黄酮类化合物的基本类型及结构3重庆科技学院专科生毕业论文 2 理化性质 2.2 黄酮类化合物的理化性质2.2.1外观
12、大多数为结晶状固体，具有一定的结晶形状，少数为非晶形粉末。大多呈黄色，所构成的颜色与分子中是否存在交叉共扼体系及助色团的数目多少和取代的位置有关。2.2.2溶解性游离的黄酮类化合物一般难溶或不溶于水，可溶于甲醇、乙醇、乙酸乙脂、乙醚等有机溶剂及稀碱中。其中黄酮、黄酮醇、查耳酮等，因它们的分子中存在交叉共扼体系，所以是一些平面型化合物，平面型分子堆砌得比较紧密，分子间引力较大，故很难溶于水。在游离的黄酮类化合物母核上引人的取代基的种类和数目不同，对溶解度影响也不同。例如，引人羟基后，水溶性增加，脂溶性降低。羟基引人越多，水溶性越增加。黄酮类化合物多是多羟基化合物，一般不溶于石油醚当中，故可与脂溶
13、性杂质分开。引人甲氧基或异戊烯基后，脂溶性增加，水溶性降低，取代基位置不同，对溶解度亦有影响。黄酮类化合物的羟基被糖化后，水溶性增加，脂溶性降低，一般易溶于热水、甲醇、乙醇、乙酸乙脂及稀碱溶液中而难溶或不溶于苯、乙醇、氯仿、石油醚等有机溶剂中3。2.2.3酸碱性酸性黄酮类化合物分子中有多个酚羟基，显酸性，可溶于碱水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。由于酚羟基数目及位置不同，酸性强弱也不同。以黄酮为例酸性由强到弱：7，4-二OH7或4-OH一般酚羟基5-OH。溶于：NaHCO3、Na2CO3、0.2%NaOH、4%NaOH。可利用此性质进行提取、分离工作3。碱性黄酮类化合物1位氧原子，有未共用
14、的电子对，表现为微弱的碱性，可与强酸成盐，该盐不稳定，加水分解。图2.3黄酮水解26重庆科技学院专科生毕业论文 2 分布2.3 分布黄酮类化合物是一类低分子的天然植物成分，广泛存在于自然界。黄酮在苔藓植物和蕨类植物及裸子植物中有分布，广泛分布于被子植物和维管植物中，尤以芹菜素和木犀草素黄酮最常见；黄酮醇主要分布于双子叶植物特别是木本草植物的花和叶中，常见的是山奈酚、槲皮素、杨梅素；查耳酮分布广泛，在蕨科、苔藓和种子植物中发现，在菊科、豆科中分布较多；花色素在被子植物中分布较广，尤其以花青素最为常见；黄烷酮分布较广泛，在双子叶植物中特别是含大量蹂质的木本植物中较为常见，自然界尚未发现游离的存在；
15、双氢黄酮，较普遍地分布，尤其在被子植物的蔷薇科，豆科、菊科、姜科中较多分布；双氢黄酮醇，普遍地存在于双子叶植物中，特别是豆科植物相对较多，也存在于裸子植物，单子叶植物姜科的少数植物中；双黄酮、二聚黄酮主要分布于裸子植物中，亦在苔藓植物及被子植物中不断发现；异黄酮主要分布在被子植物中，尤以豆科蝶形花、蔷藏科植物居多；新黄酮，主要分布在豆科蝶形花亚科2。重庆科技学院专科生毕业论文 3 提取工艺3 黄酮类化合物的提取工艺目前，黄酮类化合物的传统提取方法主要有热水提取法、醇提法、碱性水或碱性稀醇提取法和其他有机溶剂萃取法等。各种提取方法都各有利弊，并且在我国仍然广泛使用。在传统提取方法的基础上，有许多
16、研究者也做了黄酮类化合物提取的最佳工艺研究，发现黄酮提取量与提取温度、时间、溶剂、物料比、材料颗粒度、溶剂扩散速度等有重大关系。随着现代科学技术与仪器的发展，新型提取技术也应运而生，如微波提取法、超声波提取法、超临界流体萃取法、酶法提取和半仿生提取法等，并在研究与生产中广泛使用。3.1 热水提取法热水提取法仅能提取黄酮苷类，此法成本低、安全、适合于工业大生产。李冬菊4等从山桔叶中用热水提取了总黄酮，采用的是全物理过程，无任何化学变化及污染，是一条理想的提取山桔总黄酮的途径。在银杏叶中提取黄酮类化合物，先取晾干的银杏叶，加水浸泡24h、大火煮沸30min，文火焖蒸30min，待稍冷倾出上层黄绿液
17、，蒸发、萃取、过滤即得5。但用水作溶剂浸提黄酮类化合物，在提取过程中主要考虑加水量、浸泡时间、煎煮时间及煎煮次数等因素，此工艺设备简单、安全，但有提取杂质多，收率较低，提取液过滤、浓缩等操作困难且又费时等缺点6。3.2 有机溶剂提取法这是国内外使用最广泛的方法，很容易实现工业化生产。常用的有机溶剂有甲醇、乙醇、乙酸乙酯、乙醚等。本法主要用于提取脂溶性基团占优势的黄酮类物质，对设备要求简单，产品得率高，但成本较高，杂质含量也高。常见的有冷浸法、渗滤法和回流法。这些方法各有优缺点。冷浸法虽不需加热，但提取时间长、效率低；渗滤法提取效率高、浸液杂质少，但费时长，溶剂用量大，操作麻烦；回流法效率最高；
18、但受热易破坏成分的药材不宜用此法。葛根总黄酮的提取采用冷浸法7，陈皮苷的提取用乙醇渗滤法8，银杏叶总黄酮提取9为回流提取。常楚瑞10用乙酸乙酯回流提取了木瓜总黄酮。在提取过程中，乙醇的浓度对总黄酮的提取有较大影响，一般认为乙醇的浓度增高有利于总黄酮的提取，但并不绝对，还跟黄酮类物质的结构有关，高浓度乙醇适于提取黄酮甙元类，低浓度乙醇适于提取黄酮甙类。3.3 碱性稀醇提取法利用黄酮类多含酚羟基的性质，溶于碱性水(石灰水、氢氧化钠)或碱性稀醇而浸出，酸化后析出黄酮类化合物。氢氧化钠水溶液的浸出能力高，但杂质较多不利于纯化；石灰水可以使一些鞣质或水溶性杂质沉淀生成钙盐，有利于纯化，但是浸出效果不如氢
19、氧化钠好，同时有些黄酮类化合物能与钙结合成不溶性物质，不被溶出，一般可根据不同的原料使用不同的碱性溶液。丁利君从菊花中提取黄酮类物质时，用pH=10的氢氧化钠溶液浸出效果较好11；曹永刚等而从槐米中提取芦丁，则应用碱性较强的饱和石灰水作溶剂，这样则有利于芦丁成盐溶解12。3.4 微波提取法目前，微波技术在人们的生产生活中应用越来越广泛。微波提取法是一种外加物理场微波加热，透入内部的能量被物料吸收置换成热能对物料的加热，形成独特的物料受热方式的方法。此法在黄酮类物质的提取上也取得了良好的效果，它在提取过程中具有操作时间短、溶剂消耗量少、有效成分得率高、不产生噪音，适用于热不稳定物质、受热均匀、反
20、应高效性和强选择性等特点。而且操作简便，副产物少，提取率高及产物纯度高等优点。本法多用在药材的浸出，在黄酮类化合物的提取上取得了良好的效果。段蕊13等人对微波法提取银杏叶中黄酮类物质进行研究，用175W微波强度处理5min后，以体积分数80%的乙醇，在70提取1h得到提取物的黄酮类物质质量浓度比未经微波处理的高出18.8%。此外李嵘与金美芳14在以水为介质的条件下，对银杏叶进行微波处理，提取效果与传统方法对照，表明此方法提取率高，省溶剂，大大提高了提取效率。实验方法是称取100g银杏叶丝，加160ml蒸馏水，微波解冻处理5min及15min，提取液以440mL60%乙醇，55回流提取。结果表明
21、，微波处理后进行乙醇水浸提比同样方法未用微波处理可以提高银杏叶中有效成分的提取率达22.6%，而且大大缩短了提取所需时间。与传统水浴法的对比试验表明：微波法不仅节省时间，而且提取效率高，是一种快速、高效、节能的新型提取工艺。3.5 超临界流体萃取法超临界流体是处于临界温度和临界压力下的物质状态，在其临界点附近的范围内，由于非常大的流体密度变化，流体兼有了气、液体双重特性，以临界流体状态形式存在，气体冷凝及液体蒸发在临界状态下不发生，流体的扩散系数与气体状态接近，具有较快的传质速率；流体的密度与液体状态接近，单位流体的溶解能力较大，超临界流体的特性使其成为理想的萃取溶剂。溶质在SCF中的溶解度，
22、随压力和温度的变化而明显变化，最敏感区域为临界点附近区域，在此区域内，温度和压力的微小变化导致流体密度极大的改变，溶质的溶解度也有较大的改变，由此可达到选择性分离的目的。选择超临界流体萃取剂，优先选择的是萃取能力强、容易达到临界条件的SCF萃取剂，并应考虑其毒性、腐蚀性及是否易燃易爆物等因素，最常用的超临界流体为CO2。应用CO2-SPE，技术提取分离黄酮类物质，具有萃取速度快，效率高，操作简单等特点，产品中没有残留有机溶剂，与传统的萃取分离工艺相比优势是明显的。孙婷15利用超临界CO2萃取法从银杏叶中提取黄酮类化合物，确定了超临界流体萃取的最佳条件：压力为20MPa，萃取罐的温度为40，流量
23、为14mL/min，萃取时间为2h，在此条件下测得总黄酮的含量为29.1%，相对标准偏差为3.1%。游海等人16在提取银杏叶中的黄酮类化合物药用活性成分的实验中，确定了实验最佳条件：萃取压力12665.6kPa，萃取温度为45，萃取时间为30min-45min，分离压力为6586.1kPa，其中黄酮含量达28%以上。3.6 超声波提取法超声波提取法是另一种外加物理场的方法，是指以超声波辐射压强产生的空化效应和热效应引起机械搅拌、加速扩散溶解的一种新型提取方法。超声波具有特殊的生物效应，选择适当的超声参数可以使植物细胞的细胞壁间形成较多的小孔，从而可以增强细胞膜的透性和选择性，是近年来应用到中草
24、药有效成分提取分离中的一种提取手段。该方法是目前比较先进的方法，它能大大缩短提取时间，一般不超过1h，提高有效成分的提出率、原料的利用率。阳文斌等17用超声波法提取了花生壳总黄酮，测得样品中总黄酮的含量C=0.5937mg/ml，回收率10.11，其纯度和产率均较高。杨喜花18等还研究了超声循环方法提取沙棘叶的总黄酮，超声循环技术是在料液循环流动的过程中施加超声波，这种改进方法的提取效果远高于普通超声法。潘慧娟等19用超声波法提取苦丁茶中总黄酮，考察了时间对提取效果的影响，认为此法操作简单、提取时间短、效果好。黄锁义20用超声波法提取洋葱中总黄酮，认为超声波提取、纯化方法而得到的黄酮类物质其纯
25、度较高。刘峥21等采用超声波法从银杏中提取总黄酮，用均匀设计法确定了超声波提取的最佳工艺条件。3.7 酶解法最近几年，利用酶的特性发展了新的提取方法。酶解法利用酶反应的高度专一性，破坏细胞壁，使其中的黄酮类化合物释放出来，适用于被细胞壁包围的黄酮类物质。植物细胞壁的主要成分是纤维素，恰当地利用纤维素酶处理，可使细胞壁发生不同程度的改变，如软化、膨胀和崩溃等，从而可改变细胞壁的通透性，提高黄酮类化合物的提取率。黄剑波等22采用甜茶作材料，采用纤维素酶辅助的方法，从中提取黄酮类化合物。首先，确定纤维素酶的最佳作用效果，然后通过单因素实验，得出酶法辅助的最佳提取工艺为：水做溶剂，先用40下茶粉质量3
26、的纤维素酶作用15min，再在80下浸提1h，固液比为1:30，试验结果表明：黄酮类物质的提取率为91，提取纯度为54。3.8 半仿生提取技术半仿生提取法是将整体药物研究法与分子药物研究法相结合，模拟口服给药后药物经胃肠道转运的环境，为经消化道给药的中药制剂设计的一种新的提取工艺。这种提取方法的特点是可以提取和保留更多的有效成分，能缩短生产周期、降低成本。陈晓娟等23通过正交试验优选半仿生法提取杜仲叶中绿原酸和黄酮的工艺条件为：杜仲叶为原料，以磷酸氢二钠一柠檬酸的缓冲溶液作为提取液，每次提取1h，提取3次，在此条件下，黄酮得率达0.44。半仿生提取对于复方相对有效，不但在一定程度上促进有效成分
27、的溶出，而且还有利于制剂和使用，但单一组分不一定最佳。总之，黄酮类化合物提取的方法很多，每种方法都有其优缺点，应根据提取物的性质、提取成本、工艺设备等条件来选择最适合的提取工艺，提高黄酮类物质的提取率，降低生产成本，增大原料的利用效果。近年来，随着研究方法和技术的不断提高，又发现了黄酮许多新的种类和生理作用，特别是抗自由基等方面的作用。可见，通过高新技术和生产工艺提取黄酮类化合物，并将其应用到医药品、化妆品、食品等领域，必将有着广阔的应用前景。重庆科技学院专科生毕业论文 4 分离纯化4 黄酮类化合物的分离纯化由于黄酮化合物的性质不同，其分离原理有：(1) 酸性强弱不同，利用pH梯度萃取进行分离
28、；(2)极性大小不同，利用吸附能力或分配原理进行分离；(3)分子大小不同，利用葡聚糖凝胶分子筛进行分离等。4.1 pH梯度萃取pH梯度萃取适合分离酸性强弱不同的游离黄酮类化合物。将混合物溶于有机溶剂(如乙醚)，依次用5%碳酸氢钠(萃取7,4-二羟基黄酮)、5%的碳酸钠(萃取7-羟基黄酮或4-羟基黄酮)、0.2%氢氧化钠(萃取一般酚羟基黄酮)、4%氢氧化钠(萃取5-羟基黄酮)萃取而使其分离24。4.2 高速逆流色谱分离法高速逆流色谱(High-speed Countercurrent ChromatographyHSCCC)是20世纪80年代初出现的。HSCCC的原理是利用两相溶剂体系在高速旋转
29、的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡，当其中一相作为固定相，另一相怍为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量的固定相，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现。与其他各种色谱分离技术的根本差别在于，HSCCC不采用任何固态的支撑体(如柱填料、吸附剂、亲和剂、板床、筛膜等)，因此完全排除了因不可逆吸附而引起的样品污染、变性、失活等，不仅使样品能够全部回收，回收的样品也能反映其本来的特性，特别适合于天然产物活性成分的分离、纯化。高速逆流色谱分离法(HSCCC)是一种新的分离技术。其具有两大突出特点：(1)线圈中固定相不需要载体，因而清除了气液色谱中由于使用载体而带来的吸附现象；(2)特
30、别运用于制备性分离，每次进样体积较大，进样量也较多。Min Gao25等采用2个溶剂体系：正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙酸、水；正己烷、正丁醇、乙腈、质量分数0.1的HC1，从灯盏细辛中分离纯化得到了纯度为95.6的黄芩素。4.3 柱色谱法4.3.1 硅胶柱色谱硅胶柱层析主要用于分离极性较低的黄酮类化合物，如异黄酮、黄烷类、二氢黄酮(醇)和高度甲基化或乙酰化的黄酮和黄酮醇。如用乙醚-氯仿溶剂系统从野葛中分离异黄酮类。硅胶在降活后也可用于极性较大的黄酮类化合物如甙类、多羟基黄酮类化合物的分离纯化，如从穿心莲根丙酮提取物中分离黄酮醇26。需要注意的是，由于黄酮类化合物与硅胶有很强的吸附能力，且易与硅胶
31、中很多金属离子络合而不能被洗脱。所以在应用硅胶柱层析法进行分离纯化时应预先用浓盐酸处理硅胶除去金属离子。4.3.2 聚酰胺柱色谱分离黄酮类化合物，聚酰胺是较为理想的吸附剂。其吸附强度主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目、位置及溶剂与黄酮类化合物或与聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小。由己内酰胺聚合而成的尼龙-66及由己二酸与己二胺聚合而成的尼龙-66，最早应用于黄酮类化合物的分离。此法是目前最有效而简便的方法27。4.3.3 葡聚糖凝胶(Sephadex gel)柱色谱葡聚糖凝胶(主要有SephadexLH-20型和Sephadex-G型)是一种淋洗速度快、可以反复使用、没有损失的非常好的分离
32、和纯化黄酮类化合物的填充材料。其中Sephadex-LH20的洗出液中不含杂质，适用于从纸色谱分析、硅胶及聚酰胺柱色谱中分离出来的黄酮类化合物糖甙配基及糖甙的最终纯化。葡聚糖凝胶在分离游离黄酮时，主要靠吸附作用，吸附程度取决于游离酚羟基的数目，游离酚羟基的数目越多越难以洗脱；在分离黄酮甙时，则分子筛的属性起主导作用。相对分子质量的大小或含糖的多少决定化合物被洗脱的先后，分子量越大，连接的糖越多，越易洗脱。姚开28等比较了不同柱层析法对大豆异黄酮主要单体的分离效果：采用300-400目硅胶，用氯仿和甲醇以5:1混合溶液洗脱可使染料木苷、大豆苷、染料木素和大豆索4种单体组分分离；采用聚酰胺柱层析时
33、。用不同浓度甲醇洗脱，可得到极性较大的结合型异黄酮，含量分别为85.3的大豆苷和87.0的染料木苷；采用LH-20葡聚糖凝胶柱，用90 甲醇作洗脱剂，可得到含量高达95以上的大豆苷和染料木甘。4.4 大孔吸附树脂分离法大孔吸附树脂分离法是以大孔吸附树脂为吸附剂和分子筛的柱色谱分离形式。其原理是吸附性和分子筛性。吸附性主要来源于范德华力和氢键作用力；分子筛性来源于大孔树脂的多孔性结构产生的渗透和过滤作用。被分离的成分根据其分子的大小不同和吸附能力的差异而分离。近年来大孔吸附树脂在中药成分(如黄酮、生物碱等)精制纯化等领域中应用越来越广泛。陆英29等确定大孔树脂分离鼠曲草中黄酮类化合物的最佳工艺条
34、件。结果表明，树脂对鼠曲草黄酮有良好的吸附分离性能，其最佳工艺条件为：树脂：ADS-21，质量浓度1.28-1.78 mgmL；pH 3.0；鼠曲草原料液以4 BVh的流速上柱吸附后，再用8倍树脂体积的30乙醇以3 BVh的流速解吸，解吸率为95.5；湿树脂的饱和吸附量为49.57 ragme；纯化产品中黄酮含量为82.23。4.5 高效液相色谱(HPLC)法自20世纪70年代以来，应用HPLC技术已成功分离了大量的黄酮类化合物。随着新技术不断使用、新的柱子与流动相的研究，加上计算机系统的辅助，该方法正在不断完善并将得到更广泛的应用。HPLC已经广泛用于对黄酮类化合物的分离纯化以及定量和定性分
35、析上。正相固定相的HPLC主要用于分离无羟基、甲基化或乙酰化的黄酮；反相固定相(C18)的应用最为普遍。采用甲醇-水-乙酸(或磷酸缓冲液)或乙腈-水作流动相，既可用于黄酮苷元的分离，又适应于黄酮苷的分离30。采用制备柱和半制备柱来分离纯化黄酮单体，是目前最先进和有效的方法。如果分离条件选择的适当，可一次性分离多种单体物质。重庆科技学院专科生毕业论文 5 测定分析方法5 黄酮类化合物的测定分析方法5.1 平面色谱法5.1.1 纸色谱法纸色谱用于黄酮类分析选择性和重现性较差，一般作为定性检测。余戟31采用高于临界胶束浓度(CMC)的十二烷基硫酸(SDS)，溴化十二烷基甲基卞胺水溶液作展开剂，通过纸
36、色谱法分离和检测桑色素、杨梅黄素等8种黄酮苷和苷元，发现了适宜于分离其黄酮苷类的展开体系。5.1.2 薄层色谱法薄层色谱法(TLC)又叫薄板层析，是快速分离和定性分析少量物质的一种很重要的实验技术，属固-液吸附色谱。它兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品(1g甚至0.01g)的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品。此法具有设备简单、操作方便、分离速度快等特点。但离线操作使分辩率和重现性等不如高效液相色谱法和气相色谱法，常被作为定性和半定量的手段。固定相一次性使用，样品无需复杂处理，分离物的性质不受限制，应用广泛；可同时平行分离多个样品，测试速度快，
37、所需溶剂量少，选择范围宽，并有不同展开方式，有利于不同性质的物质分离；此方法可以在同一色谱板上可根据组分性质选择不同显色剂或检测方法进行定性或定量；薄层色谱图像可提供原始彩色图像，不仅便于保存原始图像，而且可以提供较多信息，直观性、可比性均较好都是此法的独特之处32。王亚娟33等采用双波长薄层色谱扫描法对蒲公英总黄酮的含量进行测定。于硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯-甲酸-水(8:1:1)为展开剂展开后，测定波长入s=278nm，参比波长入R=356nm，测得蒲公英总黄酮含量为4.236%。5.2 分光光度法黄酮类化合物多采用硝酸铝比色法测定。其基本原理是以芦丁为标准品，Al(NO3)3络合体系显色
38、，全波段扫描在510nm处有最大吸收峰，测定其吸光度，以此来计算含量。罗宪堂34等人利用该法测定了山香圆叶中的黄酮类成分的含量，但硝酸铝比色法专一性较差，测定受处理过程颜色变化的影响。研究人员对此法进行了多项改进以提高其准确度。尉芹35等人在测定杜仲总黄酮的实验中认为绿原酸是主要干扰因素，他们采用纸层析法将样品中的黄酮与绿原酸分离后，再进行测定，从而提高了测定的准确度。刘佳佳36等用硼酸-柠檬酸比色法测定了银杏叶黄酮的含量。徐燕37以黄芩苷为对照品，采用双波长分光光度法测定黄芩总黄酮含量。周荣琪38将过滤法应用于竹叶黄酮测定中，并对滤纸对于黄酮类物质的吸附进行了校对，发现滤纸对黄酮类物质吸附甚
39、微，此方法应用于竹叶黄酮体系大大提高了测定稳定性，且准确度较高，重现性良好。利用黄酮分子结构中羟基和芳环形成较强的共轭体系对紫外光有较强的特征吸收的特点，可用紫外分光光度法测定黄酮含量。袁金斌39等用紫外分光光度法测定大豆提取物及保健食品中大豆总异黄酮，得出大豆提取物中大豆总异黄酮的含量为38.1，某保健品中大豆中总异黄酮的含量为4.76。5.3 HPLC分析黄酮类化合物正相系统一般采用乙烷或异辛烷等体系为流动相,以极性较大的乙醇、丙醇、乙腈等有机溶剂调节。反相体系则一般优先选择甲醇/水及乙腈/水体系为流动相，还需要加入酸调节pH，抑制解离，克服拖尾现象。为了提高分离度需要梯度洗脱，多用C18
40、柱分离。郑莹40等人使用反相高效液相色谱法对三七叶中的黄酮类化合物进行了含量测定。其方法为：使用ZORBAX Extend C8柱(250mm4.6mm,5m)，流动相为甲醇及0.15 %乙酸水溶液(35:65)，流速1.2mL/min，检测波长268nm，柱温25。实验结果如下：山柰酚-3-O-BD-半乳糖葡萄糖苷与槲皮素-3-O-B-D-半乳糖葡萄糖苷在进样量0.5g-20g范围内均有良好的线性关系，相关系数r2皆为0.9999。5.4 极谱法极谱分析是在特殊条件下进行电解分析，其特殊性在于采用了一个面积很大的参比电极和一个面积很小的滴汞电极进行电解。孙仕萍41等为了测定保健食品中的黄酮含量，探讨用单扫示波极谱法测定总黄酮含量的快速方法,以芦丁为对照品,建立了良好的直线关系。5.5 气相色谱法气相色谱法(GC)具有进样量少、高灵敏度、高选择性、高特异性等优点；但需样品需要衍生，步骤较为复杂，耗时长，且仪器较为昂贵，从而限制该法推广应用。孙艳梅42选取SE-30毛细管柱，在柱温为恒温260时，利用气相色谱法，进行了大豆-葡萄糖苷酶水解大豆异黄