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1、体外培养的癌细胞的观察和传代培养,什么是癌细胞？ “不死”的永生细胞,癌细胞体外培养的意义？,基础研究；药物筛选；单克隆抗体等,方便；快捷,和植物细胞相比,动物细胞全能性表达较难,动物：组织培养 细胞培养,动物细胞培养简介,1 基本概念 2 培养的基本条件 3培养细胞的形态特点 4 传代一般方法 5 实验内容介绍,1 基本概念,原代培养：直接从供体取来的细胞，组织或器官进行的初次培养。通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 传代培养：原代培养物长成单层细胞达到一定密度时，营养消耗殆尽，需要分开扩大培养，补充营养，使之继续增殖。 细胞系：可以传代培养的细胞即可成为细胞系。 有限细
2、胞系：正常二倍体。传代有限。 无限细胞系：癌细胞，转化细胞。异倍体；无限传代。,2 培养的基本条件,总原则：模拟体内条件 。 营养 胞外环境 无污染 其他,2.1 培养基必要的营养,氨基酸：12种必需氨基酸 葡萄糖 维生素：维持酶功能的稳定。 无机盐 血清：生长因子；粘附因子；解毒 1020% 指示剂 酚红,血清的质量是细胞培养的关键,小牛血清 新生牛血清 胎牛血清 进口的胎牛血清,2.2 适宜的胞外条件,温度：哺乳类 3537度。 气体：95%空气，5%CO2。 CO2的作用。 PH: 7.27.4。 NaHCO3 Na+ + HCO3- +H2O Na+ +H2CO3 +OH-,2.3 无
3、污染,实验用品、培养基和试剂等的除菌消毒 操作环境的灭菌消毒 实验操作,超净工作台,风 机 紫外照射30分钟 在酒精灯附近操作,2 培养的基本条件,总原则：模拟体内条件 。 营养 胞外环境 无污染 其他：平衡盐溶液的使用：PBS; D-Hanks等。,3 培养细胞的形态特点,细胞的生长方式： 贴壁；半贴壁；悬浮 形态类型：成纤维样；上皮样；悬浮；其他,成纤维细胞,Hela细胞,淋巴细胞,神经细胞,健康细胞的标准：细胞形态饱满，折光性好，杂质少, 伸展性好。 细胞污染：贴壁细胞脱落，细胞“变瘦”，胞质颗粒多，培养基中杂质多，甚至可观察到菌；培养液很快变黄，且混浊。 细胞缺乏营养：细胞致密时即应传
4、代；若未及时传代，细胞“变瘦”，贴壁细胞变圆脱落，培养液发黄。,4 细胞传代一般方法,悬浮：离心，分装。 半贴壁：吹打，分装。 贴壁：消化，吹打，分装。,5 实验内容介绍,实验目的,了解动物细胞培养的一般知识 学习细胞的传代技术 熟悉倒置显微镜的使用并了解显微镜下体外培养的动物细胞的形态特点 学习超净工作台的使用和无菌操作,实验材料,Hela细胞：宫颈癌上皮细胞；1951年成系。,实验试剂,DMEM 低糖培养基（solarbio） 新生牛血清（solarbio） 胰蛋白酶（Amresco） 2.5g/L胰蛋白酶消化液：用PBS缓冲液配制，pH7.4 水：去离子的双蒸水,实验步骤,观察 倒置显微镜：物镜与照明系统颠倒，物镜在载物台之下。 健康细胞的标准：细胞形态饱满，折光性好，杂质少, 伸展性好。,传代细胞：1传3 在镜下观察细胞密度及形态，待细胞长满连成一片即可传代。 倒掉旧培养基，加胰酶润洗一下，再加胰酶消化2-3分钟左右。 沿无细胞面倒掉胰酶，加4-5ml左右的培养基，充分吹打，镜下观察是否还有贴壁细胞。 分装于三个小培养瓶，补齐培养基约5ml/瓶。 拧上盖子，勿拧太紧，平放于培养箱中。,