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1、第六章 凝胶层析,凝胶层析的基本原理,凝胶介质的基本性质,凝胶层析的基本操作,凝胶介质的选用原则,分子筛色谱（凝胶过滤）,Gel filtration chromatography,层析法所用的凝胶颗粒大小要均一，颗粒內外贯穿许多小孔径的通路，分子量小的物质，比较容易进入颗粒中，因此被延滞流出。,对凝胶过滤介质的要求,亲水性高，表面惰性，即介质与溶质之间不发生任何化学或物理相互作用； 稳定性强，在较宽的pH和离子强度范围以及化学试剂中保持稳定，使用寿命长， 具有一定的孔径分布范围； 机械强度高，允许较高的操作压力（流速）。,凝胶特性参数 内水体积Vi：孔体积 外水体积Vo：颗粒间体积 柱床体积
2、Vt Vt=Vo+Vi+ Vg Vt= Vi+Vo 洗脱体积Ve Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi,A：“全排阻”， 流经体积Vo Kd=0 C：“全渗入”， 流经体积Vo+Vi Kd=1 B：“部分排阻”或 Ve=Vo+KdVi 0 Kd1 Kd=(Ve-Vo)/Vi “排阻系数” 或“分配系数” 一定规格凝胶， Kd特征常数,Kd1 物质分子与凝胶之间有吸附 Tyr=1.4 G-25 小分子Kd1 水合作用 NaCl 0.8 G 0.9 整个凝胶作为固定相 Vi+Vg Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)=KdVi/(Vt-Vo) 有效分配系数 分子形状不同M相近也可分开
3、 牛血清白蛋白（球）、兔血红蛋白（棍） 68000d,凝胶特性参数,排阻极限（exclusion limit） 是指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的相对分子质量。例如Sephadex G50的排阻极限是30 kD。 分级范围（fractionation range） 能被凝胶阻滞并且相互之间可以得到分离的溶质的相对分子质量范围。Sephadex G50的分级范围为1.530 kD。,凝胶粒径 凝胶一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。粒径越小，分离效率越高。凝胶粒径多用筛目或微米表示。软凝胶粒径较大，一般为50150 m（100200目），例如，Sepharose和Sephadex凝胶粒
4、径分布为45165 m 。 硬凝胶粒径较小，一般为550 m 。,床体积（bed volume） 即1 g干燥凝胶溶胀后所占有的体积。Sephadex G50的床体积为911 cm3/g干胶。 空隙体积（void volume） 即V0值。空隙体积可用相对分子质量大于排阻极限的溶质测定，一般使用平均相对分子质量为2000 kD的水溶性蓝色葡聚糖（blue dextran）。 对于商品化的凝胶过滤介质，厂商的产品目录中一般均给出其凝胶的各种性质，如分级范围、粒径、流速与压力的关系等，可参考使用。,GFC的优点,溶质与介质不发生任何形式的相互作用，因此可采用恒定洗脱法洗脱展开，操作条件温和，产品收
5、率可接近100； 每批分离操作结束后不需要进行介质的再生，故容易实施循环操作，提高产品纯度； 作为脱盐手段，GFC比透析法速度快，精度高；与超滤法相比，剪切应力小，蛋白质活性收率高； 分离机理简单，操作参数少，容易规模放大。,GFC的不足之处,仅根据溶质之间分子量的差别进行分离，分离较慢、需严格控制流速； 经GFC洗脱展开后产品被稀释。因此需要在具有浓缩作用的单元操作（如超滤、离子交换和亲和色谱等）后使用。,凝胶的结构和性质,葡聚糖系 其中Sephadex G是最传统的软凝胶过滤介质之一，目前仍被广泛使用。Sephadex G是利用葡聚糖（右旋糖酐）交联制备的，交联剂一般采用环氧氯丙烷。Sep
6、hadex凝胶按交联度大小，分G 10G 200共八种型号。,性质 对稀酸、稀碱、盐溶液稳定 湿态的葡聚糖可加热到110，干的则能耐受120高温 交联度稳定性 凝胶含少量羧基，对阳离子轻微吸附，操作时使I0.02mol/l 芳香族、杂环化合物有时Kd1 新凝胶柱非特异性吸附蛋白，先用廉价较惰性蛋白饱和吸附、洗涤,规格编号 间接反映凝胶孔径、渗入限、排阻限 G-50 分离限1500-30000 G-150：5000-400000 对蛋白、多糖分离范围不同 （多糖分子体积比相同M的蛋白大） 粒度：直径100-300um粗粒 20-80um细粒 40-120um中粒,保存 湿法：悬浮于水、缓冲液中，
7、0.02%NaN3，0-5 干法：乙醇分步处理（20%，40%，60%，80%） 脱水收缩，抽滤，60-80 吹干，室温 半缩法：60-70%乙醇悬液，封口，4 ,修饰葡聚糖凝胶 亲脂性 引入有机基团 Sephadex LH-20（羟丙基）（原Sephadex G-25） 流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂氯仿、四氢呋喃，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤 交联葡聚糖离子交换剂 引入CM-，DEAE-，离子交换、 分子筛,人工合成凝胶，控制凝胶总浓度和交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。,商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种（ 数字X1000就
8、相当于该凝胶的排阻限度） 特点：化学稳定性好pH2-11， 无非特异性吸附， 不为微生物利用 粒度：粗150-300um 中75-150um 细40-75um 极细40um,聚丙烯酰胺凝胶,是由海藻多糖琼脂中分离出来的天然凝胶， 常见的有Sepharose （ Sepharose 2B、4B、6B，数字代表 干胶的百分比 ）,Bio-Gel-A（美国）等,（Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M， 数字X106代表排阻限度。,骨架各线性分子间以氢键相连，孔径依赖于浓度,琼脂糖凝胶,特点： 1.化学稳定性差，pH4-9 2.脱水、干燥、冷冻、有机溶剂、温度高于40
9、便融化 3.与硼酸形成配合物，孔径变化，避免 4.强度低，随凝胶浓度而，弹性小，调整柱压 5.非特异性吸附力葡聚糖，I0.01mol/l无明显吸附 6.分离的M范围大（108），随凝胶浓度而,架桥琼脂糖凝胶 Sepharose CL 1，3-二溴丙醇交联，孔径均匀，孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但机械强度，热稳定性，化学稳定性（pH3-14）,超胶（ultro-gel ACA) 琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶 比Sepharose 化学稳定性好，强度高，pH3-10，热稳定性不变 ACA 34：丙烯酰胺3%，琼脂糖4% 分离范围：生物胶P超胶琼脂糖,多孔玻璃微珠,Bio-Glas 500
10、孔径500 将多孔硅酸盐玻璃加工制得，粉末状，可粘合 特点：化学稳定性高，强度大，耐高压， 对糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡钝化,实验操作 凝胶介质的选择,将样品中的大分子物质与小分子物质分开，其分离策略,是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。,类分离一般选用Sephadex G-25蛋白脱盐（分子量范围1000-5000）或选用G-50。,对于小肽和低分子量的物质的脱盐可选用Sephadex G-10、G-15（分子量范围 -1500）、Bio-Gel P-2或P-4,类分离,凝胶介质的选择,将样品中一些分子量比较接近的物质分开，,该策略是使M尽量在分离范围的两侧 3个组分：
11、 Kd 0 0.5 1,在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶 内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。 分离血清蛋白可用G200 5000-800000 强度低 或G150 5000-400000,分级分离,粒度的选择 细粒：流速低，洗脱峰窄，分辨率高，精制或分析 粗粒： 用于粗制、脱盐,凝胶的预处理,将干胶颗粒悬浮于10倍以上吸液量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀。加热可使溶胀加速，即在沸水浴5小时即可达到凝胶的充分溶胀。 加热法既可节省时间又可排气、消毒。 商品悬浮液去除保存液、抽滤、洗涤、平衡 不需溶胀,层析柱的选择 柱比：长度/直径、 体积 类分离： 柱床体积为样品
12、体积5倍或略多 柱比5:1-10:1 分级分离：25-100倍 柱比25-100 大柱、长柱流速慢、稀释严重、分辨率高,实验室用的层析柱,工业用的层析柱,装柱 1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。 2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，将凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打开柱的出口，使凝胶继续沉集，装柱完毕，关闭出水口。 不能出现分层、倾斜、气泡,凝胶柱的平衡,通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。,上柱样品溶液的体积
13、根据分离要求来确定：,进样体积,进行组别分离时，样品溶液最大可为柱体积的10%,进行分级分离时，样品溶液的体积要小，这样洗脱出的峰形好，蛋白类浓度4%,洗脱 用水、缓冲液、水-甲醇、水-丙酮、氨水、醋酸 温度、流速、柱压、阻力恒定 防止非特异性吸附 操作压流速快，峰宽 相当大柱压范围内 v=KP/L 相同操作压，编号小，交联度大，颗粒粗，流速大,部分收集器,部分收集器,返回,自动馏分收集仪（进口）,再生 重复使用 流速下降、板结可反冲，取出漂洗,凝胶床的检查和维护 使用时间过长、流速过大、柱高过大，流速 控制操作压：柱进出口液位差 凝胶的保存：0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰,返回,蠕动泵
14、,核酸蛋白检测仪,返回,记录仪,返回,国产柱层析系统,伯乐公司（BIO-RAD）柱层析系统,注意事项 1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损。 2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的操作压下装柱，流速不宜过快，避免压紧凝胶。 3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动。,应用,生物大分子溶液的脱盐 用 大粒度、高交联度凝胶 使蛋白Kd=0，盐类Kd=1 蛋白脱盐后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀盐（易挥发盐）洗脱，真空干燥 样品体积Vi/3,去热原 Sephadex G-25 氨基酸 Kd=1 热原Kd=0 样品体积 30%Vt,分离纯化,GFC
15、可用于相对分子质量从几百到106 数量级的物质的分离纯化。 G-50除去结晶胰岛素中前胰岛素、大分子抗原 G-25除去青霉素中抗原性杂质、致敏、高分子杂质,右图是一例利 用高效GFC分离骨髓 血清蛋白质的结果。,色谱柱： 10300，Superose 6 洗脱液：0.05molL磷酸盐 0.15molL NaCl（pH7.0） 流量：0.2mlmin 1.IgA高聚体 2. IgA二聚体 3.IgA单体 4.IgG 5.白蛋白,相对分子质量的测定,在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数成正比，所以GFC可用于未知物质相对分子质量的测定。 GFC仅对球形分子
16、的测量精度较高，对分子形状为棒状的物质，测量值将小于实际值。,理化性质鉴定,已知分子量的标准品,测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条 件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。 此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。,凝胶柱,洗脱体积,分子量的对数,2.理化性质鉴定,绘制标准曲线,凝胶层析技术进行测定,主要参数测算 Vo通常占柱床30% Vo、Vi 1. 重量法 Vt=Vo+Vi+Vg=d2h/4 Vi=gWr g-干胶重量 Wr-吸液量/ g干胶 Vo=Vt-(Vi+Vg) Vg估算为13/g干胶 2. 过柱法 Ve=Vo+KdVi 2106蓝色葡聚糖Kd=0 重铬酸钾 Kd=1,Kd、Kav Kd=(Ve-Vo)/Vi Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo) 对于特定凝胶 ， Kd、Kav是物质特征常数 对于特定凝胶柱， Ve是特征常数 可判断各组分分离，预测放大柱床后Ve,分辨率,R=Ve/0.5(WA+WB) R1 完全分开 VeA=Vo+KdAVi VeB=Vo+KdBVi Ve=Vi(KdB-KdA) 提高分辨率 使Vi增加即增加柱床体积 使(WA+WB) 减小，可浓缩样品，使用细粒凝胶，低流速操作,