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1、,高效液相色谱法测定鲜、冻禽产品中四环素类农药残留量,08商检3班第十组,常用于临床的四环素类抗生素有：金霉素、土霉素、四环素、强力霉素等,来源 土霉素由龟裂链丝菌、四环素由黑白链丝菌、金霉素由金色链丝菌的培养液提取而得，四环素还可用金霉素除去氯元素而获得。,性状 四环素类药物的抗菌作用，在碱性水溶液中下降，而在酸性水溶液中则稳定。四环素类药物分为金黄色或黄色晶粉，无臭，味苦，易溶于水，遇光则色渐变暗，故须密封、遮光，在干燥处保存。其水溶液的稳定性以四环素为佳，但一般均须以新鲜配制为宜，如不能立即用完，应放于低温(4以下)处保存。 作用与用途 四环素、土霉素、金霉素及多四环素为四环素类兽医专用
2、药,该类药物为广 谱抗生素，具有良好的抑菌效果，因其价格便宜，目前仍广泛应用于畜禽、水生生物等产业领域。但由于不合理使用以及不遵守休药期(WDT)等，造成该类药物及其降解产物残留于动物组织及畜产品中，必然会危及人类的健康。因此，为了控制四环素类药物在动物性食品中的残留，欧盟、美国及我国均规定了畜产品中四环素类药物的最大残留限量为0.1mg/L。,四环素类药物,目前四环素类抗生素的含量测定方法有微生物法、高效毛细管区带电泳法、薄层色谱法及高效液相色谱法、HPLC-MS/MS等。本实验选择独特的样品处理方法，建立了一种快速、准确、分离度好的高效液相色谱法。,实验原理,色谱条件 美高效液相色谱仪色谱
3、柱：Hypersil ODS（C18）柱(1506.2mm, 5m)； 流动相：A泵乙腈-水（0.01mol/L)；B泵0.01mol/L磷酸二氢钠溶液（用30% 硝酸溶液调节至pH=2.5），35：65(A：B使用前用超声波脱气10min)； 流速：1.0ml/min； 柱温：室温； 灵敏度：0.002AUFS； 检测波长：355nm； 进样量：10L。,ODS-C18,样品经提取，微孔过滤膜过滤后直接进样，用反向色谱分离，紫外检测器检测，与标准比较定量，出峰顺序为土霉素、四环素、金霉素。,色谱柱的选择 用于分离四环素类化合物的色谱柱种类较多，包括 C18 柱、C8 柱、ODS 柱、苯基柱等
4、，考虑到四环素类 物质在水中溶解度很小，且分子量很小，正相键合相 和反相键合相均可使用，但由于其分子中含酚羟基和烯 酸型羟基，具有一定极性，若选用正相键合相色谱柱， 可能会由于正相键合相的极性很大，二者的作用力很 强，造成洗脱困难，保留时间过长的情况，所以，选 择反相键合相更为适宜。加之，四环素类药物分子中 含酚羟基和烯酸型羟基显弱酸性，同时含有二甲胺基显 碱性，为两性化合物，在一定 pH 值下可以解离，在 反相键合相的条件下，调节pH 值至合适范围，可获得 适宜保留值，达到满意分离。 本实验中选择了反相键合相色谱柱，并对C8 和C18 键 合相的分离能力进行了对比分析，结果表明C18 色谱柱
5、 分离效果较好。这可能是由于C 1 8 色谱柱填料粒径小， 表面积大，柱效高，从而增强了溶质分子的分离度。加 之其有较高的 C 含量和更好的疏水性，对于各种类型的 样品分子具有更强的适应能力，所以在测定和分析禽产 品中四环素类药物多残留时可以优先考虑使用C18 作为 实验用柱。,试剂与配制,土霉素(0TC)、四环素(TC)、金霉素(CTC)标准储备液：准确称取0TC、TC、CTC 固体标准品各0.0100g，0TC、TC用0.1mol/L盐酸溶解定容至10.00mL，CTC溶于蒸馏水定容至10.00mL。此三种标准储备液含量为1mg/mL (4下可保存一周)。 混合标准溶液：取0TC、TC标准
6、储备液各1.00mL，CTC标准储备液2.00mL，用蒸馏水定容至1O ml，此混合标准液中OTC、TC含量分别为100gml（ppm），CTC含量为200gml（ppm） (当天配制当天使用)。 5%高氯酸溶液 0.01mol/L磷酸二氢钠溶液：称取1.56g磷酸二氢钠溶于100 mL水中，用30%硝酸调节PH至2.5，经微孔滤膜过滤，超声备用。 乙腈 分析纯,样品预处理 将动物组织解冻，匀质，准确称取5.00g(0.01g) 置于50ml追星瓶中，加入5%的高氯酸溶液25ml，于超声波振荡器上振摇10min。以2000rmin高速离心3min，取上清液，经0.45m滤膜过滤，取10L进样，
7、从工作曲线上查得含量。 工作曲线 分别称取7份切碎的肉样，每份5.00g（精确到0.01g） 分别加入混合标准溶液0.25L、50L、100L、150L、200L、250L（含土霉素、四环素各0、2.5g、5.0g、10.0g、15.0g、20.0g、25.0g）；按试样测定方法操作，以峰高为纵坐标，抗生素含量为横坐标，绘制标准曲线。 结果计算 x= 式中，x为样品中抗生素含量，mg/kg,A为样品溶液测得的抗生素质量，mg；m为样品质量，g。,操作步骤,这是在GB/T20764-2006中截取的标准物质色谱图，用的是液相色谱-紫外检测法。与书本所述方法有所区别，在这列出作为参考，出峰顺序依次
8、为土霉素、四环素、金霉素。,参照GB/T60764-2006,GB/T21317-2007中测定四环素类兽药残留的相关方法，为使方法更为准确可靠，在原实验的基础上，可以再做回收率及精密度试验 回收率及精密度试验：分别向5mL空白样品中添加混合标准溶液制成0.05、0.1、0.2gml 3种浓度的标准回收溶液，按上述样品处理和色谱条件进行回收率及精密度试验(每个添加做5个平行),我说我见解,注意事项,1）由于四环素类抗生素在生物品中易与蛋白质强烈结合，因此需要用强酸或酸性脱蛋白剂从生物制品中提取。 2）四环素在酸性水溶液中紫外270nm处有最大吸收。 3）不同ph值流动相条件下四环素类抗生素出峰效果不同，ph值越高，峰的拖尾现象越严重。酸性增强，各峰间的分离度增大，峰形越对称，但是过低的ph值会使填料柱水解，损坏柱子，故选用ph值2.5的乙腈与磷酸二氢钠溶液组成流动相，具有较好的峰形。,THE END,THANKS!,