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1、实验 8 考马斯亮蓝染色显示细胞骨架,1、了解细胞骨架成分显示方法的原理和操作步骤； 2、观察微丝在细胞中的分布。,一、实验目的,2019/8/12,1,细胞骨架的概念为真核细胞胞质中的蛋白质构成的纤维系统，在细胞的形态维持、细胞的运动、物质运输和细胞分裂中发挥重要作用。三种组成成分： 微丝、微管、 中等纤维 非肌细胞中的微丝是动态结构，肌动蛋白单体（G-actin）与纤维（F-actin）在一定条件下互相转化。本实验中M-缓冲液提供的离子条件可使F-actin稳定。,二、实验原理,2019/8/12,2,中等纤维,微管,微丝,2019/8/12,3,二、实验原理,考马斯亮蓝R250(Coom
2、assie blue R250)是一种蛋白质染料，不能特异地显示细胞骨架蛋白。用含非离子型去垢剂TritonX-100的缓冲液处理细胞，可将细胞的膜结构和部分蛋白质抽提掉，但细胞骨架系统的蛋白质却被保留，用考马斯亮蓝R 250染色后，在光学显微镜下可见一种网状结构，其主要成分为直径40nm左右的微丝束。 观察时可能会发现细胞膜上有些孔洞，甚至有些细胞变空了，这可能是由于Triton X-100处理时间过久破坏细胞结构所致。,2019/8/12,4,培养的成纤维细胞用Coomassie blue染色的结果,2019/8/12,5,显示细胞骨架成分的特异性方法,1、特异性的药物结合反应： 如罗丹明
3、标记的鬼笔环肽，可以显示微丝 2、免疫细胞化学方法： 制备细胞骨架蛋白的特异性抗体，用免疫荧光、免疫酶标的方法显示细胞骨架,2019/8/12,6,免疫荧光染色 左：微丝，中：微管 ，右：中等纤维,2019/8/12,7,三、实验用品,复式显微镜（带油浸物镜） 擦镜纸（lens paper）；记号笔；小片滤纸；载玻片；盖玻片；剪刀；镊子；洋葱鳞茎 1% TritonX-100； M缓冲液； 3%戊二醛； pH6.8 磷酸缓冲液； 0.2%考马斯亮蓝R-250染色液,2019/8/12,8,四、实验步骤,1用镊子撕取洋葱鳞茎内侧的表皮，剪成约1cm见方。置于pH6.8的磷酸缓冲液中，使其下沉（每
4、人做2片，不要太大，否则不易展开）。 2吸弃磷酸缓冲液，用1% TritonX-100处理20 mins。对照组使用M缓冲液处理。 3M缓冲液洗5 mins X 3 times 43%戊二醛固定30 min（或Carnoy固定液） 5磷酸缓冲液洗5 mins X 3 times 。 60.2%考马斯亮蓝染色30 mins，蒸馏水冲液洗一次，5分钟。然后将表皮（带少量液体）平铺在载玻片上，加盖玻片，显微镜下观察。,2019/8/12,9,洋葱表皮细胞（200倍）,五、实验结果,2019/8/12,10,洋葱表皮细胞（400倍）,五、实验结果,2019/8/12,11,洋葱表皮细胞（对照组，100
5、倍）,五、实验结果,2019/8/12,12,五、实验结果,2019/8/12,13,六、实验报告,简单画出所观察到的图像（包括对照）的并分析。 用1%的Triton X-100处理细胞的作用是什么？ M缓冲液的作用是什么？,2019/8/12,14,注意事项,洋葱鳞茎内表皮不必剪得过大，否则很难平整地铺开在载玻片上，而是部分重叠着，影响观察效果。 另外，在用高倍镜观察之前要盖上盖玻片，如果载玻片上较干，最好先滴上一滴水后再盖盖玻片，以免造成很多气泡，影响观察效果。 染色时间不宜过长，否则会染色过甚反而观察效果不佳。 用1%Triton X-100抽提杂蛋白的时间要控制好，时间长将破坏细胞结构，抽提时间短背景干扰大，影响观察效果。,2019/8/12,15,