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1、实验三 离心技术及 酶学实验,概念 生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离的一种技术。沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度，离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备。,第一节 基本原理,离心力 当一个粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即：,相对离心力（RCF） 通常离心力常用地球的引力的倍数来表示，所以称为相对离心力。 在离心场中，作用于颗粒的离心力相当于地球重力的倍数，单位是重力加速度g（980cm/s2）。, RCF = 1.11910-5(rpm)
2、2r (rpm-revolutions per minute为每分钟转数，r/min) 低速离心时常以转速“rpm”来表示 高速离心时则以“g”表示,第二节 离心机的主要构造和类型,工业用离心机 离心机 制备性离心机 实验用离心机 分析性离心机,一、制备性离心机的三类 1 普通离心机：最大转速6000rpm左右 2 高速冷冻离心机：最大转速为20000 25000rpm（r/min） 3超速离心机：转速可达5000080000rpm， 超速离心机装有真空系统，这是它与高速离 心机的主要区别。,二、转头,1角式转头,2荡平式转头： 这种转头是由吊着的4或6个自由活动 的吊桶(离心套管)构成。 3
3、区带转头： 区带转头无离心管，主要由一个转子 桶和可旋开的顶盖组成。 4 垂直转头： 其离心管是垂直放置的。 5 连续流动转头： 转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口 的转头盖及附属装置组成。,三、离心管,塑料离心管常用材料有聚乙烯(PE)，聚碳酸酯(PC)，聚丙烯(PP)等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明(或半透明)，硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。,不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。 离心管盖 离心前必须盖严，配平时需带管盖重量 防止样品外泄、挥发 支持离心管，
4、防止离心管变形,制备性超速离心的分离方法 差速沉降离心法 逐渐增加离心速度，或者低速、高速交替进行离心，使不同的离心速度及不同离心时间下分批分离的方法。 用途：分离沉降系数相差较大的颗粒 优点：操作简便 缺点：分理效果差，颗粒受挤压易变性失活,密度梯度区带离心法（区带离心法） 定义：将样品加在惰性梯度介质中进行离心沉降或沉降平衡，在一定的离心力下把颗粒分配到梯度中某些特定位置上，形成不同区带的分离方法。 优点：分理效果好、适应范围广、颗粒不会挤压变形保持活性 缺点：离心时间长、需制备惰性梯度介质溶液、操作严格不易掌握,五、离心操作的注意事项,使用各种离心机时，必须事先在天平上精密地平衡离心管和
5、其内容物，转头中绝对不能装载单数的管子，当转头只是部分装载时，管子必须互相对称地放在转头中，以便使负载均匀地分布在转头的周围。 每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。,装载溶液时，要根据各种离心机的具体操作说明进行，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管，有的离心管无盖，液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀;而制备性超速离心机的离心管，则常常要求必须将液体装满，以免离心时塑料离心管的上部凹陷变形。 若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。 离心过程中不得随意离开,实验内容,酶的提取
6、及比活性测定,一、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)的分离纯化及比活性测定,目的 1掌握AKP分离纯化的实验原理、方法 及注意事项 2了解检测AKP活性测定的原理和方法。,方法 酶的本质：蛋白质 盐析法 有机溶剂沉淀法 层析法 电泳,酶,组织细胞：先破碎细胞， 再用一定的试剂提取,原则 制备的原料 初期采用、后期采用方法 影响因素,影响因素 pH：最适pH 温度：低温时酶比较稳定，有机溶剂需预冷 氧化：SH对某些酶的活性必需，加入还原剂 重金属离子污染：与SH发生作用而失活：EDTA 蛋白酶的污染，PMSF、DFP 介质的极性和离子强度：疏水,最稳定pH,评估指标
7、 酶的纯度用比活性代表 定义：单位重量（mg）蛋白样品中所含酶的活性单位 表示方法：每mg蛋白质所具有酶的活性单位 测定方法：每ml样品中的蛋白质mg数 每ml样品中酶的活性单位 酶的活性单位：酶促反应在单位时间（秒、分钟、小时）内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所需要的酶量。,酶的回收率 提取纯化过程中杂蛋白逐步去除，同时伴随部分酶的损失。 在保证纯度的前提下，应尽可能提高酶的收率。,原理 机械破碎法制备肝匀浆 匀浆液 低浓度醋酸钠：低渗破膜 低浓度醋酸镁：保护和稳定AKP 有机溶剂沉淀法分离纯化AKP 加入不同有机溶剂，重复离心 正丁醇：沉淀部分除AKP的蛋白质 33丙酮(30乙醇)：A
8、KP溶解 50丙酮(60乙醇)：AKP不溶解,(一)碱性磷酸酶的分离提纯,操作步骤,25g肝组织剪碎 +0.01M醋酸镁-醋酸钠溶液75ml，匀浆机中匀浆 取肝匀浆4ml(A液）,A1：取0.1mlA液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性,A2：取0.1mlA液+4.9ml生理盐水，待测蛋白浓度,+2ml正丁醇，混匀2min，室温置30min，离心 （2500rpm)5min 下清液（吸取） 沉淀（弃） +等体积丙酮，离心（2000rpm)5min 上清液（弃） 沉淀 +0.5M醋酸镁2ml溶解（B液）,操作步骤,B 液 +95%冷乙醇至30%，离心（2500rpm）5min 上清
9、液（吸取） 沉淀（弃） + 95%冷乙醇至60%，离心（2500rpm）5min 上清液（弃） 沉淀 +0.01M 醋酸镁-醋酸钠2ml,溶解（C液） C1：取0.1mlC液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性 C2：取0.1mlC液+0.1ml生理盐水，待测蛋白浓度,B1：取0.1mlB液+1.9mlpH8.8Tris缓冲液，待测比活性,B2：取0.1mlB液+0.9ml生理盐水，待测蛋白浓度,加入有机溶剂计算公式 设加入Xml95%乙醇 至终浓度30% 30%（B液体积+X）=95%X X=30%B液体积95%-30%=0.462B液体积 至终浓度60% 60%（上清液体积+X
10、）30%上清液体积=95%X X=（60%-30%）上清液体积 95%-60%=0.867上清液体积,注意事项,各步加入有机溶剂量要准确。否则会影响整个实验结果。 操作要在低温下进行 加入有机溶剂时要慢慢滴加，充分搅拌，避免局部浓度过高而引起升温和变性。 加入有机溶剂混匀后不宜放置过久，应立即离心。 离心析出的蛋白质沉淀应立即将溶于适量的缓冲液中，以避免酶活力的丧失。,(二)碱性磷酸酶的比活性测定,原理 比活性的定义 单位重量的蛋白质样品中所含的酶活性单位。 通常用每毫克蛋白质具有的酶活性单位来表示。 用以鉴定酶的纯化程度，是酶提取与纯化成功与否的评价指标之一。,测定样品的比活性必须测定： 每
11、毫升样品中的酶活性单位数。 每毫升样品中的蛋白质毫克数。,磷酸苯二钠法测定碱性磷酸酶活性 AKP 4-氨基安替比林 磷酸苯二钠 酚 醌衍生物（红色） 铁氰化钾 根据红色的深浅用比色法测定酚的含量。 37保温15分钟产生1g酚者为1个酶活性单位。,考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 回顾实验原理（实验讲义第60页）。,操作步骤 1.AKP活性单位测定 取试管5支，按下表操作：,加0.2M NaOH溶液1ml 加0.3%4-氨基安替比林1ml, 0.5%铁氰化钾溶液2ml，混匀，室温10min，各溶液进行A510测定 计算：酶活性单位/ml=A标本/A标准C标准（0.1）稀释倍数,操作步骤,2. 蛋白质含量测定 取试管5支，按下表操作,室温5min，各管进行A595测定 计算：样品中蛋白质的含量（l）=A样品/A标准C标准稀释倍数,3. 结果处理与分析,结果处理表,（三）思考题,酶的提取纯化过程中应该注意哪些问题？如何评价酶的提 取与纯化成功与否？ 测定酶的比活性有何意义？,