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1、,实验八 总RNA提取和反转录,实验目的：,1.掌握TRIZol试剂法提取细胞总RNA的原理和实验步骤； 2. 掌握反转录（RT）的基本原理和操作步骤。,总RNA提取,反转录 （RT）,聚合酶链式反应 （PCR）,检测目的基因的表达：,通过变性剂破碎细胞或者组织，然后经过氯仿等有机溶剂抽提RNA，样品分成水样层和有机层，RNA存在于水样层中。收集水样层后，通过异丙醇沉淀RNA，再经过洗涤、晾干、最后溶解等步骤即得到相对较纯的RNA。 反转录是在反转录酶的作用下，以总RNA中mRNA为模板合成cDNA的过程。,实验原理：,1TRIzol试剂：主要成分是苯酚，它能裂解细胞，使细胞中的蛋白、核酸物质
2、解聚并得到释放。此外，TRIzol中还有8-羟基喹啉、异硫氰酸胍、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。 2氯仿：与酚一起作用，使蛋白质变性；抽提水相中残留的酚，减少RNA损失。 3异丙醇：沉淀核酸。 475乙醇（DEPC水配制）：去除RNA沉淀中的盐分。,试剂的用途：,实验步骤：,1. 取1/3小鼠完整肝组织（约1g），直接加入4mL TRIzol试剂。用匀浆器进行匀浆处理，室温放置5分钟,每组取0.5mL 。 2. 加入0.1mL氯仿，剧烈振荡15s，室温放置3min。 3. 10000rpm离心5min，RNA主要在上层水相中。转移0.3mL水相至新的离心管中。 4.加入0.5mL异丙
3、醇，轻轻混匀，室温静置5 min。 5. 10000rpm离心5 min，弃上清。 6. 加入1mL 75乙醇，轻轻洗涤RNA沉淀，10000rpm离心5min，弃上清。 7. 室温晾干(约510min)。 8. 加入100L无RNase水溶解RNA，取50L用于A260和A280值测定。 9. 计算RNA的浓度和A260/A280值,总RNA提取,1只小鼠/小班，3个匀浆器/小班,（1）在0.2mL微量离心管中配制混合液,（2）轻轻混匀，离心，将样品沉至管底后，65水浴保温5分钟，然后迅速冰浴冷却。,反转录（RT）,以下操作在冰上进行。 （3）往上述管中配制下列反转录反应液,（4）缓慢混匀，
4、稍稍离心将样品沉至管底，按下列条件进行反转录反应： 42保温3060分钟，70保温15分钟，然后冰上冷却。,1.提取总RNA和反转录的整个过程都要严格控制RNase的污染。操作者要配带口罩、帽子和手套。所有用到的塑料和玻璃器皿均需要灭活RNase。 2. 反转录中，迅速冰浴的操作一定要快，不能是温度缓慢下降，否则RNA可能局部复性降低反转录的效率。 3.反转录的反应中对RNA浓度有比较高的要求，因此必需测定RNA浓度。只有保证RNA浓度在合适的范围内才能提高扩增的成功几率。,注意事项:,28S,18S,5S,5.8S,1 2,（A）,（B）,(A)细胞总RNA的制备; (B)RT-PCR分析TBX5在不同细胞中的表达,思考题：,RNA酶的变性或失活剂有那些？其中在总RNA的抽提中主要可用哪几种？ 在提取总RNA和反转录的过程中，如何避免RNase的污染？,