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1、实验八、培养基的配制与灭菌,目 的 要 求,了解培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程。 了解几种灭菌方法，掌握干热灭菌法和加压蒸汽灭菌法的原理及其使用方法。 熟悉分离、培养微生物前的有关准备工作及操作方法。,实 验 材 料,药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、琼脂、马铃薯、蔗糖；可溶性淀粉、K2HPO4、KNO3、MgSO47H2O、FeSO47H2O等。 高压蒸汽灭菌器、恒温干热灭菌箱、细菌过滤器、紫外线杀菌灯。 其它：天平、牛角匙、电炉、1N HCl、1N NaOH、pH试纸、刻度搪瓷杯、量筒、漏斗、漏斗架、玻棒、带玻璃珠的三角瓶、带棉塞的无菌试管、无棉塞的空试管、培养皿、吸管、各种包装纸、防
2、水纸、绳索、棉花、标签等。,方法与步骤,培养基的配制 分离培养微生物常用器皿的准备 培养基和玻璃器材的灭菌方法,培养基的配制方法和步骤,称量：按照配方正确称取各种原料放于搪瓷杯中。 溶化：在搪瓷杯中加入所需水量，玻棒搅匀，加热溶解。 调pH值：用1N NaOH或1N HCl调pH，用pH试纸对照。 加琼脂溶化：加热过程中要不断搅拌，可适当补水。 分装：注意不要污染棉塞。 包扎成捆，挂上标签（必须用铅笔写），注明何种培养基。 灭菌备用：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。,方法与步骤 （培养基的配制方法和步骤）,方法与步骤 （培养基的配制方法和步骤）,方法与步骤
3、（几种培养基的配方及配制）,牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（用于分离和培养细菌，是一种天然培养基）配方如下： 牛肉膏 3g 蛋白胨 10g 氯化钠 5g 琼脂 20g 自来水 1000mL pH 7.27.4 灭菌 1.05kg/cm2，20min,淀粉琼脂培养基（高氏一号Gause1），用于分离和培养放线菌，是一种合成培养基。配方如下： 可溶性淀粉 20.0g KNO3 1.0g K2HPO4 0.5g MgSO4 7H2O 0.5g NaCl 0.5g FeSO4 7H2O 0.01g 琼脂 20g 自来水 1000mL 灭菌： 1.05kg/cm2 30min,马铃薯（或豆芽汁）蔗糖（或葡萄糖）
4、琼脂培养基（用于分离和培养真菌之用，是一种半合成培养基），其配方如下： 去皮马铃薯（或鲜豆芽） 200g 蔗糖（或葡萄糖） 20g 自来水 1000mL 琼脂 20g pH 自然 灭菌：（含蔗糖）1.05kg/cm2 20min （含葡萄糖）0.1kg/cm2 30min,YPD培养基（分离培养酵母菌）,YPD 或YPED，：Yeast Extract Peptone Dextrose Medium(1L)，酵母膏蛋白胨葡萄糖培养基： 配方：1% Yeast Extract（酵母膏） ，2% Peptone（蛋白胨） ，2% Dextrose (glucose)（葡萄糖），若制固体培养基，加入
5、2%琼脂粉。,无菌水的制备 无菌水为下一次微生物分离实验中所需要的材料。 100mL三角烧瓶（装有玻璃珠），装自来水99.0mL，试管中装4.5mL自来水，塞上棉塞，包扎、灭菌备用。三角烧瓶和试管须预先塞好棉塞，并灭菌。,方法与步骤 （分离培养微生物常用器皿的准备）,清洗一些玻璃仪器：如三角烧瓶、试管、培养皿、吸管等。 棉塞的制作 包装培养皿和吸管等。,四、注意事项 称药品用的牛角匙不要混用；称完药品应及时盖紧瓶盖。调pH时要小心操作，避免回调，不同培养基各有配制特点，要注意具体操作。 五、实验报告 记录本实验配制培养第的名称、数量，并图解说明其配制过程，指明要点。,思考题,固体培养基加琼脂后
6、加热溶化时要注意哪些问题？ 配制培养基有哪几个步骤?在操作过程中应注意些什么问题?为什么? 培养基配制完成后，为什么必须立即灭菌?若不能及时灭菌应如何处理？已灭菌的培养基进行无菌检查？,采用强烈的理化因素使任何物体内外所有的微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施称之为灭菌。灭菌是要进行微生物纯培养的需要。 实验室最常用的灭菌方法是利用高温处理达到杀菌效果。高温主要是使微生物的蛋白质和核酸等重要生物大分子发生变性。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌两大类。湿热灭菌的效果比优于干热灭菌。湿热下热量易于传递，更容易破坏保持蛋白质稳定性的氢键等结构，加速其变性。此外，过滤除菌、射线灭菌和消毒、化学药物灭菌和消
7、毒等也是微生物学操作中不可缺少的常用方法。,消毒和灭菌,三、操作步骤 ()高压蒸汽灭菌法 高压蒸汽灭菌法适用于培养基、无菌水、工作服等物品的灭菌。 1加水 将内层灭菌桶取出，再向外层锅内加入适量的水，以水面与三角架相平为至。 2装料 将装料桶放回锅内，装入待灭菌的物品。装有培养基的容器放置时要防止液体溢出，瓶塞不要紧贴桶壁，以防冷凝水沾湿棉塞。,3加盖 将盖上与排气孔相连接的排气软管插人内层灭菌桶的排气槽内，摆正锅盖，对齐螺口，然后以同时旋紧相对的两个螺栓的方式拧紧所有螺栓，并打开排气阀； 4排气 加热待水煮沸后，水蒸汽和空气一起从排气孔排出。一般认为，当水沸后约5min，表明锅内空气已排净。
8、 5升压 当锅内空气排净时，即可关闭排气阀，压力开始上升。,6保压 当压力表指针达到所需压力刻度时，控制热源。开始计时并维持压力至所需时间。本实验用121，20min灭菌。 7降压 达到所需灭菌时间后，关闭热源，让压力自然下降到零后，打开排气阀。放净余下的蒸汽后，再打开锅盖，取出灭菌物品，倒掉锅内剩水。 8无菌检查 将已灭菌培养基于37培养24h，无杂菌生长，即可待用。,(二)干热灭菌法 干热灭菌法适用于玻璃器皿，如试管、培养皿、三角瓶、移液管等的灭菌； 1 装入待灭菌物品 预先将各种器皿用纸包好或装入金属制的培养皿筒、移液管筒内，然后放人电热烘箱中。 2升温 关好电烘箱门，打开电源开关，旋动
9、恒温调节器至所需温度刻度(本实验所需为160170)，此时烘箱红灯亮，表明烘箱已开始加热，当温度上升至所设定温度后则烘箱绿灯亮，表示已停止加温。,3恒温 当温度升到所需温度后，维持此温度2h。 4降温 切断电源，自然降温。 5.取出灭菌物品 待电烘箱内温度降到70以下后，才能打开箱门，取出灭菌物品。,(三)过滤除菌法 有些物质，如抗生素、血清、维生素等易受热分解，因而要采用过滤除菌法。 1过滤器的种类 (1)滤膜过滤器：由醋酸纤维素、硝酸纤维素等制成，有孔径大小不同的多种规格(如0.1m、0. 22m、0.3m、0. 45m等)，过滤细菌常用0.45m孔径。其优点是吸附性小，即溶液中的物质损耗
10、少，滤速快，每张滤膜只使用1次，不用清洗。,(2)蔡氏滤器：是一种金属制成的过滤漏斗，其过滤部分是一种用石棉纤维和其他填充物压制成的片状结构。溶液中的细菌通过石棉纤维的吸附和过滤而被去除，但对溶液中其他物质的吸附性也大。每张纤维板只能使用1次。,(3)玻璃滤器：是一种由玻璃制成的过滤漏斗，其过滤部分是由细玻璃粉烧结成的板状构造。玻璃滤器规格很多，5号(孔径25m)和6号(孔径小于2m)适用于过滤细菌。其优点是吸附量少，但每次使用后要洗净再用。清洗方法是：用水充分冲洗，然后浸于含1KNO3的浓硫酸中24h，再用蒸馏水抽洗数次。在抽洗液中加人数滴BaCl2，至不出现BaSO4沉淀时，即表示已洗净。
11、,2过滤装置 （1）按图4-4进行安装，为阻止空气中细菌进人滤瓶而在接管处塞入棉花、外用纸包好进行121湿热灭菌20min。 (2)为加快过滤速度，一般用负压抽气过滤，可接真空泵进行抽滤。,四、注意事项 1使用灭菌锅应严格按照操作程序进行，避免发生事故；灭菌时，操作者切勿擅自离开，务必待压力下降到零后，才可打开锅盖。 2干热灭菌时电烘箱中物品不要摆得太拥挤，以免阻碍空气流通而影响灭菌效果；灭菌物品不要与电烘箱内壁的铁板接触以免包装纸烤焦起火。 3过滤除菌时应注意检查过滤装置各连接处是否漏气，以防污染。,灭菌后：摆斜面，物品烘干等。,五、实验报告 1记录各种不同物品所用的灭菌方法及灭菌条件(温度、压力等)。 六、问题和思考 1比较各种灭菌方法的原理及适用范围。 2高压蒸汽灭菌中为什么要把冷空气排净，为什么在灭菌后不能骤然快速降压，并要再放尽锅内蒸汽才能打开锅盖?,每组准备需灭菌物品,斜面培养基4支试管， 固体培养基200mL（2%琼脂，用一个三解瓶装） 无菌水一瓶，装水150-200mL，另一个三角瓶加玻璃珠若干 培养皿10个 试管6支 1mL移液管8支，10mL移液管2支 以上物品均需灭菌，灭菌后斜面培养基要摆斜面，移液管、试管和培养皿要烘干。,