亚麻单倍体的研究进展.pdf

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1、中国油料作物学报 ， （ ） ： ： 亚麻单倍体的研究进展 叶春雷， 王 炜， 张建平， 欧巧明， 罗俊杰 （ 甘肃省农业科学院生物技术研究所， 甘肃 兰州， ； 甘肃省农业科学院作物研究所， 甘肃 兰州， ） 摘要： 单倍体在基础研究和育种上都有重要的应用价值， 可通过雄核发育（ 花药和小孢子培养） 、 雌核发育途 径（ 未受精卵或子房培养等） 、 种内或种间杂交产生。在亚麻单倍体研究中， 花药培养是目前研究最多， 应用最广泛 的方法。本文结合国内外文献， 综述了亚麻单倍体的研究进展， 侧重于亚麻花药培养过程中关键影响因子， 如供体 植株的基因型、 栽培条件、 预处理方式、 培养基的筛选等；

2、 分析了目前我国在亚麻单倍体育种研究中出现的问题并 针对这些问题提出了建议。 关键词： 亚麻； 单倍体； 花药培养； 小孢子培养； 子房培养 中图分类号： 文献标识码： 文章编号： （ ） ， ， ， ， （ ， ， ， ； ， ， ， ） ： （ ） ， （ ） ， （ ） ， ， ： ， ， ： ； ； ； ； 收稿日期： 基金项目： 国家胡麻产业技术体系（ ） 作者简介： 叶春雷（ ） ， 男， 助理研究员， 博士研究生， 主要从事单倍体育种研究， ： ， ： 通讯作者： 罗俊杰（ ） ， 男， 研究员， 博士， 研究方向为生物技术育种、 作物栽培与耕作， ： 单倍体育种因可以缩短育种周

3、期、 提高育种效 率等优越性， 受到了育种家的广泛重视， 此外， 单倍 体对于基础研究如细胞遗传学、 分子遗传学、 作物进 化学、 植物生物技术等相关领域也有相当重要的用 途 ， 。单倍体可通过雄核发育（ 花药和小孢子培 养） 、 雌核发育途径（ 未受精卵或子房培养等） 、 种内 或种间杂交产生。自 世纪 年代 等首次 通过花药培养获得曼陀罗单倍体植株以来， 迄今为 止已在 多种植物中获得单倍体植株 ， 并在许 多重要的农作物如水稻、 大麦、 油菜中都得以成功应 用到育种程序中， 取得了显著的社会和经济效益。 最早报道发现亚麻单倍体 ， 而首次在 实验室中获得单倍体再生植株则是在 世纪 年 代

4、， 由我国孙洪涛等人通过纤维用亚麻花药培养获 得的 。此后， 国内外许多研究者对影响亚麻花药 愈伤组织的诱导及再生植株形成的相关因素， 诸如 供体植株的基因型、 种植环境、 取材时期、 诱导和分 化培养基、 培养条件、 加倍等相关方面进行了系统的 研究 ， 并应用于亚麻育种实践中， 通过花药培养 先后育成 、 双亚 号等若干品种（ 系） 得以 推广应用 ， 。另外， 一些研究者对产生单倍体植 株的其他方法， 如小孢子培养 ， 、 未受精子房培 养 ， 和双胚亚麻 ， 也进行了一些有益的探 索， 但尚未见到通过种内或种间杂交获得单倍体的 研究报道。本文综述了产生亚麻单倍体植株的几种 主要方法，

5、重点阐述了亚麻花药培养过程中关键影 响因子的研究进展， 对目前我国在这方面研究中出 现的问题做了分析并提出了解决这些问题的建议， 以便为亚麻单倍体研究提供参考。 花药培养 目前， 花药培养已经成为亚麻单倍体育种中应 用最成功的方法。然而， 总体而言， 植株再生效率相 对较低， 难以满足亚麻育种的需要。因此， 一般认为 亚麻是一种具有花培抗性的作物 ， 研究认为影响 亚麻花药培养效率的因素主要存在以下几个方面。 供体植株的基因型 在植物的花药培养中， 供体植株的基因型是影 响花药培养效果的关键因素之一。对许多不同品种 （ 系） 、 杂交组合 、 的亚麻植株进行花药培养的 研究结果表明， 亚麻是一

6、种对花培具有高度基因型 依赖性的作物， 某些基因型的亚麻品种（ 系） 相对于 其他基因型品种（ 系） 更易于通过花药培养产生再 生植株 ， ， 如 等对 、 、 、 等 份不同基因型的材料进行 花药培养， 再生植株发生频率从 不等， 其 中 、 、 、 四个 品系的再生植株发生频率相对较高， 证明这几种基 因型材料具有较高的花培反应能力， 而 、 、 、 等一些品种（ 系） 的再生植株发生频率较低， 因而不适宜于进行花药 培养 。正是由于这种对花培反应的高度基因型 依赖性， 目前还没有一种可以普遍适用于所有亚麻 品种（ 系） 的花药培养模式。通过将易诱导分化的 材料与难以诱导分化的材料进行杂交

7、， 可以克服某 些材料不能诱导分化的本性， 提高花培反应能力。 供体植株的栽培条件和生理状态 供体植株的栽培条件也是影响亚麻花药培养成 功与否的重要因素之一。研究表明无论在大田环境 下还是在可控环境中（ 如人工气候室） 种植的亚麻 供体植株， 都可以通过花药培养诱导出愈伤组织， 然 而在可控环境中因具备稳定的光照、 温度和湿度以 及可以不受自然季节的限制， 对于其花药培养比较 有利 ， 。在大田中种植的亚麻植株因降水量和 昼夜温度的不同， 其小孢子的形成过程会受到严重 影响， 从 而 在 其 后 的 花 药 培 养 过 程 中 反 映 出 来 ， 。 等人在油用亚麻花药培养中， 对供体植株的生

8、长环境进行优化研究， 结果表明， 白 天设为 ， 晚间设为 时， 愈伤组织诱 导和分化情况最好 ； 等人对两种环境下 （ 白天 ， 晚间 ； 白天 ， 晚 间 ） 种植的供体植株进行花药培养的效果 进行了比较研究， 表明前者较后者效果佳， 愈伤组织 诱导率可达到 。因此， 一般认为供体植 株在相对低温的生长环境下对亚麻花药培养更为 有利。 除此之外， 供体植株的生理状态也是亚麻花药 培养中必须考虑的。免受干旱、 病害等逆境影响的 健壮植株比较适宜于做花药培养。与此同时， 小孢 子发育阶段对配子体愈伤组织或胚状体的形成甚至 是之后的分化发育起关键作用。研究表明小孢子处 于单核中期、 单核晚期、

9、双核早期时都能被诱导出愈 伤组织或胚状体， 但以单核中期到晚期时的小孢子 进行亚麻花药培养的效果最好 ， 。 预处理方法 在受到胁迫时， 小孢子或未成熟花粉粒可被诱 导朝着雄核发育途径发育， 而非形成成熟的花粉 粒 。目前国内外对花药培养（ 或小孢子培养） 中 预处理方法的研究多集中于高温、 低温、 碳饥饿等几 种方式。在包括亚麻在内的许多植物花药培养中， 对花药进行预处理有利于提高花药（ 小孢子） 培养 效率 。颉瑞霞等 的研究发现， 接种前花蕾 低温预处理能显著提高胡麻花药愈伤诱导率； 在相 同培养基中， 低温预处理天数对愈伤诱导率起主要 作用。 等对 个油用亚麻和 个纤维用亚麻 品种（

10、系） 进行花药培养的研究表明， 在 对供体 材料预处理 的效果最好 ； 而另有研究表明， 亚 麻花药在 下预处理 后转入 下预处理 ，非 常 显 著 地 提 高 了 诱 导 率 （ 最 高 可 达 ） ， 。但也有研究表明， 一些基因型的材料经 低温预处理后， 并未促进愈伤组织的产生； 低温预处 理对不同基因型亚麻花药培养产生的影响不 同 ， ， 这也从另一方面说明了亚麻花药培养的基 因型依赖性。 培养基及附加成分 对于亚麻的花药培养， 大量的研究主要集中于 筛选适宜的培养基。孙洪涛等对亚麻花药培养的 、 、 、 等 多种基本培养基进行了系统 的筛选， 结果表明使用 培养基时亚麻愈伤组织 诱导

11、率最高 ； 进一步对 培养基中的微量元素 锰、 锌、 硼、 钼、 铜、 钴、 碘等的作用进行研究发现， 这 些微量元素对亚麻花药脱分化培养都起着一定作 用， 其中碘在亚麻花药愈伤组织的形成中起的作用 最大， 其次是钼和锌 。宋淑敏等采用双层培养基 提高了亚麻花药愈伤组织的诱导率， 并研究出亚麻 花药培养专用培养基（ ） ， 使亚麻花药愈伤组织的 中国油料作物学报 ， （ ） 诱导率提高到 ， 。 等研究了培养基 组成、 不同浓度激素配比、 不同浓度麦芽糖、 蔗糖、 乳 糖以及渗透压对亚麻愈伤组织诱导的影响， 筛选出 了适合亚麻花药培养的改良 培养基， 首次获得 了加拿大亚麻的再生植株 ， ；

12、在上述研究中加 倍单倍体的再生频率能够满足育种的需要， 但也只 局限于少数几个品系。表 和表 分别列出了在亚 麻花药培养中常用的诱导和分化培养基及植物生长 调节剂配比。 表 亚麻花药培养的脱分化培养基及其结果 基本培养基 植物生长调节剂 （ ） 碳源 诱导率 参考文献 （ ） （ ） 蔗糖 （ ） （ ） 蔗糖 改良 （ ） （ ） （ ） （ ） （ ） 蔗糖 ， （ ） （ ） 蔗糖 改良 （ ） ， （ ） 蔗糖 （ ） （ ） 蔗糖 （ ） （ ） 蔗糖 蔗糖 （ ） （ ） 蔗糖 ， （ ） （ ） ， 注： “ ” 表示不明确。下表同。 ：“ ” ； 表 亚麻花药培养的再生培养基及

13、其结果 基本培养基 植物生长调节剂 （ ） 碳源 结果 参考文献 改良 （ ） （ ） （ ）生根率 （ ）生根率 （ ） （ ）芽分化率 （ ） （ ）生根率 （ ） （ ）芽分化率 （ ） （ ） 蔗糖 芽分化率 （ ） 麦芽糖 生根率 （ ） （ ） 蔗糖 芽分化率 改良 （ ） （ ） 蔗糖 芽分化率 可以看出， 目前常用的基本培养基主要有 、 、 ； 碳源多为蔗糖， 浓度 。各研究小 组在亚麻花药培养中所使用的诱导培养基的激素配 比不同， 而且不同基因型亚麻所使用的蔗糖浓度也 不尽相同， 这表明在对不同基因型亚麻品种进行花 药培养时， 需对其诱导和再生培养基进一步进行评 估和优化。

14、小孢子培养 尽管国内外一些育种者将亚麻的花药培养已经 应用于育种实践中， 并且也获得了一批亚麻花培品 种（ 系） 。然而， 在花药培养中， 一些再生植株实际 上由花药壁通过体细胞胚胎发生途径产生。小孢子 培养则可以避免这个问题的发生。除此之外， 小孢 子培养还有许多花药培养所不具备的优势。如与花 药培养相比， 小孢子主要是通过胚胎发生途径发育 成植株， 避免了愈伤组织阶段， 减少了因孢子体变异 而引起的农艺性状的退化； 另外， 小孢子培养还是研 究胚胎发生和形态发生机理较为理想的途径， 同时 也是遗传工程研究中极具潜力的受体。因此， 近年 来小孢子培养在一些重要的农作物（ 如小麦、 大麦、 油

15、菜） 上研究十分活跃， 无论在生理生化、 分子水平 还是在育种实践中均取得了重要进展。但技术上， 小孢子培养要比花药培养难度大， 加之亚麻是一种 具有花培抗性的作物， 其小孢子培养更为不易。目 前国内还未见到通过亚麻小孢子培养诱导成功的相 关报道， 而国外也仅有少数研究报道。 等对两个油用亚麻的杂交组合 或 材料进行小 孢子培养 ， 结果表明， 小孢子经历愈伤组织或者 胚胎发生阶段， 其中一些愈伤组织成功地分化并最 叶春雷等：亚麻单倍体的研究进展 终产生了再生植株， 但胚状体未能进一步直接发育 成再生植株。这也是国际上第一例报道亚麻小孢子 培养成功的研究。随后， 这个研究小组对小孢子培 养体系

16、进一步优化， 并同时与花药培养进行比较研 究， 结果表明在愈伤组织的形成方面， 花药培养的效 果要明显好于小孢子培养， 但在分化方面， 源于小孢 子培养的愈伤组织则更为有效 。 等人的研 究也曾获得相似的结果 。 子房培养 单倍体既可由雄配子体产生， 也可由未受精的 卵细胞产生。此外， 雌核发育的单倍体也可以由未 受精的卵细胞分裂或者胚囊中其他的单倍体细胞产 生， 如反足细胞或者助细胞。雌核发育单倍体诱导， 一般用于那些未能通过雄核发育途径获得再生植株 或者获得再生植株的数量较少时。因此， 与通过雄 核发育途径（ 花药、 小孢子培养） 诱导形成单倍体相 比， 亚麻子房培养的相关研究甚少， 目前

17、国内外仅有 几篇研究报道。孙洪涛等研究了外源激素对未受精 子房脱分化的影响， 表明未受精子房产生愈伤组织 的最适植物生长素浓度为 ， 而且未受精 子房诱导愈伤组织的频率要高于亚麻花药 。张 举仁通过对亚麻未受精子房进行培养， 成功诱导产 生了单倍体植株， 其研究结果表明， 在花粉第 次减 数分裂时取材诱导频率最高； 诱导亚麻愈伤组织以 培养基效果最好， 分化培养时以 和 作 为基本培养基最为适宜； 在适宜的条件下， 愈伤组织 诱导率可达到 ， 而由子房产生的愈伤组织有单 倍体、 二倍体和混倍体 。 等的研究发现， 预 处理对子房培养中愈伤组织的形成也具有促进作 用， 低温 预处理 或高温 预处

18、理 效果 较好； 同样的培养条件下， 随基因型的不同愈伤组织 诱导率从 不等 。这同时提示亚麻子 房培养和花药或小孢子培养具有相似之处， 存在基 因型依赖等问题。 双胚亚麻 双胚亚麻也是产生单倍体植株另外一种方式， 是指在一粒亚麻种子中有两个能发育成苗的胚， 型双胚起源于受精前卵细胞有丝分裂形成的多 卵卵器， 其二倍体来源于合子， 单倍体来源于未受精 的类卵细胞， 在卵细胞受精的情况下类卵细胞自行 发育成单倍体 。研究表明， 在某些基因型的亚麻 中， 双生胚产生的频率可以高达 以上 ， 等 已经将其中一个较为突出的双胚材 料 用来构建了一个 份材料的分子作图群 体。康庆华统计了 份亚麻杂交后代

19、材料的双胚 频率为 ， 将双胚苗种植后， 在 粒 双胚种子中， 最终只有 粒种子发育成苗， 其中只 有 株为单倍体植株， 对这些单倍体植株进行了染 色体加倍技术的深化研究， 确定了现蕾期用 的秋水仙碱处理 加倍效果较好， 并获得了多份 加倍材料 。 目前国内外对双胚亚麻的研究利用还较少， 如 将双胚亚麻用于育种实践中， 则可将易产生双胚的 基因型材料与其他材料进行杂交， 然后在后代的选 育过程中移除双胚性状。 单倍体植株的鉴定和加倍 如前所述， 单倍体在基础研究和育种中均有重 要用途。然而， 无论是雄核发育和雌核发育途径产 生的再生植株， 除了小孢子培养过程中经小孢子的 分离纯化后进行培养所产

20、生的再生植株外， 如要将 其应用， 一般都需确定其是否是由配子体发育而来 的单倍体， 因为再生植株也可来源于花药壁或子房 的其他组织， 如 等的研究发现， 高达 的再 生植株都是由花药体细胞发育而来 。此外如果 自然加倍的频率较低， 还需要研究加倍的技术体系。 目前亚麻单倍体植株的鉴定一般采用细胞学方 法 ， 生化标记 和分子标记 ， 进行鉴定， 而一 般用低温加倍、 继代培养加倍、 秋水仙素进行加 倍 。一项有趣的研究表明， 在脱分化培养基中， 当蔗糖浓度从 增加到 时， 源于小孢子的单 倍体植株从 提高到 ， 而这些植株的自发加 倍频率则由 提高到了 ， 这可能是由于培养 基中糖含量提高后

21、能够抑制源于体细胞组织的愈伤 组织的形成和分化 。 结语与展望 单倍体技术是目前生物技术应用于育种实践中 最为成功的方法。我国是世界上亚麻种植和生产大 国， 也是世界上最早进行这方面研究的国家。从 世纪 年代中期起， 我国科技人员对亚麻花药培养 过程中的取材时期、 诱导和分化培养基、 培养条件、 加倍等相关方面进行了系统的研究， 使花药愈伤组 织诱导率和再生植株分化率逐步提高， 并于 年 育成亚麻花培新品种双亚 。然而迄今为止， 国内尚未有亚麻小孢子培养的相关研究报道。与其 他作物（ 油菜、 大麦、 小麦、 大白菜等） 相比， 亚麻单 倍体育种技术在实际应用上还相对狭窄。究其原 中国油料作物学

22、报 ， （ ） 因， 一是亚麻花培具有较强的基因型依赖性； 二是与 常规育种相比， 单倍体育种在技术上有一定的难度， 在设备上要求较高， 育种成本偏高， 并且由于技术性 较强， 关键技术相对保密， 技术交流难以进行； 三是 相关专业人员较少（ 国内仅有四五家单位在做） ； 四 是自 年后， 国内对这方面的工作支持力度显著 降低， 许多从事单倍体育种研究的科技人员都转向 其他方面的研究。因此， 今后首先需要扩大花药、 小 孢子或子房培养的所能应用于育种实践的基因型， 进一步提高不同基因型材料的成胚率、 愈伤组织诱 导率、 分化率， 建立高效的培养再生体系， 尤其要重 点研究主要骨干亲本高效的再生

23、体系； 其次要创造 良好的交流合作氛围， 相关领域内的同行之间多进 行交流； 第三是要将单倍体育种、 常规育种以及分子 育种进行有机结合， 扬长避短， 提高育种效率并降低 育种成本； 第四是要进一步研究小孢子胚发生过程 机理的研究， 从而反过来为进一步优化花药和小孢 子培养奠定坚实的理论基础； 第五， 对产生单倍体的 其他方法， 如利用种间或种内杂交等可否应用于亚 麻上进行探索； 最后有关部门应在课题立项方面给 予照顾， 使我国原本较有优势的单倍体育种技术不 至于落后于国外。 参考文献： ， ， ， ， ， ： ， ， ， ， ， ， （ ） ： ， ， ， ： ： ， ， ， ： 孙洪涛亚麻（ ） 花药培养研究初报 科学通报， ， ： 孙洪涛， 付卫东， 吴昌斌， 等 影响亚麻花药培养的某 些因素 植物学通报， ， （ ） ： ， ， ， ： ， ， ， ， （ ） ： 宋淑敏， 孙洪涛， 傅卫东， 等 亚麻花药培养研究的进 展 中国麻作， ， （ ） ： ， ， ， （ ） ， ， ： 宋淑敏 亚麻新品种“ 双亚 号” 的选育 中国麻 业科学， ， （ ） ： ， ， ， （ ） ： ， （ ） ， ， （ ） ： ， ， ， ， ： 孙洪涛， 董丽辉， 付卫东， 等 外源激素对亚麻花药、 花瓣、 未受粉子房去分化培养的作用 中国麻作， （ ） ： ， ，