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1、胞自噬 （Cell autophagy） 是广泛存在于真核细 胞中的一种溶酶体 （酵母、 植物为液泡） 依赖性降 解途径，用于净化自身多余或受损细胞结构和大 分子、 促进生物大分子循环利用1。细胞自噬过程 中， 首先是批量细胞质成分或细胞器被双层膜结构 包围， 形成自噬小体(Autophagosome)， 随后自噬小 体外膜与溶酶体膜融合， 将内膜及包围物质 （自噬 小泡， Autophagic body） 送入溶酶体腔进行消化2。 ATG4 和 ATG8 是两个重要自噬相关基因(Au tophagy-related gene, ATG)。ATG8 蛋白前体的 C 端经具有半胱氨酸蛋白酶活性的
2、 ATG4 酶切后暴 露出保守的甘氨酸残基。此后， ATG8 经一个类泛 素结合系统与脂类物质磷脂酰乙醇胺 （PE）相连 形成 ATG8-PE。ATG8-PE 定位于自噬膜上， 对于 自噬膜的装配、 延伸、 合拢及与液泡的融合过程都 具有重要意义。ATG4 对 ATG8 的酶切加工是 ATG8 进入类泛素连接系统的前提。ATG4 又能从 ATG8-PE 和自噬膜上释放 ATG8， ATG8 从自噬膜 上的释放是促进自噬小体成熟并成为可融合形式 的重要环节。 细胞自噬在进化过程中高度保守。 植物 上， 拟南芥基因组分析发现了 36 个 ATG 基因3， 烟 草4、 水稻5、 玉米6、 大豆7和小
3、麦8等作物上 ATG 基因的鉴定和分析也相继被报道。拟南芥上的研 究表明， ATG4 和 ATG8 在植物细胞自噬中同样扮 演了与酵母类似的重要角色9-10。 细胞自噬与植物生长、 发育及响应多种生物、 非生物胁迫， 包括营养缺乏、 氧胁迫、 盐胁迫、 干 旱胁迫和病原侵染等的反应过程密切相关11。到 收稿日期：2014-03-12；修订日期：2014-03-27 基金项目：天津市自然科学基金 （12JCZDJC23000） ； 霍英东教育基金会高等院校青年教师基金 （131026） 作者简介：张微 （1989） ， 女， 吉林人， 在读硕士生， 主要从事植物遗传学研究。 通讯作者简介：王华忠
4、 （1976） ， 男， 天津人， 副教授， 博士， 主要从事遗传学研究。 植物生理与生物技术 小麦自噬相关基因 ATG4 和 ATG8 的原核表达及蛋白纯化 张 微， 孙 红， 裴 丹， 王华忠 （天津师范大学 生命科学学院 天津市动植物抗性重点实验室， 天津 300387） 摘要：细胞自噬与植物生长、发育和逆境响应等过程密切相关。本研究构建了小麦重要自噬相关基因 TaATG4a 和 TaATG8h 的原核表达载体并导入大肠杆菌。 I P T G诱导表达后的蛋白质 S D S - P A G E电泳结果表明， 两个基因在大肠杆菌中 均能够高效表达， 表达重组蛋白的分子量与预测分子量基本一致。
5、利用 N i 柱亲和层析方法进一步获得了纯度较高的重 组蛋白， 为今后的体外酶活分析、 抗体制备和 We s t e r n杂交等研究奠定了基础。 关键词： 细胞自噬； 小麦； A T G 4 ； A T G 8 ； 原核表达 中图分类号： S512.1文献标识码：ADOI编码：10.3969/j.issn.10066500.2014.05.004 Prokaryotic Expression and Protein Purification of Wheat ATG4 and ATG8 Genes ZHANG Wei, SUN Hong, PEI Dan, WANG Hua-zhong (T
6、ianjin Key Laboratory of Animals and Plants Resistance, School of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China) Abstract：Autophagy is closely related to the growth, development and stress responses of plant. In this study, prokaryotic expres- sion vectors for wheat important autop
7、hagy-related gene TaATG4a and TaATG8h were constructed and transformed into E. coli. The results from SDS-PAGE showed that each gene could express efficiently in E. coli through IPTG induction. The molecular weight of each expressed recombinant protein was consistent with its predicted molecular wei
8、ght. Recombinant proteins were further purified by the Ni-column affinity chromatography method. The obtaining of purified recombinant proteins laid a foundation for the future studies of in vitro enzyme activity, antibody preparation and western blot analysis. Key words: autophagy; wheat; ATG4; ATG
9、8; prokaryotic expression 2014，20（5）：19-22天津农业科学 Tianjin Agricultural Sciences 天津农业科学第 20 卷 目前为止，有关细胞自噬的分子机理和生理功能 研究仍然仅限于拟南芥等模式物种上，在重要农 作物尤其是小麦上的报道很少。本研究在前期成 功克隆多个小麦重要 ATG 基因的基础上， 构建了 ATG4 和 ATG8 基因的原核表达载体， 经大肠杆菌 诱导表达和重组蛋白纯化过程获得了小麦ATG4和 ATG8 的纯化重组蛋白，可为下一步体外酶活测 定、 抗体的制备和 Western 杂交等试验奠定基础。 1材料和方法 1.1
10、基因和载体 小麦自噬相关基因 TaATG4a 和 TaATG8h 由 本实验室 （天津市动植物抗性重点实验室） 克隆。 两个基因全长 cDNA 分别克隆于 pGEM-Teasy 载 体上。原核表达载体 pET30a 由本实验室保存。 1.2原核表达载体的构建 设计合成两端添加 Not识别位点的 PCR 引 物 对 4aNOTI -F (ATAAGAATGCGGCCGCATGAC GAGCTTGCCTGAGAG)/4aNOTI-R (ATAAGAATGCG GC CGCTCAGAGAATCTGCCACTCAT) 和 8hNOTI-F （ ATAAGAATGCGGCCGCATGAAGTCCTTCA
11、AGAAG GA ） /8hNOTI-R(ATAAGAATGCGGCCGCTCACCCAA ATGTCTTCTCGC)， 使用 pfu DNA 聚合酶从 pGEM- Teasy 载体上分别扩增 TaATG4a 和 TaATG8h 基因 的全长 ORF。扩增产物 Not-Not片段经酶切、 连接过程克隆到原核表达载体 pET30a 的 Not 位点处，测序鉴定正确插入方向 （起始密码子 ATG 紧邻 T7 启动子） 的重组表达载体 pET- ATG4a 和 pET-ATG8h。采用热激法将表达载体导 入到大肠杆菌 BL21 （DE3） 中。 1.3原核表达 接种含重组载体质粒的大肠杆菌 BL21
12、 （DE3） 到 LBK 液体培养基中（含 50 mg L-1卡那霉素） ， 37 振荡培养过夜。按 1%的比例扩大到 5 mL LBK 液体培养基中 （卡那霉素 50 mg L-1） ， 37 振 荡培养至 OD600达到 0.60.8。加入终浓度为 1 mmol L-1的 IPTG， 于 28 条件下震荡培养诱导目 标基因的表达。分别于诱导后 0， 2， 4， 6， 8 h 取 1 mL 菌液用于总蛋白的 SDS-PAGE 电泳分析。 1.4SDS-PAGE 电泳 将 1 mL 菌液 10 000 r min-1离心 10 min， 弃 上清后加入 80 L 的 ddH2O 重悬沉淀， 再
13、加入 20 L 电泳上样缓冲液(5X)并混匀， 沸水浴 10 min。 12 000 r min-1离心 5 min，取上清用 SDS-PAGE 凝胶电泳 （13%分离胶， 4%浓缩胶） 分离蛋白。电 泳后用考马斯亮蓝 （R-250） 染色液染色 1 h， 脱色 液脱色至背景无色后观察并拍照。 1.5重组蛋白的纯化 重组蛋白为 N 端含组氨酸标签 His(6)的 His (6)-TaATG4a 或 His (6)-TaATG8h，因此使用 Ni- Agarose His 标签蛋白纯化试剂盒（康为世纪） ， 在 非变性条件下经 Ni 柱亲和层析过程纯化重组蛋 白。 层析柱的平衡、 菌体的超声波破
14、碎和可溶性蛋 白的上样及杂蛋白的清洗等过程参照试剂盒手册 进行。分别使用 5 mL 含 50， 100， 200， 300 和 500 mmol L-1咪唑的洗脱液分段洗脱目标蛋白。收集 各阶段的洗脱液进行 SDS-PAGE （13%分离胶， 4%浓缩胶）电泳和考马斯亮蓝 （R-250）染色、 脱 色分析。纯化的蛋白质溶液 （洗脱液） -80 冰箱 保存。 2结果与分析 2.1小麦 TaATG4a 和 TaATG8h 的原核表达 构建了小麦 TaATG4a 和 TaATG8h 基因的原 核表达载体。将表达载体 pET-ATG4a 和 pET- ATG8h 分别转化到大肠杆菌 BL21 （DE3
15、） 菌株中。 如图 1 和 2 所示， 未经 IPTG 诱导的大肠杆菌总蛋 白中目标蛋白表达微弱。而经 IPTG 诱导， 两个载 体均正确表达出了重组蛋白 His (6)-TaATG4a 和 His(6)-TaATG8h， 实际分子量与理论分子量 （His (6)-TaATG4a： 59.25 kDa； His (6)-TaATG8h： 20.22 kDa） 基本一致。 28 培养条件下， His(6)-TaATG4a 图1小麦TaATG4a基因的原核表达 M：分子量标准（kDa）；15：分别诱导0，2，4，6，8 h的总蛋 白；箭头表示诱导表达的His(6)-TaATG4a重组蛋白条带。 2
16、0 第 5 期 的表达量在诱导后 08 h 时间段内随诱导时间的 延长逐渐增加 （图 1） ， 而 His(6)-TaATG8h 在诱导 后 2 h 即可实现高效表达 （图 2） ， 且其表达量并 未随着时间的增加而有明显的变化。电泳上样样 品为大肠杆煮沸液的上清部分，表明两个重组蛋 白在可溶性部分中的表达量足够高，满足纯化要 求，这为后续非变性条件纯化过程的选择提供了 依据。 2.2小麦 TaATG4a 和 TaATG8h 重组蛋白的纯化 鉴于目标蛋白 N 端融合了 His （6）组氨酸标 签， 采用 Ni 柱亲和层析方法纯化总可溶性蛋白中 的目标蛋白。 如图 3 和 4 所示， 流穿液中目
17、的蛋白 较少。 经由不同浓度咪唑洗脱液的洗脱， 杂蛋白含 量逐渐减少， 目标蛋白的相对含量逐渐增加。 两个 目 标 重 组 蛋 白 His (6) -TaATG4a 和 His (6) - TaATG8h 的 500 mmol L-1咪唑洗脱液的纯度较 高， 满足抗体的制备要求。 但洗脱液中目标蛋白的 含量较低， 因此如果后续免疫工作中抗原量不足， 可以选择其他杂蛋白含量较低的咪唑浓度洗脱液 进行切胶后回收目标条带免疫或碎胶直接免疫的 方法。 3结论与讨论 自噬是一种普遍的蛋白质降解途径，在植物 新陈代谢和生长中扮演了重要角色，这些过程包 括种子的发育、液泡的增大、饥饿条件下氮的循 环、 衰老
18、、 细胞凋亡和植物在生物、 非生物胁迫下 的响应11， 所以从包括 ATG4 和 ATG8 在内的重要 ATG 基因入手， 对自噬分子机制开展深入研究具 有重要的生物学意义。 本研究采用 pET30a 大肠杆菌表达系统进行 原核表达，该原核表达系统带有 T7 噬菌体启动 子， 能够将多聚组氨酸标签融合入目的蛋白， 此方 法的优点有易于纯化、 操作方便和表达量大等12。 在 pET30a 表达载体上的 T7 启动子能够与大肠杆 菌 BL21 （DE3） 中噬菌体编码的 T7 RNA 聚合酶特 异性的结合， 然后启动 T7 启动子下游的目标基因 的表达。T7 RNA 聚合酶的活性很高， 它的转录合
19、 成 RNA 的速度比大肠杆菌 RNA 聚合酶快很多， 并且不经常有终止转录的现象发生13。本研究中 通过原核表达载体构建、 IPTG 诱导表达和基于组 氨酸标签的 Ni 柱亲和层析过程获得了纯化的 TaATG4a 和 TaATG8h 重组蛋白。重组蛋白的获得 图2小麦TaATG8h基因的原核表达 15：分别诱导0，2，4，6，8h的总蛋白；M：分子量标准（kDa）；箭 头表示诱导表达的His(6)-TaATG8h重组蛋白条带。 图3 His(6)-TaATG4a重组蛋白的纯化 M：分子量标准（kDa）；1：未诱导对照；2：诱导7 h的煮沸液；38 为His(6)-TaATG4a蛋白的Ni柱亲
20、和层析过程收集液；3：流穿 液 ；45：300 mmolL-1咪 唑 洗 脱 第1、2管 收 集 液 ；68：500 mmolL-1咪唑洗脱第1、2、3管收集液。箭头表示目标蛋白条带。 图4His(6)-TaATG8h重组蛋白的纯化 M：分子量标准（kDa）；1：未诱导对照；2：诱导6 h的煮沸 液；39为His (6)-TaATG8h蛋白的Ni柱亲和层析过程 收集液；3： 流穿液；45：100 mmolL-1咪唑洗脱第1、2 管 收 集 液 ；67：300 mmolL-1咪 唑 洗 脱 第1、2管 收 集 液；89：500 mmolL-1咪唑洗脱第1、2管收集液。 箭头 表示目标蛋白条带。
21、张 微等： 小麦自噬相关基因 ATG4 和 ATG8 的原核表达及蛋白纯化 21 天津农业科学第 20 卷 为今后抗体制备和通过免疫学方法深入研究 TaATG4a 和 TaATG8h 基因在小麦自噬过程中的 功能奠定了基础。 重组蛋白以可溶性形式存在， 这 使后续的蛋白纯化过程可以在无变性剂的相对温 和条件下进行，纯化后的蛋白可以最大限度地保 持其空间构象与功能，便于以后的体外酶活分析 研究。 参考文献： 1 Liu Y, Bassham D C. Autophagy: pathways for self-eating in plant cellsJ. Annual Review of Pla
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