番茄抗TYLCV+基因新标记的开发及其在多抗聚合选择中的应用.pdf

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1、番茄抗 TYLCV 基因新标记的开发及其在 多抗聚合选择中的应用 胡 霞 王 蓉 李菲菲 周 涛 杨文才 * （中国农业大学农学与生物技术学院，北京100193） 摘 要：根据已经克隆的番茄黄化曲叶病毒病（TYLCV）抗性基因 Ty-1/Ty-3 和与基因 Ty-4 紧密连锁的分子标记在抗感材料 中的序列差异，开发出简单可靠的 InDel 标记，建立了多重 PCR 体系。采用分子标记辅助选择将 TYLCV、斑点病、疮痂病 和溃疡病中一个病害的多个抗性基因或不同病害的抗性基因聚合到一个材料中，培育出育种中间材料。 关键词：番茄；番茄黄化曲叶病毒病（TYLCV） ；疮痂病；斑点病；溃疡病；标记辅助

2、聚合 种方法难以在田间进行抗单一病害材料的筛选，分 子标记辅助选择为解决这一难题提供了可能。Sun 等（2011）根据番茄斑点病抗性基因 Pto 位点在抗 感病材料中的序列差异建立的 InDel 标记和 Pei 等 （2012）利用番茄疮痂病抗性基因 Rx4 位点在抗 感材料中的序列差异建立的 InDel 标记都是功能基 因分子标记，能够对抗病个体进行准确的选择。而 对于尚未克隆的抗性基因，则可选择与基因最紧 密连锁的标记，以提高选择的准确性，如 Yang 和 Francis（2005）利用与番茄疮痂病抗性位点 Rx3 紧 密连锁的标记成功地将 Rx3 和 Pto 两个基因聚合到 同一材料中，

3、育成抗番茄斑点病和疮痂病的材料。 从 1994 年至今，人们已经开发了与 5 个抗 TYLCV 基因 Ty-1Ty-5 紧密连锁的可用于抗性基因选择的 分子标记（杨晓慧等，2012） ，但这些标记在实际 应用中都存在一些问题，如检测太复杂、稳定性和 可靠性不高等。番茄基因组的出现以及抗 TYLCV 基因 Ty-1/Ty-3 的克隆，为开发稳定可靠且检测简 单易行的标记提供了可能。因此，本试验的目的是 开发可用于准确选择Ty-1/Ty-3和Ty-4的分子标记， 并将抗病毒病基因与抗细菌病害基因聚合，培育抗 多个病害的育种材料。 1 材料与方法 1.1 试验材料 本试验用于标记辅助选择的番茄（So

4、lanum 胡霞，女，硕士，专业方向： 蔬菜遗传育种，E-mail：953808244 * 通讯作者（Correspondingauthor） ： 杨文才， 男， 博士， 教授， 专业方向： 蔬菜分子育种，E-mail： 收稿日期：2014-06-20； 接受日期：2014-08-12 基金项目：国家“863”计划（2012AA100103） ，北京市果类蔬菜产业 技术体系 自 20 世纪 90 年代我国发现番茄黄化曲叶病 毒病（TYLCV）以来，该病害已遍布我国番茄主产 区，严重威胁我国的番茄生产（叶青静等，2009； 李小靖和叶志彪，2010；李常保等，2012；吴篆 芳等，2013）

5、。尽管利用杀虫剂等方法能在一定程 度上控制该病毒传播者烟粉虱的数量，但是 经常施用杀虫剂会使烟粉虱产生抗药性（Horowitz etal ，2007） ，也会造成严重的环境污染（Palumbo etal ，2001） 。采用细孔网或者紫外吸收塑料膜遮 盖等物理方法（CohenAntignus，1994）起到了 一定的防治效果，然而这些物理防治方法不能保证 正常的光照，还会形成高温高湿的环境，影响番茄 植株的正常生长。利用植物自身的抗性基因是防治 TYLCV 最有效的方法（Morales，2001；Lapidot Friedmann，2002） 。 番茄在生长发育过程中除受到多种病毒侵染 外，还

6、会同时受到诸如斑点病、疮痂病和溃疡病等 细菌性病害的危害，培育抗多种病害的品种一直是 番茄育种的目标（杜永臣等，1999） 。采用常规育 2014（10） ：18-23 1818 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 201410（140918-0925连页.indd 182014-9-25 21:41:52 中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g lycopersicum L.）亲本有 10 个，OH9242 和里格尔 87-5 分别是美国和我国广泛种植的两个加工番茄 品种，但缺少抗 TYLCV 的基因；IBL2361 和 ZN17 是两个育

7、种中间材料；另有 6 份材料分别作为不同 病害抗性基因的供体（表 1） 。将这些材料配制一 些杂交组合， 加代得到F2群体， 供标记辅助选择用。 2013 年 6 月 28 日将 F2种子播种于 288 孔育 苗盘中，育苗基质为 2V 草炭1V 蛭石。从幼苗上 取幼嫩叶片提取 DNA 供标记辅助选择使用。2013 年 8 月 9 日，将选出的与抗病亲本带型相同的 F2 单株定植到中国农业大学上庄实验站日光温室， 收获 F2：3种子。将 F2：3种子用 4% 次氯酸钠消毒 5 min， 并用去离子水漂洗 34 次， 干燥后保存备用。 2014 年 1 月 23 日播种 F2：3种子。待幼苗长出

8、23 片真叶时，取幼嫩叶片提取 DNA，供标记选择和 验证使用。挑选抗性基因位点纯合的单株于 2014 年 3 月 5 日移栽到中国农业大学科学园温室，进行 抗性鉴定。 1.2 抗 TYLCV 新标记设计 为了获得稳定可靠的分子标记，本试验根据已 经克隆的 Ty-1 和 Ty-3 基因（Verlannetal.，2013） 位点在抗感品种中的序列差异设计引物，获得了 功能基因分子标记 Ty1-3。该标记是一个 InDel 标 记，从抗病材料中扩增到的片段大小为 209bp，从 感病材料中扩增到的片段大小为 197bp。同时根据 Ji等（2009）报道的 Ty-4 在染色体上的位置，选择 与其最

9、紧密连锁的标记 C2_At4g173000，从抗感材 料中进行 PCR 扩增和序列分析，发现在抗感材料 中序列长度不同，据此设计了 InDel 标记，命名为 CAUTy4。该标记从抗病材料中扩增到的片段大小 为 219bp，从感病材料中扩增到的片段大小为 214 bp。原来的 C2_At4g173000 是一个 CAPs 标记（Ji etal.，2009） ，需要经过 PCR、酶切、电泳等过程 进行基因型检测，新设计的两个 InDel 标记都只需 要 PCR 和凝胶电泳即可完成基因型检测。 1.3 标记辅助选择策略 采用碱裂解法（YangFrancis，2005）提取 番茄植株基因组 DNA。

10、鉴于有些杂交组合涉及到 选择 3 个或 3 个以上抗性基因，为了减少工作量， 本试验首先用一个功能基因标记对相应 F2群体的 所有植株进行筛选，只有携带纯合抗性基因位点的 植株才被用于筛选第 2 个基因，依此类推。由于有 些群体单株数不够多，没有能够获得所有基因位点 都纯合的个体，因此保留了部分基因位点杂合的单 株供 F2：3继续选择。 番茄疮痂病 T1 小种抗性位点 Rx3 的标记检测 表 1 所用抗病亲本及标记信息 材料名称所抗病害抗性基因分子标记引物序列（5 -3 ）参考文献 FG02-7530番茄斑点病PtoPto5b正向：ATCTACCCACAATGAGCATGAGCTGSuneta

11、l.，2011 反向：GTGCATACTCCAGTTTCCAC 番茄疮痂病菌 T1 小种 Rx3Rx3-L1正向：CTCCGAGCGAAGAGTCTAGAGTC YangFrancis，2005 反向：GAAGGCAAAAGGAAAAGGAGAAGGATGG IBL2353番茄溃疡病Cmm2.0TG620正向：CTCTGTGCCAGAGCTCGAACoaker Francis，2004 反向：TTTTACCTGGCGGAGAACTG LA3473番茄黄化曲叶病毒病Ty-1Ty1-3正向：GGGTGATCCGTTGATTGAAG本试验 反向：TCTTCTTGATAGGACGACGTGA Fla.

12、726番茄黄化曲叶病毒病Ty-3Ty1-3正向：GGGTGATCCGTTGATTGAAG本试验 反向：TCTTCTTGATAGGACGACGTGA Ty-4CAUTy4正向：GGGCAACTCAATGGTGAAAC本试验 反向：TCTGAATGTAGGGCCAAAGG WGH12-3032番茄斑点病PtoPto5b正向：ATCTACCCACAATGAGCATGAGCTGSunetal.，2011 反向：GTGCATACTCCAGTTTCCAC 番茄疮痂病菌 T3 小种 Rx4pcc12正向：TCCACATCAAATGCGTTTCT Peietal.，2012 反向：TTCCAATCCTTTCC

13、ATTTCG Gc171番茄黄化曲叶病毒病Ty-3Ty1-3正向：GGGTGATCCGTTGATTGAAG本试验 反向：TCTTCTTGATAGGACGACGTGA Ty-4CAUTy4正向：GGGCAACTCAATGGTGAAAC本试验 反向：TCTGAATGTAGGGCCAAAGG 1919 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 201410（140918-0925连页.indd 192014-9-25 21:41:53 中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g 图 1 普通 PCR 和多重 PCR 的电泳对比 M 1 2 3 4 5 6 7

14、 8 9 10 11 12 Ty1-3 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 CAUTy4 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Ty1-3+CAUTy4 Ty4Ty4 ty4ty4 Ty1-3Ty1-3 ty1-3ty1-3 参考 Yang 和 Francis（2005）的方法，番茄疮痂病 T3 小种抗性位点 Rx4 的功能基因标记检测参考 Pei 等（2012）的方法，番茄斑点病抗性基因 Pto 的功 能基因标记检测参考 Sun 等（2011）的方法，番茄 溃疡病抗性位点 Cmm2.0 的标记检测参考 Coaker 和 Francis（2004）的方法，抗

15、TYLCV 基因 Ty-1/Ty-3 和Ty-4 的检测采用如下方法。 PCR 反 应 体 系 为 10L， 包 括 2L （约10 ng）DNA 模 板、3.4LTaq102MasterMix（ 北 京奥赛博科技发展有限公司生产） 、0.3L10 molL-1正向引物、0.3L10molL-1反向 引物和 4LddH2O。PCR 反应条件为：94变性 5min，38 个循环的 94变性 45s、55退火 45s 和 72延伸 45s，最后一步反应在 72下保持 5 min。PCR 产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳和硝酸银染 色显带后，记录每个单株的基因型。 1.4 抗 TYLCV 鉴定 从 F2中选

16、出的单株定植到中国农业大学上庄 实验站日光温室后自然发病，观察并记载发病情 况。F23家系采用人工注射接种在日光温室内进 行抗性鉴定，病毒所属株系来自上海的 TYLCV- SH2，接种后 28d 和 42d 各调查一次。病害分级参 考 Friedmann等（1998）的方法进行：0 级接种 和没接种的植株一样，没有感病症状，能够正常 生长；1 级顶端叶片（叶边缘）出现轻微泛黄； 2 级叶片末端有些泛黄和轻微卷曲；3 级大面 积叶片变黄，影响更为严重，新叶面积减少，但植 株可以继续生长；4 级植物生长发育受到严重影 响，叶片基本变黄，甚至变紫，杯状卷曲，停止生 长。将 02 级划分为抗病， 34

17、 级划分为感病（Ji etal.，2009） 。 由于少数入选的 F2：3家系群体较小，因此将 来自于同一个 F2群体的不同 F2：3家系算作一个群 体， 按 100 （各级病株数 各级代表值）/（调 查总株数 最高级代表值）进行病情指数计算。 2 结果与分析 2.1 抗 TYLCV 基因新标记的可靠性分析 为了检验新设计的用于选择抗 TYLCV 基因标 记的可靠性，本试验用 Ty1-3 和 CAUTy4 这两个标 记分析了 10 份携带 Ty-1、Ty-3、Ty-4 中 1 个或多个 基因的番茄材料和 1 份新的抗病材料 LA1589 的基 因型， 以感病品种 OH88119 作为对照。结果

18、显示， 两对引物扩增得到的基因型与材料所携带的已知抗 性基因完全一致（表 2、图 1） ，表明用这两个标记 来检测各自的基因型是准确可靠的。同时也发现， 新的抗性材料 LA1589 不含有 Ty-1、Ty-3 和 Ty-4 基 因中的任何一个。 表 2 12 份番茄材料经标记 Ty1-3 和 CAUTy4 检测的基因 型及其携带的抗性基因 编号材料携带基因 标记检测结果 Ty1-3CAUTy4 1LA3473Ty-1+- 23025-4Ty-1，Ty-3+- 3Fla.726Ty-1，Ty-3，Ty-4+ 4284-1Ty-1，Ty-3+- 5HX22-5Ty-1，Ty-3+- 6HX22-1

19、7Ty-1，Ty-3+- 7HX16-62Ty-4-+ 8HX16-76Ty-4-+ 9HX01-1Ty-1+- 10HX22-29Ty-1，Ty-3，Ty-4+ 11LA1589未知- 12OH88119无- 注： “+”代表有该基因位点， “-”代表没有该基因位点。 2.2 标记 Ty1-3 和 CAUTy4 的多重 PCR 体系建立 为了提高检测效率，本试验尝试构建 Ty1-3 和 CAUTy4 这两个标记的多重 PCR 体系，在 PCR 体 系中同时加入两个标记的引物，对上述 12 份材料 的基因组 DNA 进行 PCR 扩增。结果显示（图 1） ， 两对引物单独使用时都能从 12 份

20、材料中扩增出清 晰的条带，同时使用两对引物扩增时，两对引物的 PCR 产物条带依然清晰，表明这两个标记可以用多 重 PCR 进行检测。 2020 研究论文 中国蔬菜CHINA VEGETABLES 201410（140918-0925连页.indd 202014-9-25 21:41:54 中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g 图 2 FG 02-7530Gc 171 组合入选植株和不带抗 TYLCV 基因的植株自然发病情况 ：FG02-7530Gc171 组合入选植株；：不带抗 TYLCV 基因的植株。 2.3 不同抗性基因的聚合选择和抗 TYLCV 的鉴 定结

21、果 采用功能基因标记 Ty1-3 对 8 个杂交组合（表 3）的 F1进行 PCR 扩增，所有 F1植株都带有各自 亲本的条带， 为杂合型， 表明所有单株都是真杂种， 为获得用于标记辅助选择的 F2群体提供了保障。 根据不同杂交组合所选择基因的需要，确定了 每个 F2群体的播种种子数，但由于出苗等原因， 有些群体没有足够的苗供筛选所有抗性基因位点都 纯合的个体，因此在实际筛选时保留少量杂合的基 因型，8 个组合共获得了 57 个单株（表 3） 。 将这 57 个单株于 2013 年 8 月 9 日定植到日光 温室里，植株在生长过程中受到了烟粉虱为害，植 株自然发生 TYLCV 病害。调查显示，

22、所有单株的 TYLCV 病级都在 02 之间， 表现出了较好的抗性， 并能正常开花坐果，特别是从 FG02-7530Gc171 组合中选出的 4 个单株，植株生长健壮，没有任何 发病症状（图 2-） 。而同时种植在该日光温室里 的不带抗性基因的材料则表现出 TYLCV 的典型症 状，叶片向上卷曲，叶片黄化，植株矮小，生长极 其缓慢，不能开花坐果（图 2-B） 。 表 3 各组合标记选择获得植株数和抗性鉴定结果 杂交组合抗性基因 F2F2：3 总株数入选株数抗病株数家系数株数病情指数 LA3473WGH12-3032Ty-1、Rx4、Pto12014143670 LA3473IBL2361Ty-

23、145121231200.6 LA3473ZN17Ty-1327721000 OH9242Fla.726Ty-1/Ty-3、Ty-45912125360.7 里格尔 87-5Gc171Ty-1/Ty-3、Ty-4281114115.9 里格尔 87-5Gc171Ty-1/Ty-3281116024.2 IBL2361LA3473Ty-19111380.7 IBL2353LA3473Ty-1、Cmm2.019551610.4 FG02-7530Gc171Ty-1/Ty-3、Ty-4、Pto、Rx393444590.8 对从 F2群体中选出的部分一个位点纯合而另 外位点杂合的单株 F2：3家系进行

24、了标记辅助选择， 连同从 F2中选出的纯合单株，共得到 21 个 F2：3家 系582个单株， 包括4个携带5个抗性基因的家系、 9 个携带 3 个抗性基因的家系、2 个携带 2 个抗性 基因的家系和6个携带1个抗性基因的家系 （表3） 。 由于接种 TYLCV 后的两次调查结果基本一 致，因此这里只用了接种 42d 后的病级及病情指 数。接种 42d 后， 所有单株的病级都在 02 之间， 其中0级的占88.0%， 1级的占8.2%， 2级的占3.8%。 表明采用标记选出的所有单株对所用的病毒株系都 具有抗性。 从里格尔 87-5Gc171 组合中选出两种类 型的家系，一种只带 Ty-1/T

25、y-3 基因，另一种携带 Ty-1/Ty-3 和 Ty-4 基因。前者共有 60 个单株，其中 22 个为 0 级，18 个为 1 级，20 个为 2 级，病情指 数为 24.2。后者共 41 个单株，包括 16 个 0 级，24 个 1 级和 1 个 2 级，病情指数为 15.9，而且这两个 家系的病情指数都明显高于其他家系（表 3） 。 3 结论与讨论 用于聚合育种的分子标记必须具有检测的可靠 性和操作的简单性，这样才能快速准确地选到目标 基因。根据已经克隆的基因在功能区域的序列差异 设计标记，是获得较为可靠的功能基因分子标记的 途径之一。已有的抗 TYLCV 基因定位研究表明， 抗性基因

26、 Ty-1 和 Ty-3 都位于 6 号染色体上（Zamir etal ，1994；Jietal ，2007） ，进一步的研究指出， Ty-1 和 Ty-3 为等位基因（Verlaanetal.，2013） 。本 2121 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 201410（140918-0925连页.indd 212014-9-25 21:41:54 中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g 试验依据已经克隆的 TYLCV 基因 Ty-1 和 Ty-3 与 感病材料中对应基因的序列差异设计引物，建立 了功能基因分子标记 Ty1-3。用该标记对

27、Zamir 等 （1994）报道的携带 Ty-1 基因的材料 LA3473 进行 基因型分析，结果显示其条带与携带 Ty-3 材料的 条带一致，也验证了 Ty-1 和 Ty-3 是等位基因。由 这个标记选择的单株都具有很好的抗病性，表明该 标记的确为功能基因分子标记，可用于对这两个基 因的选择。而 Ji等（2009）报道的与 Ty-4 基因紧 密连锁的标记是 CAPs 标记，需要经过 PCR、酶切 等相对复杂的过程，本试验中根据该标记在抗感材 料中的序列差异设计成 InDel 标记，只需要 PCR 即 可，简化了检测过程。用两个新设计的标记筛选相 应的基因，所得到的植株都表现出很好的抗性，表

28、明这两个新标记是可靠的。 利用不同的材料将不同的抗性基因聚合到同一 个材料中，能够增加番茄材料抗病毒生理小种的范 围，大大提高植株对病害的抗性，使其抗性更加稳 定 持 久（Banerjee&Kallo，1987；Vidavskietal.， 2008） 。Mej a 等（2005）利用不同的番茄材料在危 地马拉进行抗病性评估，含有纯合 Ty-2 基因型的 材料在当地表现为感病，含有 Ty-2 和 Ty-3a 杂合基 因型的材料表现抗病。另外，含有杂合基因型 Ty-2 和 Ty-3a 的材料比只含 Ty-3 纯合基因型的材料表 现出更高的抗性水平。在本试验中，无论是只含 有 Ty-1，或者 Ty

29、-1 和 Ty-3，还是同时含有 Ty-1、 Ty-3 和 Ty-4 的材料，对所用的病毒菌株都具有较 好的抗性。但在不同的遗传背景下抗性略有差异， 当以 FG02-7530、IBL2353、IBL2361、OH9242、 ZN17、WGH12-3032 等为受体材料时，所得到的 植株都表现出很强的抗性，而以里格尔 87-5 为受 体时，后代中无论是携带 Ty-1/Ty-3 基因还是同时 携带 Ty-1/Ty-3 和 Ty-4 基因的植株，其抗性都比其 他材料的略差，不过同时携带 Ty-1/Ty-3 和 Ty-4 基 因的植株抗性要好于只携带Ty-1/Ty-3基因的植株。 这些结果表明，遗传背

30、景对抗性基因的表达可能有 一定的影响。 群体大小是影响多基因聚合育种效率的因素之 一，聚合效率随着群体中个体数的增加而加大，如 果基础群体太小，就有可能得不到所需要的纯合基 因型个体。本试验根据每个 F2群体所聚合的基因 数目确定的播种量播种， 但由于种子发芽率偏低 （种 子收获于 2012 年 12 月） ，因此 8 个 F2群体中有 6 个没有达到预期的供选植株数，导致从群体中选 择所有基因位点都纯合的单株数偏少，在 5 个聚合 25 个基因的 F2群体中只有 2.7% 的单株在所有基 因位点都表现为纯合型。为了获得更多在所有位点 都纯合的单株，在实际选择时保留了一些杂合基因 型个体供 F

31、2：3进一步选择，这样做虽然最终获得 了所有位点都纯合的基因型个体，但增加了世代数 和选择成本，降低了聚合效率。因此，在进行聚合 育种时，可先检测种子的发芽率，然后结合聚合的 基因数确定播种量，以便充分发挥分子标记聚合育 种的优势。 本试验所用的番茄材料涉及到斑点病、疮痂 病、溃疡病和 TYLCV，但仅对所选到的植株进行 了抗 TYLCV 的鉴定。原因在于选择番茄斑点病抗 性基因 Pto 和疮痂病抗性基因 Rx4 用的是功能基因 分子标记，这两个基因的功能分子标记已经被证 实可直接用于抗性基因的选择（Yang&Francis， 2005；Peietal.，2012） 。疮痂病抗性位点 Rx3

32、和 溃疡病抗性位点 Cmm2.0 是两个尚未被克隆的 QTL，但是已有的研究表明，利用与 Rx3 位点紧密 连锁的标记可准确选择到携带该位点的抗性单株 （Yang&Francis，2005；张晓敏等，2009） ，而利 用与 Cmm2.0 紧密连锁的标记也可准确获得抗溃 疡病的单株（Coaker&Francis，2004） 。鉴于本试 验所用的抗性材料和分子标记与文献中（Coaker& Francis，2004；Yang&Francis，2005；张晓敏等， 2009；Peietal.，2012）的相同，因此推测本试验 所选的携带抗性基因的材料即为抗病材料。 综上所述，本试验开发了抗 TYLC

33、V 基因 Ty-1/ Ty-3 和 Ty-4 的新标记，并建立了多重 PCR 体系。 通过杂交结合标记辅助选择，将抗 TYLCV、斑点 病、疮痂病、溃疡病等的基因分别聚合，获得了 7 份兼抗斑点病、TYLCV 和疮痂病的材料，6 份携带 多个 TYLCV 基因（Ty-1/Ty-3 和 Ty-4）的材料，以 及 1 份兼抗 TYLCV 和溃疡病的材料，为番茄抗多 个病害分子标记聚合育种提供了材料。 参考文献 杜永臣，严准，王孝宣，李树德，朱德蔚1999番茄育种研究主 2222 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 201410（140918-0925连页.indd 2220

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45、sistant Gene Pyramiding HUXia，WANGRong，LIFei-fei，ZHOUTao，YANGWen-cai* （CollegeofAgronomyandBiotechnology，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China） Abstract：NewmolecularmarkersforTYLCVresistancegenesweredevelopedbycomparingthesequence variationofallelesoftheclonedgenesTy-1/Ty-3fromresistantand

46、susceptiblelinesorbycomparingsequence variationfrommarkerstightlylinkedtotheresistantgeneTy-4.ThenewlydevelopedInDelmarkerswerereliable andeasytouse.TheycouldalsobemultiplexedinPCR.Molecularmarkerswereusedtopyramidgenesfor resistancetoTYLCV，bacterialspeck，bacterialspot，andbacterialcanker.Breedinglin

47、eswithresistanceto singlediseaseconferredbymultiplegenesortomultiplediseasesweredeveloped. Key words：Tomato； TYLCV； Bacterialspot； Bacterialspeck； Bacterialcanker； Marker-assistedpyramiding 2323 研究论文 中 国 蔬 菜 CHINA VEGETABLES 201410（140918-0925连页.indd 232014-9-25 21:41:55 中国蔬菜学术论文下载 www. c n v e g . o r g