稻曲病菌UvHog1基因的克隆及表达分析.pdf

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1、稻曲病菌U v H o g 基因的克隆及表达分析 饶玉春, , 丁正中, 陈析丰 曾大力 马伯军 顾志敏, (浙江师范大学 化学与生命科学学院,浙江 金华 ;中国水稻研究所 水稻生物学国家重点实验室,杭州 ;金华市 艾青中学,浙江 金华 ;共同第一作者;通讯联系人,E m a i l:z h m g u z j n u c n) C l o n i n ga n dE x p r e s s i o nA n a l y s i so fU v H o g G e n e i nU s t i l a g i n o i d e av i r e n s RAOY u c h u n ,D I

2、 NGZ h e n g z h o n g ,CHE NX i f e n g, ZE NGD a l i ,MAB o j u n,GUZ h i m i n, (C o l l e g eo fC h e m i s t r ya n dL i f eS c i e n c e s,Z h e j i a n gN o r m a lU n i v e r s i t y,J i n h u a ,C h i n a;S t a t eK e yL a b o r a t o r yo fR i c e B i o l o g y,C h i n a N a t i o n a lR i

3、 c eR e s e a r c hI n s t i t u t e,H a n g z h o u ,C h i n a; J i n h u a A i q i n gS c h o o l,J i n h u a ,C h i n a; T h e s ea u t h o r s c o n t r i b u t e de q u a l l yt o t h i sp a p e r;C o r r e s p o n d i n ga u t h o r,E m a i l:z h m g u z j n u c n) R AO Y u c h u n,D I N G Z h

4、 e n g z h o n g,CHE N X i f e n g,e ta l C l o n i n ga n de x p r e s s i o na n a l y s i so fU v H o g g e n ei n U s t i l a g i n o i d e av i r e n s C h i nJR i c eS c i, , () : A b s t r a c t:R i c e f a l s es m u t,c a u s e db yU s t i l a g i n o i d e av i r e n s,i sa ni m p o r t a

5、n td i s e a s ei nr i c ep a n i c l e D e g e n e r a t eP C R p r i m e r sw e r ed e s i g n e da c c o r d i n gt ot h ec o n s e r v e da m i n oa c i ds e q u e n c eo f s e v e r a l f i l a m e n t o u s f u n g u sm i t o g e na c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s e(MA P K)h o m o l o g

6、 o u s t oy e a s tH o g MA P K,a n dp a r t i a lD NAf r a g m e n t e n c o d i n gaMA P Kw a s a m p l i f i e d f r o mUv i r e n st h r o u g hP C R T h e n,a w h o l eD NAs e q u e n c ee n c o d i n gt h e MA P K,d e s i g n a t e da sU v H o g ,w a s o b t a i n e df r o mUv i r e n sb ye x

7、t e n d i n gu p s t r e a m a n dd o w n s t r e a m s e q u e n c eo ft h ea m p l i f i e df r a g m e n tu s i n gR A C E m e t h o d A n d i t sa m i n oa c i ds e q u e n c es h a r e d , , a n d i d e n t i t yt o M g O s m (AA F )f r o m M a g n a p o r t h eg r i s e a,B b H o g (AA S )f r

8、o mB e a u v e r i ab a s s i a n a,A f O s m (X P )f r o mA s p e r g i l l u s f u m i g a t u sa n dC r H o g (AAM ) f r o mC r y p t o c o c c u sn e o f o r m a n sv a r n e o f o r m a n s,r e s p e c t i v e l y P h y l o g e n e t i c c l u s t e r i n gs u g g e s t e dt h a tU v H o g i sh

9、 o m o l o g o u s t oy e a s tH o g MA P K T h er e s u l t so f t h ed e c r e a s e dt r a n s c r i p t l e v e l s o fU v H o g b ys a l i n i t ys u g g e s t t h a tU v H o g m a yb e i n v o l v e d i nt h es p e c i f i c a l l yr e s p o n s e s t os a l t s t r e s s e s K e yw o r d s:U

10、s t i l a g i n o i d e av i r e n s;H o g ;c l o n i n g;e x p r e s s i o na n a l y s i s 饶玉春,丁正中,陈析丰,等稻曲病菌U v H o g 基因的克隆及表达分析中国水稻科学, , () : 摘 要:稻曲病由稻曲病菌引起, 是水稻穗部的重要病害.利用同源克隆和R A C E技术, 根据丝状真菌相对保守的氨基酸 序列设计简并引物, 从稻曲病菌中分离了丝裂原活化蛋白激酶(MA P K) 编码基因的全长c D NA序列, 命名为U v H o g . U v H o g 含有MA P K保守 的 蛋 白

11、 激 酶 激 活 域(T G Y) , 序 列 与 稻 瘟 病 菌M g O s m (AA F ) 、 球 孢 白 僵 菌B b H o g (AA S ) 、 烟曲霉A f O s m (X P )和隐球酵母C r H o g (AAM ) 等MA P K高度同源, 相似性分别为 、 、 和 .系统聚类结果表明,U v H o g 与酵母H o g MA P K同源.在盐胁迫条件下,U v H o g 的相对表达量明显 降低, 表明U v H o g 参与了对盐胁迫的信号响应. 关键词:稻曲病菌;H o g ;克隆;表达分析 中图分类号:Q ;S 文献标识码:A 文章编号: ( ) 水稻稻

12、曲病又称青粉病、 绿黑穗病, 是由半知菌 亚 门 绿 核 菌 属 绿 核 菌 U s t i l a g i n o i d e a v i r e n s ( C o o k e )T a k a h 引 起 的 一 种 水 稻 穗 部 真 菌 性 病 害 , 发病于水稻穗部, 危害部分谷粒.自 世纪 年代以来, 随着杂交水稻高产品种的大面积推广 以及氮肥用量的提高, 稻曲病在国内许多省份频繁 发生, 尤其在浙江、 江苏、 四川、 江西、 湖南等十几个 省份更为普遍, 并且日趋严重, 已从次要病害上升为 主要病害 . 目前对稻曲病的研究多集中在发病规律和病害 防治上, 而这并不能控制稻曲病的

13、发生和蔓延.要 根除稻曲病的危害, 必须弄清稻曲病菌的相关致病 基因, 选育抗病品种.稻曲病菌的丝裂原活化蛋白 激酶(m i t o g e na c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e,MA P K) 途 收稿日期: ;修改稿收到日期: . 基金项目:国家自然科学基金资助项目( ; ; ) ; 浙江省自然科学基金资助项目( L Y C ) ; 浙江省重中 之重学科开放基金资助项目. 中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i) , , ( ) : h t t p: / /w w w r i c e s c i c n D O I: /j i

14、 s s n 径相关基因与稻曲病的发生密切相关, 所以对其进 行研究具有重要意义. MA P K是一种双磷酸化激活的丝氨酸/苏氨酸 蛋白激酶, 也称细胞外信号调节激酶( e x t r a c e l l u l a r s i g n a l r e g u l a t e dk i n a s e,E R K) , 是联系细胞表面受 体和细胞内靶蛋白的蛋白激酶, 对各种化学和生理 应激作出应答, 从而控制细胞的生存和对环境的适 应, 对植物与病原物识别、 植物防卫反应和病原物致 病因子的产生等具有重要作用 , 在生物体内的多 种细 胞 信 号 转 导 途 径 中 占 有 非 常 重 要 的

15、 地 位. MA P K的 活 性 受MA P KKK(m i t o g e na c t i v a t e d p r o t e i nk i n a s ek i n a s ek i n a s e) MA P KK(m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s ek i n a s e) MA P K组成的三 酶级联反应系统调控.胞外多种刺激因素都可以激 活这个三级酶联反应.MA P的底物包括蛋白激 酶、 磷脂酶、 骨架蛋白以及进入细胞核激活转录因 子.被MA P KK磷酸化的MA P K有种功能 , 停留在细胞质中,

16、 激活一系列其他蛋白激酶; 在细胞 质中使细胞骨架成分磷酸化; 进入细胞核, 通过磷酸 化转录因子, 调控基因的表达.MA P K在细胞的不 同部位发挥的作用不同. MA P K途径在酿酒酵母中的研究较为深入 , H o g 信号途径是MA P K途径中的一种, 也是最先 在酿酒酵母中发现的 , 该信号途径受到外界高渗 条件的诱导, 激活甘油合成相关酶基因的转录, 使胞 内积累高浓度的甘油, 维持细胞较高的膨压, 从而保 持细胞内的水分含量, 以利于细胞的正常生理代谢, 调控这一信号转导过程的途径就是HOG MA P K 级联途径. HOG通路的上游 有两个分 支: 一 条 是S l n l

17、y p d S s k l通路, 常见于细菌对环境的适应过程 ; 另一条是由跨膜蛋白S h o 感受高渗透压信号, 然 后通过未知因子激活C d c , 进而通过S t e 激活 S t e , 该分支还与假菌丝的发育有关 , .MA P K H o g 是酿酒酵母HOG MA P K级联的核心分子. 对H o g 活性进行合理的调控, 细胞就可以合成所 需的甘油, 以应对外界渗透压的变化.上游任意一 条分支通路被激活都能使P b s 及H o g 磷酸化、 转 运、 功能基因的诱导、 并适应高渗环境 , 但不同 的分支对渗透压的敏感性存在差异 .因此, 不 同靶基因的转录过程可能由这两个分支

18、决定 . 近年来在其他丝状真菌中该信号途径逐渐得到鉴定 ( 表) .该途径与真菌胞内的膨压调节密切相关, 但在不同的真菌中,H o g MA P K调节胞内小分子 量多元醇的种类不同, 对毒力的影响也不同.本研 究对稻曲病菌MA P K途径相关基因U v H o g 进行 了同源克隆, 并研究了其在盐胁迫下的表达情况, 旨 在为了解稻曲病的生长发育机理提供参考. 材料与方法 实验材料 稻曲病菌U v 由江苏省农业科学院提供, 本 实验室保存. 不同摩尔分数的盐溶液处理: 将U v 接种在 P S B培养基上,d后用m o l /L和 m o l /L的 N a C l溶 液 分 别 处 理 m

19、 i n、 m i n、 m i n和 表 目前发现的真菌H o g MA P K基因 T a b l e H o g MA Pk i n a s eg e n e sp r e s e n t l yf o u n d i nf u n g u s 基因 G e n e 生物来源 O r i g i n 功能 F u n c t i o n C a HO G C a n d i d aa l b i c a n s 合成甘油, 对尼克霉素Z、 刚果红和荧光增白剂具有明显抗性, 与细胞壁的功能调节 相关,C a H o g 突变株对小鼠的致死率显著下降 O SM M a g n a p o r

20、 t h eg r i s e a 高渗胁迫, 细胞肿瘤,O SM 突变株不影响侵染结构附着胞的形成和对寄主致病性 HO G Sc e r e v i s i a e 高渗环境下甘油合成 Z r HO G Z y g o s a c c h a r o m y c e s r o u x i i 高渗环境下甘油合成 Z r HO G Z y g o s a c c h a r o m y c e s r o u x i i 高渗环境下甘油合成 O S N e u r o s p o r ac r a s s a 菌株对杀菌剂二甲烷亚胺和苯基吡咯产生抗性 HO G Cl a g e n a r

21、i u m,Ch e t e r o s t r o p h u s,Bc i n e r e a 菌株对杀菌剂氟恶菌(f l u d i o x o n i l) 产生抗性 B b H o g B e a u v e r i ab a s s i a n a 在高渗、 亚高温 ( )和紫外照射处理下缺失突变体的孢子萌发受到明显抑制, 基 因敲除使菌株对桃蚜的毒力显著降低 中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i) 第 卷第期( 年月) m i n, 分别收集菌丝经液氮冷冻, 冰箱保 存. 实验方法 稻曲病菌基因组D NA和R NA提取 稻曲病菌经P S( 马铃薯蔗糖) 液体培养

22、基振荡 培养d后, 过滤得到菌丝, 采用S D S法提取稻曲病 菌基因组D NA, 其总R NA的提取按照Q I AG E N 公司试剂盒的提取步骤进行. 稻曲病菌H o g MA P K同源片段的克隆 根据丝状真菌相对保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白 酶氨基酸序列设计简并引物H o g 和H o g ( 表 ) .以稻曲病菌菌株U v 基因组D NA为模板, 进 行P C R扩增.扩增体系包括 P r i m e rS T A R缓 冲液( M g ) L,d NT PM i x t u r e( 各mm o l /L) L,D NAL,P r i m e rS T A R H SD NAP o l

23、 y m e r a s e( U/L) L, 正、 反向简并引物( m o l /L) 各 L, 加d d HO补足 L.P C R 扩增程序如下: 下m i n; 下 s, 下 s, 下 s, 每两个循环退火温度降低 直到退火温度降到 ; 下 s, 下 s, 下 s, 共 个循环; 下延伸 m i n; 下保存.P C R产物经琼脂糖凝胶电泳后, 切胶回收目的片段, 并将目的片段与p MD T载 体连接后测序. H o g MA P K基因的侧翼序列克隆 提取的稻曲病菌R NA用于合成c D NA.c D NA第一链的合成按照P r o m e g a反转录试剂盒说 明书要求进行.P C

24、R管中配制 L的反应体系: 总R NA g,O l i g o(d)T引物( n g/L)L, 加去R NA的水补足 L, 加热m i n, 冰浴 m i n.再加入缓冲液L,M ML V R T E ( U/L)L,d NT P( 各 mm o l /L) L, 核糖核酸酶抑制因子( U/L)L, 加去R NA 水补足 L, 下 m i n, 下变性 m i n, 反应结束后加 L的d d HO, 下保存. 表 本研究所用的引物 T a b l e P r i m e r s a p p l i e d i nt h i s r e s e a r c h 名称 N a m e 序列 S e

25、 q u e n c e( ) H o g G G Y T C R T C V G T D G G R T C R T G R T AH H o g R A T YA T G Y T D A C B T G G C A R AA R TA HO G C G T C A T C AA C A C C A T C G C AAG T HO G A T C A C T G C C GAAA C GA GA HO G T T G T G C T T GA G C GA C T GA HO G C G T T T C G G C A G T GA T T T A H o g FC C T T C T T

26、 G T A C T C T T C C A T G C H o g RG C T C T T C T A C T T T C C T C C A C C T 根据测序结果去除内含子序列( h t t p: / /l i n u x s o f t b e r r y c o m/b e r r y p h t m l) , 在两端设计条嵌套式引 物.以c D NA第链为模板用T a K a R a公司 F u l lR A C E K i t和 F u l lR A C E K i t通过R A C E 的方法向 和 端延伸. H o g 基因全长c D NA和D NA序列克隆 将测序就得的

27、序列片段拼接, 通过与已经报道 的其他丝状真菌的H o g MA PK基因进行核苷酸 序列的同源性比对, 判断是否得到完整的c D NA序 列.根据拼接得到的序列设计特异性引物H o g F 和H o g R, 分别以c D NA第链和D NA为模板扩 增, 测序得到稻曲病菌H o g MA PK基因c D NA 和D NA序列. 实时荧光定量P C R分析 采用TOYO B O公司的荧光定量试剂盒和A p p l i e dB i o s y s t e m s公 司 F a s t实 时 荧 光 定 量 P C R仪进行荧光定量P C R实验.P C R体系如下: THUN D E R B

28、 I R DS Y B Rq P C R M i x L, R O Xr e f e r e n c ed y e L, 引物 (m o l /L) L, 引物m o l /LL, c D NA模板( n g ) L, 无菌水L.P C R扩增条件如下: 下预变性 s; 下变性 s, 下退火 s, 下延伸 s, 在延伸阶段检测荧光强度, 收集信 号, 个循环; 下 s.从 到 , 每隔 停留 s, 检测一次荧光强度变化. 结果与分析 稻曲病菌U v H o g 基因同源片段克隆和侧翼 序列扩增 以稻曲病菌基因组D NA为模板, 利用简并引 物H o g F和H o g R扩增, 测序得到长度为

29、 b p 的片段, 对该D NA序列进行序列分析, 发现该区 段含有一个长度为 b p的内含子序列, 去除内含 子后经过B L A S T比对发现, 它与其 他丝状真菌 H o g 基 因 同 源 性 很 高, 初 步 证 明 为 稻 曲 病 菌 U v H o g 基因片段. 根据得到的稻曲病菌U v H o g 基因同源片段 设计特异引物, 采用R A C E方法向 和 端分别延 伸了 b p和 b p( 图) . 稻曲病菌H o g MA P K基因序列及编码氨基 酸的特征分析 序列分析表明, 该基因编码包含 个氨基酸 的多肽, 推测分子量为 k D a, 等电点为 . 利用N C B

30、I网站上的B L A S T软件分析, 结果 表明U v H o g 编 码 的 氨 基 酸 序 列 与 稻 瘟 病 菌 M g O s m(AA F ) 、 球 孢 白 僵 菌B b H o g 饶玉春等:稻曲病菌U v H o g 基因的克隆及表达分析 图 稻曲病菌U v H o g 基因的克隆 F i g C l o n i n go fU v H o g g e n e C r H o g 、S c H o g 、N c O s m 、A f O s m 、M g O s m 和B b H o g 分别代表隐球酵母(C r y p t o c o c c u sn e o f o r

31、m a n sv a r n e o f o r m a n s) 、 酿酒酵母(S a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e) 、 粗糙脉孢霉(N e u r o s p o r ac r a s s a) 、 烟曲霉(A s p e r g i l l u s f u m i g a t u s) 、 稻瘟病菌(M a g n a p o r t h eg r i s e a) 和球孢白僵菌(B e a u v e r i ab a s s i a n a) 的氨基酸序列,G e n B a n k登录号分别为AAM 、C AA 、AAK 、X

32、 P_ 、AA F 和AA S . 横线下方表示蛋白激酶的功能域, 星号和方框表示蛋白激酶自我磷酸化位点. C r H o g ,S c H o g ,N c O s m ,A f O s m ,M g O s m a n dB b H o g i n d i c a t e t h ep u t a t i v ea m i n os e q u e n c e so fh o m o l o g so fH o g MA P Kf r o mf u n g i C r y p t o c o c c u sn e o f o r m a n sv a r n e o f o r m a n

33、 s,S a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e,N e u r o s p o r ac r a s s a,A s p e r g i l l u sf u m i g a t u s,M a g n a p o r t h eg r i s e a, B e a u v e r i ab a s s i a n a,a n dt h e i rG e n B a n ka c c e s s i o nn u m b e ra r eAAM ,C AA ,AAK ,X P_ ,AA F , AA S ,r e s p e c t i v e

34、l y T h ec a t a l y t i cs u b d o m a i n so fp r o t e i nk i n a s ea r ei n d i c a t e db yl i n e T h ea u t o p h o s p h o r y l a t i o ns i t e sa r ei n d i c a t e db y a s t e r i s ka n db o x 图 U v H o g 蛋白与几个典型的真菌MA P K蛋白的氨基酸序列相似性分析和系统发育树 F i g U v H o g p r o t e i na n ds e v e r

35、a l t y p i c a l f u n g a l sMA P Kp r o t e i na m i n oa c i ds e q u e n c e s i m i l a r i t ya n a l y s i s a n dp h y l o g e n e t i c t r e e 中国水稻科学(C h i nJR i c eS c i) 第 卷第期( 年月) 图 N a C l处理下稻曲病菌U v H o g 的相对表达量 F i g R e l a t i v e e x p r e s s i o n l e v e l o fU v H O G g e n eu

36、 n d e rN a C l s t r e s s (AA S ) 、 烟曲霉A f O s m (X P_ )和 隐球酵母C r H o g (AAM ) 等H o g MA P K 高度同源, 相似性分别为 、 、 和 ( 图 A) .图中红框为激酶激活域 (T G Y) :自我 磷酸化位点; 绿线表示蛋白激酶AT P结合区域; 红 线表示蛋白激酶位点; 蓝线代表蛋白激酶特征区域. U v H o g 编码的氨基酸含有MA P K保守的激 酶激活区域“T G Y” , 该活性域存在于逆境胁迫激活 的MA P K蛋白激酶.利用D NA s t a r软件对几种真 菌的MA P K进行系统

37、聚类, 结果表明B b H o g 与 H o g MA P K同源( 图 B) . 渗透压胁迫下U v H o g 的相对表达 以 a c t i n为 内 参 基 因 分 析 渗 透 压 胁 迫 下 U v H o g 的表达情况.实时荧光定量P C R结果表 明, 不管是 m o l /L N a C l还是 m o l /L N a C l 这两种渗透压胁迫下U v H o g 的相对表达情况一 致, 且在低浓度( m o l /LN a C l) 下U v H o g 的相 对表达量高于高浓度( m o l /LN a C l) ( 图) .两 个浓度盐处理后, U v H o g

38、表达量都减少, 说明盐处 理可能抑制该基因的表达. 讨论 以现有种质资源中的相关抗源为基础的传统的 杂交育种和系统选育, 在植物抗病育种中发挥了巨 大的作用.但因我国大多数高产、 优质的常规稻品 种、 杂交组合及其亲本都对稻曲病表现感病, 甚至高 度感病而使该方法受到限制.开展稻曲病菌分子生 物学研究, 对稻曲病菌生长发育相关基因和致病相 关基因的研究有助于揭示稻曲病菌的侵染过程和致 病机制. 浙江省农业科学院构建了稻曲病菌c D NA文 库 并克隆了U v MK 基因 .c D NA 文库的筛 选也有其独特的优势, 克隆简单、 假阳性低, 但是 c D NA文库只代表一定时期一定条件下正在表

39、达的 基因, 是整个真核基因组中的少部分序列, 而且构建 和筛选文库的时间较长 .同源克隆的方法是利 用模式物种中较成熟的研究水平, 推广到一些重要 的物种中研究, 从而极大地缩短一些重要基因克隆 时间 , .随着分子生物学及信息技术的快速发 展, 采用同源克隆的方法在真核生物中寻找与克隆 新基因, 进而研究基因的功能已成为功能基因组研 究的捷径. 本研究中从稻曲病菌中扩增出MA P K同源基 因的部分片段, 然后利用R A C E法延伸该片段的侧 翼序列, 获得MA P K编码基因的全长序列, 命名为 U v H o g .序列分析表明, 该基因编码含 个氨 基酸的多肽, 推测分子量为 k

40、D a, 等电点为 .U v H o g 含有MA P K保守的蛋白激酶激活 域(T G Y) , 序列与稻瘟病菌 M g O s m (AA F ) 、 球 孢 白 僵 菌B b H o g (AA S ) 、 烟 曲 霉 A f O s m (X P_ )和 隐 球 酵 母C r H o g (AAM ) 等H o g MA P K高度同源, 相似度 分别为 、 、 和 .系统聚类结果表 明,U v H o g 与酵母 H o g MA P K同源.另外, 我 们在扩增U v H o g 的c D NA过程中发现,U v H o g 在mR NA水平上存在可变剪接, 这在稻曲病菌中 尚未发

41、现过.经 和m o l /LN a C l渗透压胁 迫, U v H o g 的相对表达情况一致, 且在低浓度下 U v H o g 的相对表达量高于高浓度.后续可以用更 多的处理( 冷、 热和甘露醇等) 来研究该基因的功能 表达情况. 参考文献: 姜慎, 唐春生, 谭志琼国内外稻曲病研究现状热带农业科学, , () : Z h uHC,X uXP,X i a oGY,e t a l E n h a n c i n gd i s e a s e r e s i s t a n c e so f s u p e rh y b r i dr i c ew i t hf o u r a n t i

42、f u n g a l g e n e s S c iC h i n aS e rC L i f eS c i, , () : 陈丽, 胡东维, 陈美军, 等稻曲球及稻曲病菌菌落微结构的 S EM观察菌物学报, , () : 李西川酿酒酵母菌和白念珠菌中R C K 和HO G 蛋白激酶 饶玉春等:稻曲病菌U v H o g 基因的克隆及表达分析 在高渗胁迫、 氧化胁迫和细胞壁完整性方面的功能研究 学位 论文天津: 天津大学, : 吴雪昌,胡森杰,钱凯先酵母HO G MA P K途径细胞生物 学杂志, , : 杨洪强,接玉玲植物MA P K及其在病原信号传递中的作用 植物病理学报, , () :

43、 C h e nRE,T h o r n e r J F u n c t i o na n d r e g u l a t i o n i nMA P Ks i g n a l i n gp a t h w a y s:L e s s o n s l e a r n e d f r o mt h ey e a s tS a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a eB i o c h i m B i o p h y sA c t a, , () : G u s t i n M C,A l b e r t yNJ,A l e x a n d e rM MA Pk i n a s ep a t h w a y si nt h ey e a s tS a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a eM i c r o b i o l M o l B i o lR e v, , : S t o c kA M,R o b i n