青海大黄油菜粒色性状分子标记的开发和图谱整合.pdf

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1、作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014, 40(6): 965972 http:/zwxb.chinacrops.org/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: 本研究由国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2011AA10A104), 国家重点基础研究发展计划(973 计划)项目(2012CB723007), 国 家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-13)和国家自然科学基金项目(31060196)资助。 通讯作者(Corresponding author): 杜德志, E-mail: , Tel: 0971-5366

2、520 第一作者联系方式: E-mail: , Tel: 13639767407 (赵会彦); E-mail: (肖麓) 同等贡献(Contributed equally to this work) Received(收稿日期): 2013-08-21; Accepted(接受日期): 2014-03-04; Published online(网络出版日期): 2014-04-08. URL: http:/ DOI: 10.3724/SP.J.1006.2014.00965 青海大黄油菜粒色性状分子标记的开发和图谱整合 赵会彦* 肖 麓* 赵 志 杜德志* 青海大学农林科学院春油菜研究所 /

3、 青海省春油菜遗传改良重点实验室 / 青海省高原作物种质资源创新与利用国家重点实验室培 育基地, 青海西宁 810016 摘 要: 利用青海大黄油菜和褐籽白菜型油菜 09A-126 构建 BC4和 F2分离群体, 结合 AFLP 与群体分离分析法 (bulked segregant analysis, BSA)筛选引物, 获得 5 个与黄籽基因 Brsc1 紧密连锁的分子标记 Y11Y15。5 个 AFLP 特 异片段的序列, 均与白菜型油菜的 A9 染色体部分序列表现同源。将 5 个 AFLP 标记成功转化为 5 个 SCAR 标记 (SC11SC15)。 利用目标基因所在染色体区段序列筛选

4、到 7 个与目标基因紧密连锁的 SSR 标记(BrID10607、 KS10760、 B089L03-3 和 A1A4)。利用 SCAR 和 SSR 标记扫描 F2群体中部分单株, 发现 SC14 和 A1 为共显性标记。用 BC4群 体将 Brsc1 定位在标记 Y06 和 A4 之间 1.7 Mb 的区间内, 遗传距离分别为 0.115 cM 和 0.980 cM。标记 Y05 和 Y12 与 Brsc1 共分离。本研究为黄籽油菜分子标记辅助选择育种体系的建立及目标基因的进一步精细定位和图位克隆奠 定了基础。 关键词: 白菜型油菜; 黄籽; 分子标记; 遗传图谱; 物理图谱 Develop

5、ment of Molecular Markers and Map Integration for Seed Color Traits in Dahuang Rape (Brassica rapa L.) ZHAO Hui-Yan*, XIAO Lu*, ZHAO Zhi, and DU De-Zhi* Institute of Spring Rapeseed, Qinghai Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Key Laboratory of Qinghai Province for Spring Rapeseed Genetic

6、 Improvement / National Key Laboratory Breeding Base of Qinghai Province for Innovation and Utilization of Plateau Crop Germplasm, Xining 810016, China Abstract: A BC4 population and a F2 population, derived from the cross between Dahuang and 09A-126 (brown seed, B. rapa), were constructed. AFLP (am

7、plified fragment length polymorphism) methodology and bulked segregant analysis (BSA) were used to get five AFLP markers closely linked to yellow-seeded gene Brsc1, termed Y11Y15 respectively. Five AFLP specific frag- ments were homologue with some sequences on chromosome A09 of Brassica rapa, which

8、 we converted into five SCAR markers, termed SC11SC15. Seven SSR markers, BrID10607, KS10760, B089L03-3, A1A4, tightly linked to Brsc1 were developed in the region of chromosome where Brsc1 was located. With five SCAR markers and seven SSR markers used for genotyping in F2 population, SC14 and A1 we

9、re confirmed as co-dominant markers. Using BC4 population, Brsc1 was located in the region of 1.7 Mb between Y06 and A04 on chromosome A9 with genetic distances of 0.115 cM and 0.980 cM. Y05 and Y12 co-segregated with Brsc1. The results were useful for developing yellow-seeded rapeseed lines by mark

10、er-assisted selection (MAS), and also laying the foundation for fine mapping and map-based cloning of Brsc1. Keywords: Brassica rapa L.; Yellow seed; Molecular marker; Genetic map; Physical map 油菜菜籽油是我国食用油的重要来源, 菜籽饼 粕是良好的蛋白质饲料, 提高含油量和蛋白质含量 是油菜品质育种的最重要目标。大量研究表明, 相 同遗传背景下, 黄籽油菜的籽油含量和蛋白质含量 通常高于黑籽或褐籽油菜,

11、 而且黄籽具有种皮薄、 纤维素和多酚类物质含量低、 油质清澈透亮等优点, 966 作 物 学 报 第 40 卷 因此, 黄籽油菜的选育倍受研究人员的重视1-4。 Mohammad 等5研究表明, 黄籽沙逊油菜黄籽性状 受 3 对基因(Br1、Br2 和 Br3)控制, 3 对基因同时为 隐性时表现黄籽, Jnsson6研究得出同样的结论; Stringam7研究表明, 黄籽沙逊菜籽种皮颜色受 2 对独立基因(Br1 和 Br3)控制, 当 2 对基因同时为 隐性时, 种皮颜色为黄色; Zaman8和 Rahman9同 样认为黄籽性状受双基因控制; Ahmed 和 Zuberi10 研究认为白菜

12、型油菜的黄籽性状受 1 对基因控制, Hawk11和 Chen 等12的研究与之相同; Schwetka13 认为白菜型油菜的粒色性状受母本影响较大, 且与 7 对基因(Br1、 Br3Br8)有关。 Teutonico 和 Osborn14 构建了白菜型油菜 RFLP 标记遗传连锁图谱, 将控 制黄籽和褐籽性状的位点 Yls 定位于第 5 连锁群; Chen 等15利用白菜型油菜-芥蓝单体异附加系筛选 到一个与种皮颜色基因紧密连锁的 RAPD 标记, 并 推测由于同源重组或染色体缺失, 该粒色基因位于 外来的 C 基因组第一条染色体的末端; Rahman 等16 利用黄籽沙逊为材料, 筛选到

13、一个与粒色基因 (Br1/br1)紧密连锁的 SRAP 标记 SA7BG29-245, 遗 传距离为 0.47 cM, 并将该标记转化为 SNP 标记和 SCAR 标记。 白菜型黄籽油菜是自然界存在的天然黄籽资源 之一, 白菜型油菜的黄籽性状的研究对甘蓝型黄籽 油菜品种的遗传改良具有一定的指导意义。青海大 黄油菜是起源于青藏高原的地方品种, 属白菜型油 菜, 菜籽种皮颜色鲜黄且遗传稳定, 自交亲和性好, 是进行油菜黄籽性状研究的良好材料17。Xiao 等18 认为黄籽性状受一个隐形基因位点(Brsc1)控制, 构 建了 Brsc1 的遗传连锁图谱, 并定位于白菜型油菜 A9 染色体上, 将目标

14、基因锁定 2.8 Mb 的区间。 本研 究扩大作图分离群体, 利用新的引物组合, 以筛选 更多与目标基因紧密连锁的分子标记, 与前人所获 得标记进行整合, 构建高密度的遗传连锁图谱, 为 黄籽油菜分子标记辅助选择育种体系的建立和图位 克隆奠定基础。 1 材料与方法 1.1 试验材料和群体构建 选用亲本材料为青海大黄油菜(黄籽)和 09A- 126 (褐籽), 由青海省农林科学院春油菜研究所提 供。大黄油菜和 09A-126 均已连续自交或兄妹交 8 代以上, 粒色性状稳定。 以 09A-126 为供体亲本, 大 黄油菜为轮回亲本, 进行连续回交。在 BC1、BC2 和 BC3世代中均保留褐籽单

15、株上收获的种子播种, 用于下一轮的回交, 获得的 BC4分离群体作为 Brsc1 基因的定位群体; 大黄油菜和 09A-126 杂交获得的 F1单株自交, 获得 F2群体, F2中每一个单株套袋自 交, 获得 F2:3家系, 用于 F2单株基因型的鉴定。 1.2 DNA 提取和性状调查分组 在苗期, 从 BC4群体和 F2群体每株油菜中取适 量叶片, 采用 CTAB 法提取总 DNA, 参考 Doyle19 的方法并略作改动。使用紫外分光光度计测定每个 单株总 DNA 浓度, 稀释至 50 ng L1, 冷藏备用。 在角果完全成熟后, 采用目测法调查 BC4群体、 F2群体及 F2:3家系所有

16、单株种皮颜色。根据粒色将 BC4群体所有单株 DNA 分为黄籽和褐籽两组; 根据 F2群体单株粒色性状和 F2:3家系中粒色性状是否分 离将 F2群体单株 DNA 分为黄籽、 纯合褐籽(不分离) 和杂合褐籽(分离) 3 组。 1.3 AFLP 分析 在 BC4群体中随机挑选 12 个黄籽单株和 12 个 褐籽单株, 每 6 个单株 DNA 等量混合, 分别构建 2 个黄籽基因池和 2 个褐籽基因池。采用 Pst I/Mse I 的酶切组合, 首先利用 256 对选扩引物(P0116/MG01 16)和4个基因池筛选标记, 用6%聚丙烯酰胺凝胶电 泳检测 PCR 扩增产物。能区分黄籽和褐籽基因池

17、的 多态性标记继续用 BC4分离群体单株检测, 最终筛 选出与粒色性状紧密连锁的 AFLP 标记20-21。参照 陆光远22的方法操作。AFLP 引物由上海生工生物 工程有限公司合成。 1.4 AFLP 特异片段回收、测序及序列比对 在 6%聚丙烯酰胺凝胶胶板干燥之前将 AFLP特 异片段用刀片轻轻挖出并转入 0.5 mL 离心管中, 加 2040 L ddH2O, 沸水浴 10 min 后取上清液利用原 引物重新扩增, 用 1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物, 用 Sanprep 柱式 DNA 胶回收试剂盒(上海生工生物 工程有限公司)从琼脂糖胶块中回收目标片段。将目 标片段与 pMD18-T

18、载体(大连宝生物工程有限公司) 连接, 导入 DH5 大肠杆菌感受态细胞克隆扩增, 经蓝白斑筛选和电泳检测, 从每个目标片段挑选 3 个阳性克隆菌液, 送上海生工测序。具体操作参照 易斌23的方法。 测序后, 在 BRAD 数据库(http:/brassicadb.org/ brad/index.php)和 TAIR 数据库(http:/www.arabido- psis.org/)中, 使用 Blast 命令分析每个 AFLP 特异片 第6期 赵会彦等: 青海大黄油菜粒色性状分子标记的开发和图谱整合 967 段与白菜型油菜基因组和拟南芥基因组的序列共线 性, 确定每个特异片段所在染色体及在染

19、色体上的 物理位置24-26。 1.5 SCAR 标记转化 根据 AFLP 特异片段的序列信息, 利用 Primer3 软件(http:/frodo.wi.mit.edu/)设计 SCAR 引物, 由上 海生工生物工程有限公司合成。首先在基因池和 BC4分离群体部分单株中检测合成后的 SCAR 引物 是否具有多态性, 然后在 F2群体中用黄籽、杂合褐 籽和纯合褐籽的单株检测其是否为共显性标记。参 照李霞27的方法进行 SCAR 引物 PCR。 1.6 SSR 分析 根据 Xiao 等18对目标基因的定位结果及本研 究 AFLP 分析比对结果, 从 BRAD 数据库下载目标 基因所在区域内的已公

20、布的 SSR 标记, 并下载相关 区段 DNA 序列, 用 SSRHunter 1.3 软件检测 SSR 位 点, 用 Primer3 软件设计 SSR 引物。 参照 Cheng 等28 的 PCR 体系, 检测方法与 SCAR 引物检测方法相同, 见 1.5。 1.7 图谱构建和绘制 利用 BC4群体所有单株检测特异性 AFLP 和 SSR 标记, 筛选交换单株, 计算重组率, 用 Kosambi 函数将重组率转换为遗传距离29。 用 MapMaker/Exp 3.0 软件分析标记与目标基因之间的连锁关系, 构建 目标基因所在染色体局部区域的遗传连锁图谱30。 连锁标记在染色体上的物理位置可

21、由 BRAD 数据库 获得。用 MapDraw Ver. 2.1 软件绘制遗传连锁图谱 和连锁标记的物理图谱31。 2 结果与分析 2.1 AFLP 分析 利用4个基因池检测 AFLP 引物, 若多态性片段 同时出现在2个褐籽基因池中, 而在2个黄籽基因池 中都缺失, 则认为可能与目标基因连锁。将这些引物 组合挑出, 用于分析 BC4群体中随机挑选的6个黄籽 单株和6个褐籽单株。部分标记, 尤其是在基因池检 测中多态性条带较弱的标记, 在进行单株检测时多 态性消失; 部分标记检测出的重组单株大于2株, 说 明离目标基因较远, 同样予以舍弃。特异条带清晰且 检测出的重组单株少于2株(包含2株)的

22、 AFLP 标记, 被认为是与目标基因紧密连锁的 AFLP 标记。 本研究 中, 共筛选256对引物组合, 获得5个与目标基因紧密 连锁的标记, 将其分别命名为 Y11Y15 (表1)。 2.2 AFLP 特异片段同源性分析 5 个 AFLP 特异片段经回收、克隆和测序, 序列 信息提交 BRAD数据库序列比对表明, 5个特异片段 均与白菜型油菜 A9 染色体序列高度同源, 与 Xiao 等定位结果一致, 进一步证实控制粒色性状的基因 位于 A9 染色体上; 5 个 AFLP 特异片段的序列信息 同时提交 TAIR 网站序列比对表明, Y11 和 Y15 标记 分别与拟南芥第 5 染色体和第

23、2 染色体部分序列同 源(表 1)。 2.3 SCAR 标记转化 根据5个AFLP特异片段的序列信息, 在靠近特 异片段序列末端区域设计 SCAR 引物, 每个 AFLP 特异片段设计一对 SCAR 引物, 分别命名为 SC11 表 1 与 Brsc1 紧密连锁的 AFLP 标记 Table 1 AFLP markers closely linked to Brsc1 标记名称 Marker 引物序列 Primer 特异片段 Specific fragment (bp) 白菜型油菜连锁群 Linkage group of B. rapa (position) 白菜型油菜 同源基因 Orthol

24、ogous gene on B. rapa 遗传距离 Genetic distance (cM) 拟南芥连锁群 Linkage group of A. thaliana (position) 拟南芥同源基因 Orthologous gene on Arabidopsis Y11 P-GCA/M-GAG 144 A9 (13, 623, 148-13, 622, 882) Bra027520 Chr5 (17, 709, 027-17, 709, 261) AT5G44010 Y12 P-GGT/M-GAA 120 A9 (16, 472, 257-16, 472, 371) 0 Y13 P-T

25、GT/M-GTG 267 A9 (9, 538, 042-9, 537, 755) Y14 P-TGC/M-GCG 132 A9 (14, 484, 822-14, 484, 254) 2.8 Y15 P-ACT/M-GTT 160 A9 (14, 834, 923-14, 834, 749) Bra017382 2.5 Chr2 (1, 071, 113-1, 071, 178) AT2G03520 : 无相应结果。: no relevant result. P: 5-GACTGCGTACATGCAG-3; M: 5-GATGAGTCCTGAGTAA-3. 968 作 物 学 报 第 40

26、卷 SC15, 其引物序列及退火温度见表 2。 5 个 SCAR 标 记经基因池和 BC4群体单株验证, 检测结果与对应 AFLP 标记一致, 表明 5 个 AFLP 标记均被成功转化 为 SCAR 标记。5 个 SCAR 标记在 F2群体部分单株 中检测结果表明, SC14 在黄籽、杂合褐籽和纯合褐 籽单株中扩增出了不同的带型, 能够区分黄籽、杂 合褐籽和纯合褐籽 3 种类型的单株, 为共显性标记。 其余 4 个 SCAR 标记均为显性标记。 表 2 由特异性 AFLP 标记转化所得 SCAR 标记 Table 2 SCAR markers developed from AFLP marke

27、rs AFLP 标记 AFLP marker SCAR 标记 SCAR marker 上游引物 Forward primer (53) 下游引物 Reverse primer (53) Tm () Y11 SC11 GGAACGCCAGAAGATTG TTCATCTCGCTCGAATCG 55 Y12 SC12 GAGAAGACGTCCATGACC GGTTGACACTATTCGCAG 55 Y13 SC13 CGAGAGTGCAGGAAGTGAAGC TTCGGACATAGTGCGCGAC 55 Y14 SC14 TGCGAGGATACAATAGCGAC AGGATCGTCTCGTTACGT

28、GC 58 Y15 SC15 GCAGACTCTGTCCAAGTTAG GACGATCTCCGATACTCTCC 58 2.4 SSR 标记筛选 从 BRAD 数据库中白菜型油菜 A9 染色体上目 标基因所在区段下载得到已公布的 SSR 标记, 并在 该区段每隔一段距离设计开发一个新的 SSR 标记。 合成后的 SSR 引物在基因池和 BC4分离群体中进行 多态性检测, 结果发现, 在已公布的 SSR 标记中, 共有 3 个标记(B089L03-3、BrID10607 和 KS10760) 与目标基因连锁。图 1 所示为 KS10760 在 BC4群体 部分单株中的扩增结果。新开发的 SSR

29、引物中, 有 4 个标记(A1A4)表现为与目标基因连锁。以上获得 的 7 个特异性 SSR 标记的引物序列及在染色体上的 位置详见表 3。利用 F2群体 3 种类型的单株(黄籽、 杂合型褐籽和纯合型褐籽)对7个特异性SSR标记进 行检测, 结果发现只有标记 A1 具有共显性, 其扩增 结果如图 2 所示。 2.5 图谱构建和绘制 BC4定位群体共包含 1739 个单株。获得的所有 特异性标记的物理位置可由 BRAD 数据库获得, 首 先在 BC4群体中随机挑选 48 个黄籽单株和 48个褐 籽单株, 对所有特异性标记进行初步检测, 根据交 换单株的分布和数目及特异性标记在染色体上的位 置,

30、选择位于目标基因两侧且扩增条带清晰、交换 单株数目适中的 B089L03-3 和 Y14 标记对 BC4群体 所有单株进行检测, 寻找交换单株, 然后利用 表 3 与 Brsc1 紧密连锁的 SSR 标记 Table 3 SSR markers closely linked to Brsc1 SSR 标记 SSR marker 引物序列 Primer sequence (53) 白菜型油菜连锁群 Linkage group of B. rapa (position) 遗传距离 Genetic distance (cM) 白菜型油菜同源基因 Orthologous gene on B. rapa

31、 拟南芥同源基因 Orthologous gene on Arabidopsis F: GTGTGATAAAACTGAAACGG BrID10607 R: TGAGCAGAGCACACGTCTA A9(21,304,313-21,304,407)0.63 F: TAGCAGTGGCCTACTCCTTG KS10760 R: CAGCATTGTGATGTGTCAGG A9(21,015,520-21,016,064)0.57 Bra023174 AT1G31300 F: TTGTTTTTAACTAATAGT B089L03-3 R: TGGTCGGGGAGCCATGTGCG A09(23,247

32、,111-23,247,848)3.80 Bra024734 AT1G25570 F: CCTCTGAACAAGATGTCG A1 R: CCAGATCAGAAGCAACG A9(21,964,641-21,964,497)0.80 Bra032382 AT1G30360 F: TCGAGCAAGAAGCCAAGC A2 R: GCGTAATCCAGTCCTACATTCC A9(21,722,136-21,721,949)0.75 Bra032409 AT1G30620 F: AGAGCTTGTAGGTGCAGATG A3 R: GCCGTGAGACAGAGAGTATC A9(21,255,9

33、63-21,255,768)0.63 F: GGAGAATCTATCAACGCCTG A4 R: TCGGTATCTTCGGAACAGAG A09(17,731,411-17,731,140)0.98 : 无相应结果。: no relevant result. 第6期 赵会彦等: 青海大黄油菜粒色性状分子标记的开发和图谱整合 969 图 1 引物 KS10760 在 BC4群体单株中的扩增检测结果 Fig. 1 Amplification results of KS10760 in individual plants of BC4 population 148: 黄籽单株; 4996: 褐籽单

34、株; M: DNA 分子量标记。 148: yellow-seeded plant; 4996: brown-seeded plant; M: 100 bp DNA ladder. 图 2 引物 A1 在 F2群体单株中的扩增检测结果 Fig. 2 Amplification results of A1 in individual plants of F2 population 18: 黄籽单株; 916: 杂合褐籽单株; 1724: 纯合褐籽单株; M: DNA 分子量标记。 18: yellow-seeded plant; 916: heterozygous brown-seeded pl

35、ant; 1724: homozygous brown-seeded plant; M: 100 bp DNA ladder. B089L03-3 和 Y14 之间的所有特异性标记对这些交 换单株进行检测, 包括 Xiao 等所获得的 4 个 AFLP 标记(Y05Y07, Y10)和本研究所获得的 8 个特异性 标记(Y12、 Y15、 BrID10607、 KS10760 和 A1A4), 其 中 Xiao 等所获得的标记在 BC4群体中仍具有明显多 态性, 分别得到这些标记的交换单株, 确定重组率, 计算遗传距离, 如表 1 和表 3 所示, 构建遗传连锁图 谱如图 3-B 所示, 并结

36、合 Xiao 等定位结果, 绘制了 整合后的物理图谱, 如图3-C所示。新构建的遗传连 锁图谱中包含 2 个共分离标记 Y05 和 Y12, 除 Y12 图 3 Brsc1 基因区域的遗传连锁图谱 Fig. 3 Linkage map of Brsc1 gene A: Xiao 等18构建; B: 本课题组构建; C: A9 染色体上与 Brsc1 连锁的分子标记的物理图谱。虚线为同一标记在不同图谱中的位置。 A: constructed by Xiao et al.18; B: constructed by our research group; C: map of markers link

37、ed with Brsc1 on A9 of Brassica rapa L. dotted lines indicate the same marker on different maps. 970 作 物 学 报 第 40 卷 外, 各标记在连锁图中的分布与其在染色体上的物 理位置基本一致, 据此将目标基因锁定于 Y06 (19.3 Mb)和 A4 (17.6 Mb)标记之间 1.7 Mb 的区间内。 3 讨论 Xiao 等18构建了包含 456 个单株的 BC1群体对 大黄油菜黄籽基因进行定位, 采用 P0/MC 的引物组 合, 共筛选到 10 个 AFLP 标记和 3 个 SSR 标记

38、, 距 离目标基因最近的 AFLP 标记 Y10 与目标基因间的 遗传距离为 0.2 cM, 最近的 SSR 标记与目标基因间 的遗传距离为 0.8 cM, 并筛选到 2 个共显性 SSR 标 记 CB10022 和 CB10255。本研究采用不同的 AFLP 引物组合, 筛选得到 5个与目标基因连锁的 AFLP标 记, 其中 Y12 与目标基因共分离。 5 个 AFLP 标记被 成功转化为 SCAR 标记, 将更加有利于今后的育种 实践工作。同时共显性标记 SC14 和 A1 的获得, 为 黄籽油菜分子标记辅助选择育种体系的建立创造了 有利条件。 BRAD 数据库的建立为本研究提供了很大的帮

39、助, 根据特异性 AFLP 特异片段与白菜型油菜基因组序列 同源比对结果, 进行了 SSR 引物的开发和收集, 成功 筛选到7个特异性SSR标记。 随着测序技术的发展, 芸 薹属作物基因组序列信息越来越丰富, 使基于 DNA 序列的分子标记开发越来越便捷, 必将为芸薹属作物 优良性状分子水平的研究提供极大的便利。 本研究将Xiao等18在BC1群体中所获得的特异 性标记在 BC4群体中进一步检测, 4个 AFLP 标记 (Y05Y07, Y10)的遗传距离与前人测定的结果不同, 与 Brsc1 的的相对位置也发生了一定的变化。由于 Xiao 等定位所用群体为 BC1群体, 且群体单株数目 较少

40、, 随着作图群体单株数目的增加, 特异性标记 与目标基因间的遗传距离和相对位置的测定应更为 准确, 本研究采用 BC4分离群体, 群体单株数目较 前人的 BC1群体多, 且由于回交次数的增加, 分离 群体中黄籽和褐籽两种单株的遗传背景更为一致, 定位更准确。虽将目标基因的位置进行了矫正, 但 其所在染色体区域(1.7 Mb)仍比较大, 需进一步扩 大作图群体, 并设计开发更多的分子标记, 进一步 对目标基因定位。Xiao 等所获得的标记 Y08 和本研 究所得标记 Y12 的遗传距离和物理位置间有一定差 异, 除可能与群体大小相关外, 还可能与白菜型油 菜基因组序列信息不够完备有关, 随着 B

41、RAD 数据 库的不断完善和作图群体的不断扩大, 可对相关标 记的位置进一步矫正。 Li 等32和 Kebede 等33对白菜型油菜黄籽性状 的研究, 均将控制黄籽性状的基因或主效位点定位 于 A9染色体, 与本研究定位结果相似, 但可能由于 试验材料、试验方法等的不同, 具体定位结果也不 完全相同。Li 等用黄籽沙逊为材料将黄籽基因定位 于A9染色体上11.4 Mb处, 与本研究定位区间(17.6 19.3 Mb)相距较远, 可能为控制黄籽性状的不同的 基因。Kebede 等同样对黄籽沙逊进行研究, 在 A9 染色体上得到控制黄籽性状的1个主效 QTL (SCA9-2) (18.9 Mb 左

42、右)和1个微效 QTL(SCA9-1) (7.0 Mb 左 右), 与 Li 等的研究结果相比, 虽然研究材料同为黄 籽沙逊, 但2个 QTL 在A9染色体上的位置不同; 与 本研究结果相比, 虽然试验材料不同, 但其中主效 QTL SCA9-2包含一个与本研究黄籽基因同样表现 连锁的 SSR 标记 CB10022, 且该标记位于本研究目 标基因被锁定的区域内, 说明两者可能为同一位点, 可利用2个基因位点所在区域更多的连锁标记互相 验证, 并对2个基因位点进一步精细定位, 直至获得 基因序列, 方可确定其是否为同一位点。A9染色体 为 A 基因组中最长的一条染色体, 其上有许多控制 油菜优良

43、农艺性状的基因。将本研究所得与目标基 因紧密连锁的分子标记在 A9染色体上进行同源基 因比对, 部分标记具有同源基因, 也具有对应拟南 芥同源基因, 但未发现与种皮颜色形成相关基因。 在本研究中目标基因被锁定的 A9染色体上的区域 内, 包含许多已公布的基因, 其中我们发现基因 Bra028067与控制类黄酮合成的拟南芥基因 TT1 34-36 同源, Bra028067 (18.7 Mb)位于目标基因被锁定的 1.7 Mb 的区间内, 且距离共分离标记 Y05 (18.9 Mb) 较近, 可对该基因进行研究, 为目标基因的定位提 供有利的信息。 Zhang 等37利用图位克隆的方法, 在 白

44、菜型油菜双单倍体系中, 得到一个同时控制粒色 性状和毛状体性状的基因, 该基因与拟南芥TTG1基 因同源。 在甘蓝型油菜和芥菜型油菜中, 也有一些与 拟南芥透明种皮基因同源的基因被克隆分离38-39, 拟南芥作为模式植物, 其上许多功能已知的基因可 为油菜栽培种中控制优良性状的基因的研究提供帮 助。本研究和 Kebede 等研究所得与黄籽基因紧密连 锁的标记 CB10022来源于甘蓝型油菜 N9染色体40, 由于芸薹属作物在起源进化上的互相关联, 不同油 菜栽培种间对相同性状的分析结果可互为参考, 加 快对目标性状的研究利用。 第6期 赵会彦等: 青海大黄油菜粒色性状分子标记的开发和图谱整合

45、971 4 结论 筛选到与大黄油菜粒色基因Brsc1紧密连锁的5 个 AFLP 标记(Y11Y15)和 7 个 SSR 标记(B089L03-3, KS10760, BrID10607, A1A4), 并将 5个特异性 AFLP 标记转化为 SCAR 标记, 多态性明显, 还筛选 到 2 个共显性标记(SC14, A1)。 将前人获得的标记与 本研究获得的标记整合, 对目标基因进一步定位, 得到 2 个共分离标记 Y05 和 Y12, 将目标基因锁定 于白菜型油菜 A9 染色体上 Y06 和 A4 标记之间 1.7 Mb 的区间。 References 1 刘后利. 油菜遗传育种学, 北京:

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