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1、Rho激酶及其抑制剂临床研究进展,心脑血管疾病治疗新策略,Ras蛋白,癌基因 1976年从劳斯肉瘤病毒中分离得到了第一个能使细胞癌变的基因（取肉瘤sarcoma的缩写，sac基因），人们称这种基因为癌基因（oncogenes） Ras 人类的第一个癌基因是1982年美国科学家从人膀胱癌细胞中找到的，因为它和先前已经获得的鼠肉瘤病毒的癌基因完全相同，故命名为ras基因（取鼠肉瘤rat sarcoma的缩写，ras基因）。,Rho蛋白,属于Ras超家族，Ras homologous的缩写 小的GTP酶，两种存在形态Rho-GDP Rho-GTP,Rho基因的发现,1985年，Madaule 及Ax
2、el报道了一个新的ras基因成员rho基因，与经典的ras基因（N-, K-及H-ras）具有某些相同的特性。 Rho基因首先从Aplysia（雨虎）的腹腔神经节cDNA文库分离出来，编码的蛋白质中35的氨基酸与H-ras同源。rho进化中高度保守的区域在果蝇、大鼠、人等均可发现。序列分析显示，人与果蝇的rho基因85同源。,Rho家族成员及其底物,Rho家族成员 RhoA 、RhoB、 RhoC、 Cdc42 、TC10、 TCL、 Chp、 Wrch-1、 Rac1、 Rac2 、Rac3、 RhoG、 Rac1b、 Rnd1 、Rnd2、 Rnd3/RhoE、 RhoD 、Rif 、Rh
3、oH/TTF RhoB、TB1、 RhoBTB2 、Miro-1 底物（效应因子） ROCKI 、ROCK II、 mDia 、PRK1/2 PKN、 Rhoteckin、 Rhophillin、 Kinectin 、Citron Kinase、 MBS 、p76RBE、 PKC epsilon、 DBl transcription factor,ROK（Rho-kinase）及其分布,ROK （或ROCK II ,Rho-associated coiled-coil-containing protein kinase II） 及ROK （ROCK I）结构十分相似，分子量均为160kDa。在
4、哺乳动物的大多数组织内均有表达，一般以无活性形态存在于胞浆内，在激活后转移到胞膜处起作用。 ROCKI及ROCKII氨基酸序列65相同，激酶区相似性92。 含高度保守的富含半胱氨酸/组氨酸区域，与RhoA, RhoB及 RhoC结合，Rho结合区包含30AAs。 ROCK II主要在脑内表达，而ROCK I主要在非神经元组织表达，包括心脏、肺、骨骼肌等。,RhoROK信号通路功能,主要调节细胞骨架蛋白合成和降解、移动、收缩等 参予细胞的基本生命过程 细胞迁移 细胞增殖 细胞存活,Rho图片,Rho激酶活化的病理过程,Rho激酶研究进展,Arteriosclerotic diseases 动脉粥
5、样硬化病变,Angina 绞痛 Myocardial infarction 高胆固醇心肌梗死 Restenosis 再狭窄 Stroke 卒中 Hypertensive vascular disease 原发性高血压 Heart failure 心功能衰竭 Cardiac allograft vasulopathy 心脏移植物血管病变 Vein graft disease 静脉内膜增生,Other SMC disorders 其他平滑肌细胞痉挛,Bronchial asthma 支气管哮喘 Glaucoma 青光眼,Hiroaki Shimokawa, Akira Takeshita,Rho-
6、Kinase Is an Important Therapeutic Target in Cardiovascular Medicine,Arterioscler Thromb Vasc Biol.2005;25:1767-1775.),Rho激酶抑制剂,国际上已经用于临床应用的Rho激酶抑制剂，有盐酸法舒地尔（fasudil hydrochloifde，FH，又名 HA1077,AT877） 国内产品已经2004年上市，商品名： 另有两种化合物处于研究中：Y-27632和H-1152P,盐酸法舒地尔 fasudil hydrochloifde,不同的Rho激酶抑制剂的对各种激酶的抑制情况IC
7、50 (M),fasudil(HA1077) H-1152P Y-27632 ROK 0.158 0.0120 0.162 AuroraA 100 0.745 100 GSK3 100 60.7 50.0 AMPK 100 100 100 KK 100 100 100 CK2 100 100 100 Erk1 100 100 100 P38 100 100 100 JNK11 100 100 100 MKK4 100 16.9 100 Abl 100 7.77 100 Src 100 3.06 100 EGFR 100 50.0 100,神经血管单元和多靶点治疗,2002年美国神经疾病和脑卒中
8、研究院在对“脑卒中进展回顾的报告”中明确提出了“神经血管单元（neurovascular unit， NVU）”概念，并于2004年又进一步补充 脑卒中后可导致NVU功能异常，NVU功能异常可进一步导致脑卒中后脑损害的进展；要求在细胞、分子和基因水平研究NVU功能及机制。,Rho激酶在神经血管单元中的作用,Rho激酶作用于肌动蛋白骨架系统引起轴突生长锥回缩及塌陷, 从而抑制轴突生长。 决定轴突、树突生长及相互构成联系的重要信号蛋白,对神经发育和重塑起重要作用。 Rho 激酶信号通路异常可影响神经网络形成。,Rho 激酶与脑卒中（Stroke）,啮齿类动物研究显示：ROK抑制剂对急性期多发性脑梗
9、死动物模型及NMDA兴奋毒性模型具有神经保护作用。 神经复性抑制因子（NgR1、NOGO-A）及神经生长抑制因子等存在于梗死及发生坏死的半暗带区域，过度激活ROK，抑制神经复性及再生，说明ROK抑制剂对脑卒中恢复期有效。 抑制炎性反应，抑制脑卒中迟发性神经元丧失。,减少脑梗死体积和促进神经功能恢复,Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用,Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用,增加局部脑血流量，上调内皮细胞NOS活性，减少梗死体积。,Regional cerebral blood flow. Cerebral blood flow 2hours after MCA occlusion
10、in mice treated with vehicle or 10mg/kg fasudil for 2 days were measured by 14C-iodoantipyrine autoradiography. Two independent experiments yielded similarresults.,Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用,Rho激酶抑制剂可促进轴突生长。,Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用,Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用,国外的一项设计严格，前瞻性、双盲、对照临床研究证实，48h内应用盐酸法舒地尔可显著改善急性脑栓塞患者的神经
11、功能及临床结局。,Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用,Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用,Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用,Rho 激酶抑制剂对急性缺血性脑卒中的作用,结论：在急性脑卒中发病后48h内应用法舒地尔fasudil进行治疗可显著改善患者的临床结局。本研究发现法舒地尔fasudil是治疗缺血性脑卒中有效且安全的药物,Rho激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用,脑血管痉挛（CVS）是动脉瘤性蛛网膜下腔出血（SAH）患者导致致残和死亡的一个主要原因。 Rho激酶通过直接磷酸化MLC及抑制MLCP活性促进MLC的磷酸化,增强血管平滑肌的收缩,它与依赖Ca2+的激活通路协
12、同作用,在CVS的发病机制中发挥重要作用。 盐酸法舒地尔通过抑制Rho激酶，主要扩张中、小动脉（如Willis环等），改善脑血管痉挛引起的脑缺血症状,更有效更安全的治疗CVS。,Rho激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用,国内进行的随机、双盲、双模拟、阳性对照临床研究证实，应用盐酸法舒地尔与经典预防脑血管痉挛药品尼莫地平比较疗效不具有显著性差异，但使用安全性，方便性方面优于尼莫地平。,Rho激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用,两组疗效评价情况及比较（PP分析）,Rho激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用,两组疗效评价情况及比较（ITT分析）,Rho激酶抑制剂在脑血管痉挛中的应用,随机开放式研究：72例，盐酸法
13、舒地尔fasudil与尼莫地平对照。对SAH血管痉挛及神经系统损害结局的观察，显示fasudil预防血管痉挛优于尼莫地平，其副作用少于尼莫地平，且具有神经保护作用。,Effect of fasudil hydrochloride, a protein kinase inhibitor, on cerebral vasospasm and delayed cerebral ischemic symptoms after aneurysmal subarachnoid hemorrhage. Neurol Med Chir (Tokyo). 2006 Sep;46(9):421-8.,从1995年
14、6月2001年6月，近52,000例动脉瘤性蛛网膜下腔出血患者接受了法舒地尔的治疗，以防治其脑血管痉挛。已证实患者对法舒地尔具有良好的耐受性。,Shibuya M, Hirai S, Seto M, Satoh S, et al Effects of fasudil in acute ischemic stroke: results of a prospective placebo-controlled double-blind trial. J Neurol Sci. 2005 Nov 15;238(1-2):31-9.,Rho激酶在心血管系统疾病中的作用,内皮细胞 功能不全,VSMC 增殖
15、迁移,VSMC 表型改变,VSMC 收缩性,炎性细胞 粘附,基质金属 蛋白酶,血管重构,血管增生,血栓形成,血管收缩性,血管功能,内膜,中膜,急性冠脉综合征,滋养血管 密度,炎性细胞 浸润,肌成纤维 细胞,外膜,Rho激酶抑制剂 对稳定性心绞痛患者血管的舒张作用,11例稳定性心绞痛患者和9例正常者行冠脉造影，先后静脉给予硝酸甘油和法舒地尔，观测对冠状动脉内径的影响。显示法舒地尔可以特异性扩张狭窄部分的血管。,Otsuka T, et al. Circ J. 2006;70(4):402-8.,Rho激酶抑制剂 对稳定性心绞痛患者的运动耐量作用,84例稳定性心绞痛患者分为两组，一组服用安慰剂，一
16、组服法舒地尔(80mg/d)，8周后行运动试验，实验证明法舒地尔可有效提高稳定性心绞痛患者的运动耐量,Vicari RM,et al. J Am Coll Cardiol. 2005;46(10):1803-11.,Rho激酶抑制剂 抑制猪冠状动脉支架内内膜增生,支架前,支架后,4周后,对照,法舒地尔,Rho激酶抑制剂 抑制猪冠状动脉支架内内膜增生,Matsumoto Y, et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2004;24(1):181-6.,Rho激酶与高血压,Rho激酶与高血压病有关的证据： 高血压发病前Rho激酶活性增高 血管反应性增高与Rho激
17、酶异常激活有关 Rho激酶参与高血压继发性病变（动脉硬化） 可治疗初期高血压 防治高血压继发性血管病变,Rho激酶与肾脏疾病,Rho激酶抑制剂可显著改善单侧输尿管阻塞引起的小管间质纤维化 长期应用Rho激酶抑制剂可预防和治疗高血压性肾小球硬化。 Rho激酶抑制剂的肾脏保护作用机制 抑制细胞外基质基因的表达 抑制单核细胞/巨噬细胞浸润 抑制氧化应激 抑制上调eNOS基因的表达,Rho激酶与糖尿病,Rho/Rho-kinase是胰岛素信号通路的环节，与胰岛素抵抗的形成、胰岛素作用的调节及血糖的稳定有关。 RhoA在成熟的胰岛beta细胞表达，糖尿病小鼠模型胰岛beta细胞RhoA 表达显著增高 应用Rho激酶抑制剂，观察到insulin mRNA转录明显增高，胰岛素启动子的活性显著增强 Rho/Rho-kinase激活抑制糖尿病胰岛素表达 抑制Rho/Rho-kinase通路可以增加胰岛素基因的转录。,谢 谢 大 家,