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1、,siRNA干预树突状细胞CD40分子表达的实验研究,A Study of siRNA on inhibiting the Expression of Dendritic Cell CD40,吉林工程技术师范学院 - 消化内科,杨 2012.04,IBD的发病机制 实验内容 实验结果 讨论 结论,吉林工程技术师范学院,炎症性肠病（Inflammatory bowl disease IBD）,IBD是临床常见的肠道炎性疾病，包括溃疡性结肠炎（Ulcerative co1itis, UC）和克罗恩病（Crohn,s disease，CD）两大类。 IBD的发病机制可以概括为：1、环境因素；2、遗传
2、因素；3、感染因素；4、免疫耐受。 IBD的治疗：1、常规治疗；2、免疫调节治疗；3、生物调控等。,吉林工程技术师范学院IBD的发病机制,IBD的发病机制-环境因素,随着社会的发展，全球IBD的发病率呈明显的上升趋势，首先出现在社会经济高度发达的北美、北欧，继而发生在西欧、南欧，最近才是日本、南美。这种变化产生的主要原因大都是环境因素的改变所导致，大量研究表明，许多看似无关的环境因素，诸如吸烟、饮食、药物、地理环境、社会地位、应激、肠道固有菌群、肠粘膜的渗透性和阑尾切除等这些因素在不同程度上与IBD息息相关。 目前公认的假说认为：环境变得越来越清洁，导致儿童期肠道免疫系统接受的外源刺激减弱，由
3、于早年形成的“免疫耐受”不完善，其对肠道抗原刺激发生的免疫反应的自身调节就容易发生障碍，故出现IBD发病率逐渐上升。,吉林工程技术师范学院 环境因素,IBD的发病机制-遗传因素,家族聚集性和种族差异性：IBD患者一级亲属发病率，明显高于普通人群。 基因：全基因组相关研究(GWAS)已展开，且成为IBD研究的主要手段。 阳性家族史：IBD遗传因素中遗传易感性最为重要，其中阳性家族史是最大的“危险因子” IBD不仅是多基因病，而且也是遗传异质性疾病，患者在一定的环境因素作用下因遗传易感而最终发病。,吉林工程技术师范学院遗传因素,IBD的发病机制-感染因素,微生物致病性的观点认为IBD(特别是CD)
4、针对自身正常肠道菌群丛的异常免疫反应引起的。其证据为：CD病变的部位在肠菌浓度最高的末回与结肠。CD患者粪便转流术使炎症减轻，复原后炎症加重。各种动物实验要有细菌定植才发生结肠炎症，隔离的肠攀导入细菌可出现早期IBD的表现。临床上应用抗生素和微生态制剂有一定的临床疗效。 感染与IBD的关系：肠道感染可以与IBD类似。感染比IBD更常见。感染使IBD的病程变得更加复杂。,吉林工程技术师范学院 感染因素,IBD的发病机制-免疫耐受,免疫调节细胞 。 人类防御素。 抗原呈递细胞 。 人类白细胞抗原 。 自身抗体因素 。 Chemerin和脂联素 。,吉林大学第二临床医院 免疫耐受,IBD的发病机制-
5、免疫耐受,肠道粘膜免疫反应的激活是导致IBD发生、发展和转归过程的直接原因。 免疫调节T细胞，能够产生各种细胞因子，引起并逐步放大粘膜炎症，形成肉眼和镜下的IBD病理及临床表现。经典的“双信号模式”即免疫应答的启动、发展过程中，T细胞的活化需要两个信号。其中第二信号即协同刺激信号，它能够促进T细胞的克隆、细胞因子的分泌及产生效应。CD40/CD40L即第二信号，它属于TNF-TNF受体超家族，通过干预调节CD40/CD40L会有助于IBD的治疗。,吉林工程技术师范学院 免疫耐受,IBD的发病机制,Sands概括了近10年IBD发病机制研究的标志性成果：(1)肠道免疫耐受控制着生理性炎症；(2)
6、肠道菌群在IBD发病中起着关键作用；(3)用基因动物模型显示遗传免疫和黏膜屏障的多种紊乱形成IBD的各种亚型；(4)NOD2与CD的发生密切相关，且与天然免疫缺陷有关；(5)新生物技术快速发展，研制出多种新的生物治疗药物；(6)TNF单抗对CD与UC产生较好疗效。,吉林工程技术师范学院IBD的发病机制,IBD的干预与治疗,常规治疗：1、支持治疗；2、常规药物治疗；3、手术治疗。 免疫调节治疗。 生物调控：1、免疫调控-抗TNF-抗体英夫利昔(Infliximab) 、胸腺肽；2、RNAi干预治疗。 阻断CD40途径用于IBD的治疗及展望 。,吉林工程技术师范学院 IBD的治疗,实验材料与方法,
7、siRNA的设计与合成 pHL-CD40真核表达载体的构建 感受态细胞的制备 重组质粒的提取 免疫磁珠分离DCs 总RNA的提取、cDNA的逆转录,吉林工程技术师范学院 实验内容,实验材料与方法,磷酸钙法瞬时转染CD40分子 “Western blot、PCR”法检测树突状细胞CD40蛋白质及mRNA的表达 统计学分析,吉林工程技术师范学院 实验内容,实验研究的目的及意义,阐明CD40在IBD中的作用 确定siRNA的高效性 通过RNAi干预CD40分子的表达治疗IBD的动物实验与临床研究奠定了理论基础。从而为IBD的治疗提供新的途径,吉林工程技术师范学院实验内容,实验结果,吉林工程技术师范学
8、院 实验结果,1(sense）：5-GATCCGCTGTGAAGATCAGAAGCTTTCAAGAGA AGCTTCTGATCTTCACAGCTTA-3； (antisense)： 5- AGCTTAAGCTGTGAAGATCAGAAGCT TCTCTTGAA AGCTTCTGATCT TCACAGCG-3; 2(sense)： 5-GATCC GATCCTGTGGAGATAGAAG TTCAAGAGA CTTCTATCTCCACAGGATCTTA-3； (antisense)： 5-AGCTT AAGATCCTGTGGAGATAGAAG TCTCTTGAA CTCTATCTCCACAGGAT
9、CG-3。,CD40基因的siRNA cDNA序列,1根据GenBank提供的大鼠CD40基因序列(NM134360)，按照siRNA的设计原则，利用Ambion公司提供的网上在线设计工具(wwwambioncom/techlib/misc/psilencercon-verterhtm1) 2根据RNA干涉载体pSilencer4.1-CMV neo的要求分别于上、下游引入BamH I和Hid酶切位点。构建siRNA表达质粒，合成正义、反义RNA片段各两条，每段各设计一对55个碱基的序列 。经北京华大基因测序成功,高效干涉载体双酶切鉴定,吉林工程技术师范学院 实验结果与分析,Marker ：D
10、L2000 1.双酶切鉴定重组表达高效载体pSilencer及干涉片段siCD40-1的构建情况 2.空白组 3.双酶切鉴定重组表达高效载体pSilencer及干涉片段siCD40-2的构建情况,图1 高效干涉载体双酶切鉴定,吉林工程技术师范学院 实验结果与分析,pHL-CD40真核表达载体的构建,根据大鼠CD40基因的编码区序列设计引物，并在上、下游引物中分别引入Bgl和EcoRI限制性内切酶酶切位点。 上、下游引物序列分别为： 5-CCGAATTCATGAACGGAAGAGTG-3 5-CGGATCCTCAAGTTGTCTTAGTC-3 以大鼠cDNA文库为模板，通过进行PCR扩增。所得P
11、CR产物用琼脂糖凝胶电泳检测。,CD40基因的钓取,吉林工程技术师范学院 实验结果与分析,M：DL2000 Marker 1.目的片段扩增的CD40的cDNA,图2 PCR产物的电泳检测,pHL真核表达载体的制备,吉林工程技术师范学院 实验结果与分析,M：HindMarker 1.酶切pHL片段 2.pHL载体,图3 CD40 cDNA的pHL质粒的电泳检测,将本实验室保存的pHL质粒转化感受态大肠杆菌DH5，提取质粒，并进行酶切鉴定,pHL-CD40重组表达载体的构建,吉林工程技术师范学院 实验结果与分析,图4 pHL-CD40重组质粒酶切鉴定,M：DL2000 Marker 1.2.pHL
12、-CD40重组质粒用Bgl和EcoRI双酶切,将pHL载体及CD40的PCR产物cDNA片段分别用Bgl和EcoRI进行双酶切，回收CD40片段及pHL酶切片段，进行连接并转化大肠杆菌DH5，提取质粒进行重组质粒的酶切鉴定。,Western blot检测树突状细胞CD40分子蛋白表达的影响,1.制备细胞裂解液 2.SDS-PAGE电泳分离及电转移:siRNA转染DC40配置48h后，经12SDS-PAGE电泳后转膜，5%脱脂奶粉的杂交袋中，37.0，封闭1小时，一抗(兔抗鼠CD40多克隆抗体1：1000)4孵育过夜，TBST洗膜10min3次，二抗(HRP-羊抗鼠IgG 1：5000)室温孵育
13、1h，ECL发光试剂对PVDF膜进行显色反应，扫描并计算光密度值。进行发光检测。每组样本各重复实验3次，计算平均值和标准差。,吉林工程技术师范学院 实验结果,Western blot检测树突状细胞CD40分子蛋白表达的影响,吉林工程技术师范学院 实验结果与分析,图5 免疫印迹法检测转染后的树突状细胞CD40分子的蛋白表达水平,A.在树突状细胞中转染过表达重组质粒pHL-CD40，并利用western blot检测CD40蛋白表达情况。GAPDH 为内参。 B.在树突状细胞中转染过表达重组质粒pSilencer-CD40-1，并利用western blot检测CD40蛋白表达情况。GAPDH 为
14、内参。 C.在树突状细胞中转染过表达重组质粒pSilencer-CD40-2，并利用western blot检测CD40蛋白表达情况。GAPDH 为内参。,PCR检测树突状细胞CD40分子mRNA表达的影响,1.收集处对数长期细胞，提取各组细胞总RNA，反转录为cDNA。 2.具备PCR反应条件。 3.PCR产物通过电泳鉴定，使用凝胶成像分析系统分析，来描述mRNA相对的表达量。每组样本各重复实验3次，计算平均值和标准差。,吉林工程技术师范学院 结果与分析实验,PCR检测树突状细胞CD40分子mRNA表达的影响,吉林工程技术师范学院 实验结果与分析,图6 PCR检测过表达重组质粒pHL-CD4
15、0和干涉重组质粒pSilencer-CD40-1的转染对树突状细胞CD40分子mRNA表达的影响,1.树突状细胞转染过表达重组质粒pHL-CD40，提取总RNA，逆转录成cDNA后PCR检测CD40分子mRNA表达情况。 2.没进行转染的空白对照组。 3.树突状细胞转染干涉重组质粒pSilencer-CD40-1，提取总RNA，逆转录成cDNA后PCR检测CD40分子mRNA表达情况。 GAPDH为内参。,讨论,1.如何成功构建了RNA干涉表达载体pSilencer-CD40及RNAi的技术特点。 2.阐述CD40分子在IBD中的作用。,吉林工程技术师范学院 讨论,结论,通过本实验证实RNAi干预技术能够有效的干预大鼠树突状细胞CD40分子的表达。试验组较对照组CD40分子的mRNA表达量下调了57.21%。蛋白表达亦明显降低，抑制率为60%（P0.05），差异有统计学意义。这一结果为IBD RNA干预治疗的动物实验及临床应用奠定了实验基础 。,吉林工程技术师范学院 结论,谢 谢！,