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1、器材准备,医学微生物学实验 综合性实验一,脓汁和粪便标本中病原菌的检测（五） 糖发酵试验 药敏试验 血浆凝固酶试验 半固体接种法,糖发酵试验,不同细菌具有不同的糖分解酶，分解各种糖的代谢产物也各不相同，有的产酸，有的产酸又产气，据此，可以鉴别各种细菌。 糖发酵管：葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖。 指示剂：溴甲酚紫，PH6.8为紫色，5.2为黄色。 原理：多糖单糖丙酮酸、酸性产物(产气) pH指示剂呈酸性变色。 结果:培养基变色无气泡“+” ，培养基变色有气泡“”，培养基不变色“-”。 应用：观察细菌对糖的分解情况，常用于肠道杆菌的鉴定。,细菌的糖发酵试验P16 甲,乙紫黑葡萄糖,乳糖 丙,
2、丁粉红葡萄糖,乳糖,37，24小时,甲，乙，丙 ，丁,实验分组,俩俩相对4人为一组,组号编在电源插座上。 每组按从前到后,从左到右的顺序，分别编号为甲、乙、丙、丁。,甲 乙 4 丙 丁,甲 乙 3 丙 丁,甲 乙 2 丙 丁,甲 乙 1 丙 丁,甲 乙 5 丙 丁,甲 乙 8 丙 丁,甲 乙 7 丙 丁,甲 乙 6 丙 丁,甲 乙 10 丙 丁,甲 乙 9 丙 丁,讲 台,细菌药物敏感性试验P20,磺胺1907年发现，1935年临床应用。青霉素1929年发现，1945年临床应用。 我国住院病人抗菌素使用率达70%，新生儿病房抗菌素使用率达100%。 为了避免抗菌药物使用的盲目性，防止因不合理用
3、药，导致耐药性细菌的增多、药物中毒、治疗失败、菌群失调等问题的发生，用药前（时），做药物敏感性试验。,药物敏感性试验纸片扩散法 将含有定量抗菌素的纸片，平贴在已经接种了试验细菌的平板上。纸片中的抗菌素吸收培养基的水分，溶解后不断向周围扩散，形成递减的梯度浓度。敏感细菌在纸片周围的生长受到抑制，而形成没有细菌生长的抑菌圈 依抑菌圈的有无、大小来判断敏感性。 敏感（Sensitive ）：试验细菌所引起的感染，可以用常用剂量的某种抗菌药物治愈。 耐药（Resistant ）：试验细菌引起的感染，不能用该种抗菌药物治愈。 试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密集为宜。,实验分工（每人1块
4、平板）,甲黄色菌液平板 + 青、链、庆纸片。 乙白色菌液平板 + 青、链、庆纸片。 丙紫黑菌液平板 + 青、链、庆纸片。 丁粉红菌液平板 + 青、链、庆纸片。,实验方法,接种环取菌液36ul2环（注意：操作时，不得同时握持菌液管和平板，以免菌液倒出来，造成污染）。平板密集划线接种细菌（纱窗样）。设计三点，三点之间等边三角距离，点距离平皿边缘约15mm。作标记：青、链、庆。镊子火焰消毒，夹取相应的药物纸片，平贴在已设定的位置上，按压，最后镊子火焰灭菌。371824小时培养，观察结果。 试验菌用量以对照琼脂平板表面生长的菌落呈密集或半密集为宜。,灭菌 取样,甲黄色菌液 乙白色菌液 丙紫黑菌液 丁粉
5、红菌液,6ul+6ul,纸片扩散法：菌液 密集涂布平板 标记:青、链、庆 贴青霉素、链霉素、庆大霉素纸片 按压 倒置培养1824小时 观察结果。,标记,贴抗菌素纸片,血浆凝固酶试验P17,致病性葡萄球菌能产生血浆凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为纤维蛋白,附着于细菌表面,产生凝固。 葡萄球菌产生两种凝固酶:一种是与细胞壁结合的凝固酶,为结合凝固酶;另一种是细胞释放于培养基中,为游离凝固酶；二者抗原性不同。 在体内，凝固的血浆沉积在菌体表面，阻碍吞噬细胞的吞噬和杀菌物质的破坏，从而有利于细菌的生长繁殖、引起感染。 体外试验有试管法和玻片法两种。 试管法检测游离凝固酶，结果准确。 玻片法只能检测结
6、合凝固酶，比较简便、常作为快速筛选技术（金黄色葡萄球菌中有10%15%可呈阴性反应）。,凝固酶试验试管法： 游离凝固酶凝血酶 纤维蛋白原纤维蛋白血浆凝固 凝固酶试验玻片法： 结合凝固酶（菌体表面） 纤维蛋白原纤维蛋白细菌凝集,玻片法,取二滴兔血浆置于洁净的玻片上。 分别用接种环取白色和黄色菌苔(23个菌落的菌量)与血浆研磨混合，立即观察结果。 出现明显凝块为阳性，否则为阴性。 白色菌苔容易混合均匀，黄色菌苔常涂抹不开。 反复旋转或侧倾载玻片，让菌液流动起来，结果更明显。,载玻片1张,兔血浆各15ul,右侧血浆与白色菌苔混合,左侧血浆与黄色菌苔混合,半固体接种法P11 具有鞭毛能够真正运动的细菌
7、，在半固体培基中, 能冲破低浓度琼脂的阻力，自接种部位向周围移 动扩散生长，培养基呈扩散云雾状混浊状态。 无鞭毛不能运动的细菌，只能沿着穿刺线生长 繁殖，穿刺线边缘清晰，周围培养基清澈透明。 方法：接种针斜面取菌，从半固体培养基中心，垂直刺入，到达培养基底部4/5处，再循原来的路线，退出接种针。 甲，乙紫黑 。丙，丁粉红。,半固体接种法P11 甲，乙紫黑 丙，丁粉红 标记:组号,颜色,37,24小时,安全警告,本次实验（糖发酵试验、药敏试验、血浆凝固酶试验和半固体接种）操作一次，可能产生几百个微生物气溶胶颗粒。 气溶胶粒径100um沉降很快,50um在0.4s内扩散开,5um通过呼吸道直接到达
8、肺泡。 Pike博士对实验室感染统计分析结果发现，不明原因的感染高达82%，大多数是气溶胶在空气中扩散引起的。 实验时应坐着，在酒精灯半径20厘米范围内操作，保持安静、有序，尽量少说话、少走动，以免感染病原菌。,思考题,细菌生化反应在感染性疾病诊断中有何重要意义? 为什么要在发酵管液面上方大约23cm处切割？ 培养时，微量糖发酵管管口不能朝上，为什么？ 抗生素敏感性实验有何实际意义? 血浆凝固酶试验观察完毕，应将载玻片立即放入消毒缸内，为什么? 半固体穿刺接种时，为什么要强调“原路返回”? 为保证实验结果的可靠性，你认为上述试验应还设立哪些对照?,细菌的糖发酵试验P16 甲紫黑葡萄糖，乙 紫黑乳糖， 丙粉红葡萄糖，丁 粉红乳糖 。 细菌的药敏试验P20（菌液） 甲黄色平板 + 青、链、庆纸片 乙白色平板 + 青、链、庆纸片 丙紫黑平板 + 青、链、庆纸片 丁粉红平板 + 青、链、庆纸片 血浆凝固酶试验P17 兔血浆15ul+黄色,白色 半固体接种法P11 甲,乙紫黑 丙,丁粉红,微量发酵管管口朝下， 37培养1824小时。,常用器材摆放顺序：电源插座试管架酒精灯污物盘。 试管架上器材：按接种针、接种环、油性笔和打火机的顺序，分别放置在试管架中间两行，靠近电源插座一侧。 器材使用以后，必须放回原处，依次摆整齐。,实验室器材 整齐有序,