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1、,蛋白质分析的意义,基础科学研究 这主要是生命科学研究向分析学家提出的课题。在生命科学研究中，人们需要了解各种蛋白质的组成、结构与功能的关系，蛋白质的存在形态以及与小分子，甚至金属离子的相互作用等等。 食品的鉴定与评价 蛋白质是生物体的重要营养物质，也是食品的重要营养指标。测定食品店品中蛋白质的含量对指导食品的加工工艺的改革、优化保健食品的配方以及合理配膳均有重要意义。 评价健康、诊断疾病 人体内的酸碱平衡，电解质平衡，遗传信息的传递，物质的代谢和运转都与蛋白质有关。,蛋白质的分析方法,一类是利用蛋白质的共性，如含氮，含肽键和折射率等性质测量蛋白质的含量； 二是利用蛋白质中某些特定的氨基酸残基
2、、芳香基团、酸性和碱性基团等测量蛋白质的含量。 我们熟悉的克氏定氮法是第一类分析方法中的一种，而本文要介绍的等电聚焦法属第二类分析方法。克氏定氮法分析蛋白质只可通过测定待测物的总含氮量进而推出蛋白质含量，不能分析出所含蛋白质种类及各类含量而电泳法正好弥补了这个不足。,回顾一下等电点的有关知识,设HA为一两性物质，处于等电点时 x(H2A+)=x(A-),即 所以，pH=1/2(pKa1+pKa2)=pI(等电点) 氨基酸的等电点计算可以参照上述公式。,蛋白质是由a氨基酸组成，氨基酸通过肽链连接起来成为多肽，长的多肽就被称为蛋白质。氨基酸的种类和序列决定蛋白质的性质，蛋白质末端有-NH3+， -
3、COO- ，侧链有-NH3+，-COO-，-S-等酸、碱性基团，可见蛋白质为两性物质，有等电点。,电泳的原理,溶液中任何物质由于其中本身的解离或表面吸附其他带 电质点而带电，带电颗粒在电场中移动，移动方向取决于它 们的带电符号。电泳技术就是由各种带电粒子在电场中迁移 率不同而进行分离的一种技术。生物大分子如蛋白质、核 酸、多糖等常以颗粒分散在溶液中，带电的蛋白质分子在电 场中会朝着与自己所带电荷相反方向移动，根据各种蛋白质 分子的移动速度不同，对各种蛋白质进行分离。,在电场中，速度通常用泳动度来表示。泳动度是带电颗粒在单位电场强度下的泳动速度。即： U=v/E=(d/t)/(V/L)=(d/V
4、)*(L/t) 式中u-泳动度，cm2/(V.s) V-泳动速度，cm/s E-电场强度,V/cm d-颗粒泳动距离，cm L-支持物有效长度，cm V-实际电压，V t-通电时间，s 通过测量d,L,V,t,即可计算出颗粒的泳动度，而当外界因素一定，泳动度是一物质的特性，通过测泳动度，可以鉴别待测物。,蛋白质等电聚焦电泳的基本原理,1分离成为可能： 由于各种蛋白质的氨基酸组成不同，因而有不同的等电点。当pHpI时，蛋白带负电荷，在电场的作用下向正极移动；不同蛋白质的搭配组成差别很大，因此蛋白质的等电点范围很宽。 等电聚焦电泳技术就是在电泳支持介质中加入载体两性电解质，通以直流电后在正负极之间
5、形成稳定、连续和线性的pH梯度，蛋白质在pH梯度凝胶中受电场力作用而泳动。当蛋白质分子一旦到达它的等电点位置，分子所带净电荷为0，就不能再迁移。因此蛋白质在与其本身pI相等的pH位置被聚焦成窄而稳定的区带。这种效应称之为“聚焦效应”，保证了蛋白质分离的高分辨率 ，是等电聚焦最为突出的优点。,2等电聚焦中pH梯度的形成： pH梯度的形成依靠有缓冲作用的两性载体电解质，载体电解质是一系列多氨基多羧基的混合物，其pI分布在2.5到10之间，载体两性电解质溶液的pH大约是该溶液pH范围的平均值。在没有电流时，所有载体两性分子都带电荷，所带总的净电荷为0。,第一步：,未通电时，带电分子无序排列,第二步：
6、,通过后最先在正极和负极形成pH梯度,第三步：,稳定的pH梯度形成,根据两性电解质的性质，在泳动过程中不断地与溶液交换质子，当达到平衡时，即两性电解质得失质子相等，不再出现质子交换，载体两性电解质至达等电点并停留在自己的pI区域 ，pI即是此处的pH值，于是载体电解质分离为连续pH不同的条带，从而形成连续的多个pH缓冲区。由于凝胶的防对流作用，可使pH梯度保持稳定不变。,3蛋白质分子分离了 如果把蛋白质溶液与载体两性电解 质混合，随时着pH梯度的形成，蛋白质 也将在自己的pI处沉淀下来。这样蛋白 质就被分离开了。再经过后续处理，就 可以对蛋白质进行定性和定量分析。,4载体两性物质的选择 作为好
7、的两性电解质载体必需符合下列要求: (1).有足够的缓冲能力，以便能形成pH梯度，而不受蛋白质等两性物质的影响。 (2).在等电点处必需有足够的电导，以便使一定的电流通过。而且要求各不同pI的载体有相同的电导系数，使整个体系中的电导均匀。 (3).相对分子质量要小，以便与被分离的高分子物质用分子筛或透析法分开。 (4).化学组分不同于被分离物质，以免干扰测定。 (5).不与被分离物质起化学反应，也不会引起被分离物质变化。,5支持pH梯度的介质选择 等电点聚焦电泳的主要条件之一是具有稳的pH梯度，以防上对流，避免已分离的物质再度混合。支持pH梯度的介质有如下两类 (1)密度梯度溶液 密度梯度溶液
8、由一个重溶液和一个轻溶液在梯度混合器中混合而成。最常用的密度梯度溶质是蔗糖，因为它对蛋白质无害且有保护作用。轻液一般用水。 (2)凝胶 等电点聚焦广泛使用凝胶作为支持pH梯度的介质。应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶。,等电点聚焦的显著优点,1.分辨率高 2.很稀的样品都可分离，且重现性好 3.可用于测定蛋白质或多肽的等电点,等电点聚焦的缺点,1.要求使用无盐溶液，而某些蛋白质在无盐溶液中溶解度低，可能产生沉淀； 2.样品中各组分都聚焦到其等电点，对一些在等电点不溶解或发生变性的蛋白质不适用。,参考文献： 郭勇 现代生化技术 科学出版社 周先碗 于晓倩 生物化学仪器分析与实验技术 化学工业出版社 李元宗 常文保 生化分析 高等教育出版社 赵永芳 生物化学技术原理及应用 科学出版社 蔡维平 基础化学实验（一）科学出版社 李克安 分析化学教程 北京大学出版社,谢谢!,自强不息止于至善,