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1、蛋白质核磁脉冲序列分析,阮科 ,生物大分子波谱学原理 吴季辉,脉冲序列基本原则,1、平衡态密度算符：SgIIZ，如15N标记蛋白，gHHZ+gNNZ 2、Delay时期，Hamilton算符为wIIZ + wSSZ + pJIzSz(两核体系），多核体系包括所有的化学位移算符和可能的J耦合算符 3、短的硬脉冲，一般只考虑脉冲所起的作用（90，180)，忽略化学位移和J演化 4、大多成形脉冲可以近似为90/180脉冲 5、Ix/y/zIx/y/z? Ix/y/zIx/y/zSx/y/z?,生物大分子波谱学原理 吴季辉,Ix,Iy,Iz,Ix,IySz,IzSz,脉冲序列分析基本思路,1、乘积算符
2、 基本单元：自旋回波，INEPT, COSY, TOCSY，NOESY 2、相干传递途径 从0开始，-1接收 自由进动时相干阶不变，只有脉冲才能改变相干阶 相干传递途径只画出想要的途径 3、相位循环 脉冲相位变化f，则相干阶Dp经历的相位变化为-fDp，即接收相位变化。 若相位循环为360/N，Dp为想要的相干阶变化，则Dp+nN （n=-3,-2-1,0,1,2,3)也被选择，其它被抑制,生物大分子波谱学原理 吴季辉,t1,t2,t1,-t2,脉冲序列分析基本思路,4、梯度场 可作为z向的脉冲处理 Gz 180 Gz：完善180度脉冲 乘积算符z向后，+强梯度：除去所有的非z向相干阶 梯度选
3、择Gz/gS RevINEPT Gz/gI： 5、间接维正交检波 States, TPPI，States-TPPI,生物大分子波谱学原理 吴季辉,http:/www.bmrb.wisc.edu/ref_info/statful.htm#1,第六章 同核核磁实验方法,COSY型实验 多量子谱 TOCSY NOESY ROESY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,同核核磁谱,生物大分子波谱学原理 吴季辉,同核核磁谱,在记录二维谱或三维谱等之前均需要记录一维氢谱，通常蛋白质溶于水或适当的缓冲液，加5-10%的D2O作为锁场介质。一维氢谱可用于检查样品是否有足够浓度，通常1632次采样要能得到足够信噪比的
4、谱图，甲基由于快速旋转呈现窄峰，而酰胺质子由于化学交换及14N的标量弛豫呈现宽峰； 一维氢谱还可用于检查样品的共振峰宽是否合理，蛋白质在高浓度下容易聚集从而增宽谱线，严重时甚至1H谱上看不到明显的峰，样品在这种条件下显然无法进行核磁研究；一维氢谱还可用于判别样品的化学位移分布情况，可判别样品是否变性，同时也对研究工作的难度提供一些预测。 蛋白质的一维氢谱一般不应该有非常尖的峰，若出现这种峰，往往是残留的小分子杂质，当然蛋白质的末端及loop区由于分子运动较快也会出现一些较尖的峰。,生物大分子波谱学原理 吴季辉,当样品条件不佳时，一维谱（以及若干信号强的二维谱如1H-15N HSQC）可用来探索
5、适合的样品条件。,生物大分子波谱学原理 吴季辉,ubiquitin（一种蛋白质，76个残基）的一维谱：a 水溶液中，b 箭头所指甲基区的放大，c 8M尿素溶液中，显示变性谱。,生物大分子波谱学原理 吴季辉,生物大分子波谱学原理 吴季辉,生物大分子波谱学原理 吴季辉,生物大分子波谱学原理 吴季辉,COSY型实验,COSY COSY的变型 Relayed COSY 多量子滤波COSY E-COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,COSY(correlated spectroscopy),是人们发明的第一种二维谱，同时也是研究蛋白质的最有用的二维谱之一。二个有
6、J偶合的核在COSY上可产生一个交叉峰，由于蛋白质（包括多数其他有机物）中有J偶合意味着这两个核最多通过3个共价键连接，所以COSY谱对于分子结构的拓扑连接可提供非常有价值的信息。,COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,COSY：脉冲序列分析,生物大分子波谱学原理 吴季辉,第一项为纵向磁化，第二项为多量子项，均不能被观测到； 第三项仍然是第一核的横向磁化，在检测期的频率同演化期类似，均是第一核的，对应于对角峰； 第四项是第二核的反向磁化，在检测期的频率为第二核的化学位移，与演化期不同，对应于交叉峰，这是二维谱最有意义的峰。,COSY：脉冲序列分析,生物大分子波谱学原理 吴季辉,COSY,生物
7、大分子波谱学原理 吴季辉,COSY的交叉峰为反相峰，这一点非常重要，决定了COSY型实验采样及处理时需要注意的问题。而交叉峰与对角峰在相位相差90度，对于谱图在对角线附近的质量有重要的影响。,COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,F 应用 在高场区由于化学位移的简并，谱峰的重叠，对角峰的干扰，通常不容易由COSY辨认整个自旋系统，在蛋白质COSY特别有用处是用于检查所谓的指纹区特别是酰胺质子与质子的交叉峰。在这个区域，脯氨酸由于没有氨基没有交叉峰；甘氨酸有两个质子故有两个交叉峰（除非两者的化学位移相同）；N端残基上的NH由于与水交换快也没有交叉峰。除特殊情况外，对于不大的蛋白质，所有的峰都应
8、该能找到。,COSY的变型,生物大分子波谱学原理 吴季辉,1. COSY- 第二个90度脉冲用小于90度的脉冲代替，其结果是： 交叉峰被减弱 多核体系中被动偶合产生的某些交叉峰被减弱，导致精细结构的变化，起到简化图谱的作用,COSY的变型,生物大分子波谱学原理 吴季辉,COSY的变型,生物大分子波谱学原理 吴季辉,COSY的变型,生物大分子波谱学原理 吴季辉,2 pre-TOCSY COSY 预饱和同时抑制接近水峰的H信号，因而从H到其他质子特别是NH的交叉峰减弱甚至消失，而NH到H的交叉峰往往淹没在水峰产生的t1噪声中。在pre-TOCSY COSY中，在COSY序列前插入一个短时间的TOC
9、SY混合脉冲，使其他质子的信号先传递给H，这样可部分恢复H到其他质子的信号。,COSY的变型,生物大分子波谱学原理 吴季辉,2QF-COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,2QF-COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,2QF-COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,3，4项为交叉峰，二维均是反相裂分，被动偶合呈同相裂分； 1，2项是对角峰，二维均是反相裂分，被动偶合呈同相裂分； 这两个对角峰的相位与交叉峰相同； 第5项也是对角峰，在两维均是反相峰（两个J偶合的作用均是反相），但相位与其他峰相差90度，在交叉峰调成吸收型时，这峰呈色散型，不过由于是反相峰，有部分相互抵销，其拖尾延伸不远，影响远
10、不如普通COSY。 结论：即使在三核体系，对角峰有色散成分，对交叉峰的影响也不大,2QF-COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,2QF-COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,3QF-COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,类似地可以记录三量子滤波COSY。至少三核体系才能产生三量子信号，要注意其交叉峰在两维对两个J偶合均呈反相峰即双反相峰，这同COSY及2QF-COSY不同。由于其交叉峰信号只有2QF-COSY的一半，一般用的不多。,E-COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,E-COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,E-COSY,生物大分子波谱学原理 吴季辉,双量子谱,生物大分子波谱学原理 吴季辉,双量子谱,生物大分子波谱学原理 吴季辉,