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1、蛋白质药物的PEG化学修饰 胡 涛,中国科学院过程工程研究所 生化工程国家重点实验室,1.迅速被体内酶降解 2.肾小球过滤清除 3.抗原抗体反应 4.溶解度差导致沉淀,蛋白质药物在使用中出现的问题,体外聚乙二醇修饰（PEG化）,(1)增大药物分子量，避免被肾小球过滤 (2)阻碍蛋白酶的降解作用 (3)屏蔽药物的免疫位点 (4)增加药物在体液中的溶解度 (5)与药物间的化学键在体内随时间水解，缓慢释放药物,+,蛋白或多肽,偶联物,聚乙二醇,CH3(-O-CH-CH)n-OH,生物医药 生物能源 生物材料 生物化学品 其它产品,生化工程 （生物化学工程，Biochemical Engineerin
2、g）,目 录,PEG修饰的国内外研究进展 PEG修饰剂的研发 PEG修饰方法 PEG修饰工艺的优化 PEG修饰产物的质量控制,一、PEG修饰的国内外研究进展,国际上PEG修饰技术的研究进展,美国Rutgers大学Davis教授70年代的工作 甲氧基PEG的应用 美国Enzon公司 美国最早从事PEG修饰蛋白质药物的公司 美国Shearwaters公司 各种PEG修饰剂的生产商 美国罗氏、先灵宝雅、安进 PEG药物：PEG-INF，PEG-G-CSF 其它：辉瑞、默克、葛兰素史克、施贵宝。,国内PEG修饰技术的研究进展,国家863重大机密项目：人工血液代用品的研制，1997-2000 中国科学院
3、重点项目：血液代用品和血液净化，2001-2005 国家重大科技专项课题创新药物和中药现代化：长效基因工程蛋白质和多肽制剂关键技术，2002-2005 国家863重点项目课题：核酸和多肽的修饰和剂型化技术，2007-2010 PEG修饰血红蛋白：I 期临床 （中科院过程所、凯正公司） PEG修饰G-CSF：III 期临床 （格兰百克）,修饰粒细胞集落刺激因子（rhG-CSF） 延长半衰期 修饰人肿瘤坏死因子 消除副作用 修饰白介素I受体拮抗剂（rhIL-1Ra） 延长半衰期 修饰牛胰核糖核酸酶（RNase） 提高抗肿瘤活性 修饰超氧化物歧化酶（SOD） 提高半衰期 修饰天冬酰氨酶（Aspart
4、ase） 克服免疫原性 提高半衰期 修饰人干扰素（IFN） 提高半衰期 修饰血红蛋白（Hb） 血液代用品 修饰胰岛素 提高半衰期,我国在PEG修饰蛋白质方面的一些工作,二、PEG修饰剂的研发,Sc-PEG 专利分析,以PEG-OH为原料的必然途径,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nOH + 光气 + NHS,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-O-N + NH2G-CSF,CH3OCH2CH2(OCH2CH2)nO-C-NHG-CSF,O,单链修饰：,(SC-PEG),Roche公司的长效干扰素产品专利分析,同样是以PEG-OH为原料的必然途径,双链修饰：,新的修饰策略,采用
5、新方法制备新的修饰剂,以PEG-COOH（CM-PEG)为原料的必然途径，已获专利,CH3(OCH2CH2)nOCH2CH2OH,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-O-N + NH2G-CSF,单链修饰：,CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NHG-CSF,O,(CM-PEG),我们的策略,以PEG-COOH为原料的必然途径,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH,O,O,O,双链修饰：,CH3(OCH2CH2)nOCH2COOH + Lysine,O,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-,O,(CH2)3,CH2,CH-C
6、-O-N,+ NH2IFN,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH,O,O,CH3(OCH2CH2)nO-CH2C-NH-,O,(CH2)3,CH2,CH-C-NH,IFN,1、PEG修饰剂的批量制备取得了成功,取 得 的 主 要 进 展,聚乙二醇修饰剂产品,三、药用蛋白的PEG修饰方法,创新技术（反应器技术和产物移走技术）,振荡反应器,流加反应器,缓释反应器,固相反应方式,膜耦合反应方式,双水相反应方式,Q. Yun, R. Yang, T. Chen, J. Bi, G. Ma, Z Su. J. Biotechnology, 2005, 118: 67-74,中国发明专利，申请号2
7、00510114930.0 中国发明专利，申请号0410029577,1.修饰反应器设计PEG-pellet 反应器,2.固相吸附法制备PEG修饰蛋白,固相吸附法与液相吸附法的比较,1峰：原蛋白；2峰：单修饰蛋白； 3峰：多修饰蛋白,PEG-INF的制备过程,G-CSF,PEG-G-CSF,3.PEG醛制备单修饰的药用蛋白,粒细胞集落刺激因子 (G-CSF),MW: 18.8kd (174 amino acids) pI: 6.1,1 thiol, 1 N-terminal, 4 lysines, Half life: 5 h,Weekly injection: 7 times,三批PEG30
8、-rhG-CSF产品的制备,取 得 的 主 要 进 展,PEG化重组人生长激素，批产量1-10g； PEG化降纤酶，批产量6000支； 环孢素A眼用微乳制剂，批产量5000支,PEG化G-CSF,2L修饰反应器 计算机程序控制 批产量3g 生产周期10天,修饰和剂型化产品质量达到国际先进水平,生产规模 产品质量 批次稳定性,1 2 3,1,2,3,1,2,3,(A),(B),(C),以分子量为30kDa的PEG修饰rhG-CSF为例： (A)三批产品的SDS-PAGE检测图谱 (B)三批产品的高效凝胶过滤检测图谱 (C)三批产品的园二色检测图谱,4. 引入巯基的方法制备PEG修饰蛋白,(2)
9、PEGylation,S,NH,+,(1) Thiolation,HS-(CH2)3-C-NH-Hb,N,O,O,PEG,-S-(CH2)3-C-NH-Hb,O,PEG,N,O,2-iminothiolane,NH2-Hb,Sangart公司是一家私营的生物制药公司，主要从事氧载体的研发和产业化,Hemospan - MP4,Phase I Sweden Status: Complete Phase Ib/II Sweden Status: Complete Phase II Sweden Status: Complete Phase II USA Status: Enrollment Com
10、plete Phase III Europe Status: Enrollment Complete,该PEG修饰产物的凝胶过滤分析,四、PEG修饰工艺的优化,PEG修饰反应参数的优化,建立反应动力学，包括位点反应动力学和蛋白分 子反应动力学，优化反应时间 优化反应的pH值 优化PEG与蛋白的摩尔比 优化反应体系,蛋白分子的修饰反应动力学,Weijun Li, Zhiguo Su. Quantitatively investigating monomethoxypolyethylene glycol modification of protein by capillary electropho
11、resis, J. Biochem. Biophys. Methods. 2004，59: 65-74,PEG修饰的位点反应动力学,PEG醛修饰药用蛋白的优化反应,单修饰产物的分离纯化,P1 P2,分离产物分析,P1凝胶过滤分析,膜耦合修饰工艺制备PEG化药用蛋白,五、PEG修饰产物的质量控制,IEF和SDS-PAGE鉴定PEG修饰蛋白,1,2,3,4,+,-,Iodine stain,Comassie blue stain,SDS-PAGE,IEF,1: Marker, 2: HbA, 3: -Hb 4: (Propyl-PEG5K)6-Hb 5: (Propyl-PEG5K)6-Hb,1:
12、 HbA, 2: -Hb 3: (Propyl-PEG5K)6-Hb 4: (Propyl-PEG5K)6-Hb,RP-HPLC分析胰蛋白酶切片段,质谱分析胰蛋白酶切片段,MALDI-TOF/TOF分析 PEG修饰位点在Val-1(),PEG修饰蛋白的结构鉴定,圆二色光谱鉴定,荧光光谱鉴定,RP-HPLC分析PEG修饰蛋白,蛋白质修饰剂及其制备方法和用途,中国发明专利， ZL01141745.5 制备分枝型聚乙二醇的新方法,中国发明专利， ZL02120740.2 带PEG长尾的蛋白质修饰剂的制法和用途,中国发明专利， ZL031100736.8 聚乙二醇羧酸的制备方法和其用途 ,中国发明专利
13、， ZL 200310113367.6 重组人复合干扰素-聚乙二醇偶联物的制备及其偶联产物,中国发明专利， ZL 200410029577.1 一种蛋白质交联剂及其交联方法,中国发明专利， ZL 03105003.4 一种分级分离制备血红蛋白偶联物的方法,中国发明专利， ZL 99106228.0 一种二醇聚合物动物血红蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利， ZL 99106229.9 一种二醇聚合物动物血清白蛋白偶联物的制备方法,中国发明专利 ZL 00123696.2 分子量均一的聚合物血红蛋白的制备方法,中国发明专利 ZL 01136190.5. 血红蛋白-人血清白蛋白偶联物制备血液代用品
14、及其制备方法,中国发明专利， ZL 03109622.0,蛋白质修饰国家发明专利11项（已授权）,PEG修饰的SCI论文,Q Yun, T Chen, G Zhang, J Bi, G Ma , Z Su. A novel polyethylene glycol derivative suitable for the preparation of mono-PEGylated protein. Biotech Lett, 27, 213-217, 2005 Q Yun, R Yang, T Chen, J Bi, G Ma, Z Su. Reproducible preparation and
15、 effective separation of PEGylated recombinant human granulocyte colony-stimulating factor with novel “PEG-pellet” PEGylation mode and ion-exchange chromatography. J Biotech. 2005, 118:67-74 Q Yun, M He, W Xing, J Bi, G Ma, Z Su, A novel tetrafunctional reagent for simultaneous intramolecular and in
16、termolecular cross-linking of bovine hemoglobin, Biotech Lett 26: 1359-1363, 2004. X Li, F Meng, G Ma , Z Su, A simple and efficient method for synthesis of carboxymethylated polyethyleneglycol. J Chem Res, In press. J Zhang, Y Zhao, Z Su, G Ma, Synthesis of Monomethoxy Poly(ethylene glycol) without
17、 Diol Poly(ethylene glycol), J Appl Polym Sci, 105, 37803786 (2007). J Zhang, Z Su, G Ma, Synthesis and Characterization of Hetetotelechelic poly(ethylene glycol)s with amino acid at one end and hydroxyl group at another end, J Appl Polym Sci, in press. C Zheng, J Bi, G Ma, Z Su, Polyethylene Glycol
18、 Improves Conjugation of Bovine Hemoglobin and Human Serum Albumin in a Controlled Ratio, Artificial Cells, Blood Substitutes, and Biotechnology, 35: 568584, 2007. C Zheng, G Ma, Zhiguo Su, Native PAGE eliminates the problem of PEG-SDS interaction in SDS-PAGE and provides an alternative to HPLC in characterization of protein PEGylation, Electrophoresis, 2007, 28: 2801-2807,谢谢大家！,