MAPKs在anti--β2GPI β2GPI复合物诱导THP--1细胞表达TF中的作用探讨.pdf

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1、 江蒸太堂堂位论玄 摘要 目的： 本课题组前期研究证明，T o l l 样受体4 ( T L R 4 ) 及相关分子髓样分化因子 8 8 ( M y D 8 8 ) 、髓样分化蛋白- 2 ( M D - 2 ) 参与抗p 2 糖蛋白I 抗体D 2 糖蛋白I ( a n t i p 2 G P I p 2 G P I ) 复合物诱导人单核细胞株T H P - l 表达组织因子( T F ) ，且部 分依赖膜联蛋白I I ( A N X 2 ) ，成为抗磷脂综合征( a n t i p h o s p h o l i p i ds y n d r o m e ，A P S ) 血栓形成的机制之一。

2、本文着重探讨T L R 4 信号通路中另一分子家族 一丝裂原活化蛋白激酶( m i t o g e n a c t i v a t e dp r o t e i nk i n a s e s ，M A P K s ) 在 a n t i I B 2 G P I f 1 2 G P I 复合物诱导n 口1 细胞表达盯中的作用及其信号转导机制。 方法： 1 、利用实时定量P C R ( R e a l - t i m eq u a n t i t a t i v eP C R ，R T - q P C R ) 检测a n t i - p 2 G P I p 2 G P I 复合物诱导n 口- l

3、细胞T Fm R N A 的表达，采用试剂盒检测细胞T F 活性。 2 、W e s t e r nb l o t i n g 检测a n t i - 1 3 2 G P I 1 3 2 G P I 复合物刺激T H P - 1 细胞M A P K s ( p 3 8 、 E R K l 2 及J N K l 2 ) 表达及其磷酸化情况，并检测a n t i - 1 3 2 G P I 1 3 2 G P I 刺激的时 效性和特异性。 3 、采用T L R 4 抑制剂T A K 2 4 2 预处理T H P 1 细胞，观察其对a n t i 1 3 2 G P I 1 3 2 G P I 复合

4、物诱导T I 诤- 1 细胞p 3 8 、E R K l 2 及J N K l 2 磷酸化的干预作用。 4 、采用I R A K s 抑制剂s c - 2 0 4 0 1 3 预处理n P - 1 细胞，观察其对a n t i - 1 3 2 G P I 1 3 2 G P I 复合物诱导T H P l 细胞p 3 8 、E R K l 2 及J N K l 2 磷酸化的干预作用。 5 、采用M A P K s 抑制剂S B 2 0 3 5 8 0 ( p 3 8 抑制剂) 、U 0 1 2 6 ( E R K l 2 抑制剂) 、 S P 6 0 0 1 2 5 ( J N K l 2 抑制

5、剂) 预处理T H P 1 细胞，观察其对a n t i 1 3 2 G P U l 3 2 G P I 复合 丛坠在垫垡：垦2 鱼I 垦2 鱼塑复盒翅透昱卫鱼坠! 细胞鑫达生殴佳目拯过 物诱导T H P - 1 细胞表达邗的干预作用。 结果： 1 、A n t i - p 2 G P I p 2 G P I 复合物( 1 0 0 嵋m 1 ) 能显著增加T H P - 1 细胞T Fm R N A 水 平及邛活性( 与未刺激对照比较p O 0 5 ) 。表明a n t i - 1 3 2 G P I 1 3 2 G P I 复合物诱导1 r I 口- l 细胞p 3 8 、E R K 和I

6、N K 磷 酸化具有特异性。 Ao - _ 一_ 卜冀 曩嘲甬悯 C ：一一一 ；昌；罱富= 譬窖；蛊= = 昌岁 y B - - l 鼍- _ 哪K 膺 图2 A n t i - 1 3 2 G P I 1 3 2 G P I 对p - p 3 8 M A P K 、p E R K l 2 及p J N K 表达的刺激特异性 菱叶-o-荤a名。髫叱 竹 0 2 O 翠-o-晕AJo o 一_ 足 琴-o-琴AJoo一鼍誓 采用W e s t e r n 蛋白印迹及条带灰度扫描分析p - p 3 8 、p - E R K 、p - J N K 蛋白 与相应总蛋白t - p 3 8 、t - E

7、 R K 、t - J N K 的比值。数据分别来自三次独立的实 验，用均数标准差( x4 - S D ) 来表示。 F i g2S p e c i f i ce f f e c t so fa n t i J 3 2 G P I 3 2 G P Io np - p 3 8 M A P K 、p - E R K l 2a n dp - J N K e x p r e s s i o ni nT H P - 1c e l l s W e s t e r nb l o ta n a l y s i sa n dd e n s i t o m e t r ya n a l y s i sf o rp

8、 - p 3 8 、p - E R K 、p - J N K p r o t e i nV St - p 3 8 、t - E R K 、t - J N Kp r o t e i n D a t a 丘0 mt h r e ei n d e p e n d e n t e x p r i m e n t sa r ep r e s e n t e da sm e a n s4 - S D ：p o 0 5V Sm e d i a 3 3 4M A P K J 抑制物对不同刺激物诱导T H P - I 细胞邛表达的影响 上述结果显示，M A P K s 参与到了a n t i - p 2 G P

9、 I 艮G P I 复合物诱导n 口- 1 细胞 活化过程中。那么M A P K s 是否参与到了a n t i - 3 2 G P I J 3 2 G P I 复合物诱导n P 一1 细 胞T F 的表达过程，本研究采用相关抑制剂进行试验，M A P K s 抑制剂对不同刺 激物诱导n 口1 细胞T F 表达是否存在影响? 结果显示：p 3 8 抑制舢B 2 0 3 5 8 0 、 E R K l 2 抑制剂- U 0 1 2 6 及J N K 抑制剂- - S P 6 0 0 1 2 5 分别单独作用细胞，可使 a n t i B 2 G P I p 2 G P I 以及L P S 刺激的

10、T Fm R N A 表达及耶活性均下降，抑制率约 为3 0 - 4 0 ( 图3 A 、4 A ) ，与无抑制剂比较，差异明显( 刚0 5 ) ；若同时使用二 种抑制剂( S B 2 0 3 5 8 0 A J 0 1 2 6 ，U 0 1 2 6 S P 6 0 0 1 2 5 ，S B 2 0 3 5 8 0 S P 6 0 0 1 2 5 ) ， a n t i 1 8 2 G P F J 3 2 G P I 及L P S 刺激的表达下降更显著，T Fm R N A 及其活性均降低 至基础水平( 图3 B 、4 B ) ，与未经抑制剂处理组相比，差异具有显著性Q 0 0 1 ) S B

11、 2 0 3 5 8 0 、U 0 1 2 6 及S P 6 0 0 1 2 5 对未刺激的n 诤一l 细胞无明显作用( 见m e d i a 组) 。 A 0 默 O 羞 g6 0 x 1 0 - 6 k 14 0 x 1 0 - 6 ； 羔2 0 x 1 0 4 童 童 。 口i n h 吣鸭 B 皿w 阶S B 2 0 3 5 8 0 。 口r i oi n h i b i t o r s 皿w i t hS B 2 0 3 5 8 0 U 0 1 2 6 E 喜w i t hU 0 1 2 6 S P 6 0 0 1 2 5 矿 图3M A P I C s 抑制剂对a n t i -

12、3 2 G P I 3 2 G P I 诱导T H P - 1 细胞T Fm R N A 表达的影响 R T - q P C R 分析靶基因T Fm R N A 与B - a c t i nm R N A 的比值。 F i g3T h ee f f e c t so fM A P K si n h i b i t o r so na n t i 一 3 2 G P I 1 2 G P I - i n d u c e dT Fm R N A e x p r e s s i o ni nT H P - 1c e l l s T h em R N A e x p r e s s i o no fT

13、F ( v sB - a c t i n ) d e t e r m i n e db yR T - q P C R ：p O 0 5V SI l Oi n h i b i t o r s：p O O1V Sn oi n h i b i t o r s A 口咖岫 皿w i 价S B 2 0 3 5 8 0 兮 i4 o 薹3 厶 薹2 上 鼍 鲁o 。 口n o i n h 砸i 蛔幅 皿w 劬S B 2 0 3 5 8 0 U 0 1 2 6 E j 埘mU 0 1 2 6 S P 6 0 0 1 2 5 图4M A P K s 抑制剂对a n t i - 3 2 G P I 1 3 2

14、G P I 诱导T H P - 1 细胞T F 活性的影响 数据分别来自三次独立的实验，用均数标准差( x4 - S D ) 来表示。 薯丐E鲁t2卫2耆一星 B专o善宝差 丛坠在垒趟= 巨2 鱼! 垦2 Q ! 复金物透：昱卫垒! 细胞麦达虫数佳闰拯过 F i g4 T h ee f f e c t so fM A P K si n h i b i t o r sO i la n t i J 3 2 G P I J 3 2 G P I - i n d u c e a tT Fa c t i v i t yi n T H P 1c e l l s D a t a f r o mt h r o

15、ei n d e p e n d e n te x p r i m e n t sa r ep r e s e n t e da sm e a n s4 - S D ：p 0 0 5V Sn oi n h i b i t o r s：p 0 0 1V Sn oi n h i b i t o r s 3 4 讨论 本课题组多年来坚持探讨抗磷脂综合征( A P S ) 血栓形成的机制，证明了 a n t i J 3 2 G P F J 3 2 G P I 复合物刺激血液单核细胞表达邛是其主要机制之- 1 ，3 1 。后 续研究试图明确a n t i J 3 2 G P U J 3 2 G P I

16、刺激细胞T F 表达过程中所涉及的信号分子及 其作用。前期研究已经证明了细胞表面受体A N X 2 、T L R 4 及其信号转导通路参 与了该过程【3 ，4 ，4 9 】。本文进一步发现M A P K s 家族的三个主要分子在 a n t i - p 2 G P I p 2 G P I 诱导T H P - 1 细胞表达T F 过程中均被诱导活化，提示M A P K s 在 其中扮演着重要角色。以往曾有报道某些M A P K 分子参与了抗磷脂抗体( a P L ) 诱导内皮细胞及单核细胞活化 3 9 ，4 0 1 ，但缺乏全面的观察。如V e g a - O s t e r t a g 等 仅

17、发现p 3 8 M A P K 与a P L 激活内皮细胞表达1 1 F 有关【2 】。关于E R K 的作用， L o p e z - p e d r e m 等报道E R K l 参与了a n t i f 1 2 G P I p 2 G P I 刺激外周血单核细胞表达1 1 F 的过程，而E R K 2 则与此无关【7 ，4 9 。本文的结果显示E R K l 2 被激活，可能与 采用的细胞株及抗体不同有关。至于J N K 在a P L 作用中的探讨，目前未见相关 报道。本研究证明a n t i - p 2 G P I p 2 G P I 复合物刺激n 口- l 细胞后，J N K 也被诱

18、导磷 酸化，与p 3 8 及E R K l 2 的磷酸化一致。 为进一步证明M A P K s 在a n t i p 2 G P I B 2 G P I 诱导T H P 1 细胞表达T F 过程中 的作用，本研究采用p 3 8 、E R K 及J N K 的特异抑制剂S B 2 0 3 5 8 0 、U 0 1 2 6 、S P 6 0 0 1 2 5 进行验证。结果表明任何一种抑制剂单独作用T H P 1 细胞，均可降低 a n t i 3 2 G P I p 2 G P I 对细胞表达T F ( 1 1 1 f 斟A 水平及其酶活性) 的刺激效应，但并不 完全阻断( 图3 八4 A ) 。

19、二种抑制剂同时使用对a n t i - p 2 G P I p 2 G P I 刺激细胞表达 T F 的阻断更强( 图3 B ，4 B ) 。这一结果表明M A P K s 的活化对于a n t i p 2 G P I p 2 G P I 刺激细胞表达相关因子是必需的，单个信号分子活化的作用较弱，需要多个分子 的联合作用。当然，其中涉及的更复杂的级联关系及其信号转导机制还有待深入 研究。 综上所述，本文重点阐明了M A P K s 信号分子在a n t i - f 1 2 G P I p 2 G P I 刺激单核 细胞株T H P 1 过程中被诱导激活，从而有利于T F 的表达。然而，M A

20、P K a 如何 激活下游区信号分子以及相关转录因子，需要进一步阐明，从而为A P S 的预防 及治疗提供分子靶标。 3 l 第四章M A P K s 与上游信号分子T L R 4 及碉胍s 关系的研 究 上一章节表明M A P K s 在a n t i 一艮G P I f 1 2 G P I 复合物刺激，n 口1 细胞表达1 1 P 的过程中发挥重要作用。本课题组前期研究结果表明，a n t i J 3 2 G P F I B 2 G P I 复合物 通过细胞表面共受体T L R 4 - A N X 2 作用于T H P 1 细胞，使其表达增高；后续 研究工作发现T L R 4 - A N

21、X 2 共受体与a n t i - J 3 2 G P I J 3 2 G P I 复合物结合后迅速将信号 转入细胞，通过M y D 8 8 依赖途径快速募集下游信号分子I R A K s 。磷酸化活化后 的I R A K s 催化活化下游T R A F 6 信号分子，并磷酸化活化M A P K s 的三个信号分 子p 3 8 、E R K 、J N K 。然而本课题组在前期证明1 1 L R 4 参与信号转导过程中采用 紫杉醇抑制M D 2 的方法间接证明T L R 4 在信号转导中的作用存在一定的不足。 本研究中，我们想进一步阐明a n t i - 艮G P I p 2 G P I 复合物

22、刺激1 r I 口- 1 细胞表达过程 中，T L R 4 、I R A K s 与下游信号分子M A P K s 的相互作用。研究采用抑制剂抑制 信号分子作用，观察下游M A P K s 三个分子的磷酸化情况，从而评估T L R 4 、I R A K s 在信号转导过程中非别扮演什么样的重要作用。 4 1 材料 4 1 1 主要试剂盒仪器 T L R 4 抑制剂T A K - 2 4 2 ( I n v i v o g e n , S a nd i e g o ，C A , U S A ) I K A K s 抑制剂2 0 4 0 1 3 ( S a n t aC r u z U S A )

23、 注：其他试剂与仪器同上。 4 1 方法 4 2 1 单核细胞株T m 一- I 细胞的培养 培养方法与上述相同 3 2 4 2 2 删抑制剂T A K - 2 4 2 预处理T H P - I 细胞 将T H P 1 细胞种入6 孔板内( 2 x 1 0 6 孔) ，3 7 “ C 、5 C 0 2 培养2 4h 后轻轻 弃去培养液，换以1m L 无血清R P M I1 6 4 0 培养基。根据实验设计加T L R 4 抑制 试验则先将T A K 2 4 2 ( 5 p M ) 与细胞孵育2h ，再以a n t i - 1 3 2 G P I 1 3 2 G P I 作用细胞 相应时间，收集

24、细胞总蛋白，进行W e s t e r n 蛋白印迹分析。 4 , 2 3I R A l f a 抑制剂s c - 2 0 4 0 1 3 预处理T H P - 1 细胞 将n 口1 细胞种入6 孔板内( 2 1 0 6 孔) ，3 7 “ C 、5 C 0 2 培养2 4h 后轻轻 弃去培养液，换以lm L 无血清R P M I1 6 4 0 培养基。根据实验设计加I R A K s 抑 制试验则先将2 0 4 0 1 3 ( 5 0 t i M ) 与细胞孵育2h ，再以a n t i - 3 2 G P I p 2 G P I 作用细 胞相应时间，收集细胞总蛋白，进行W e s t e

25、r n 蛋白印迹分析。 4 2 4 统计学分析 采用软件S P S S ( V e r s i o n1 7 0 ) 进行统计学分析，所有数据以( x 4 - S D ) 表 示。对各组数据进行成组资料的t 检验分析，当p 0 0 5 认为差异具有统计学意 义。 4 3 结果 4 3 1T L R 4 抑制剂T A K - 2 4 2 对a n e - 肛G P I p 2 G P I 复合物诱导T H I - I 细胞 本组前期结果显示1J - u n o l L 紫杉醇( p a c l i t a x e l ) 能够显著抑制T L R 4 、M D 2 和M y D 8 8 三分子m

26、R N A 和蛋白水平的表达。而且同样剂量的紫杉醇预处理细 胞，其对a n t i 3 2 G P I 1 3 2 G P I 复合物诱导T H P - 1 细胞内I R A K l 、I R A K 4 及I R A I O 表达及I R A K I 磷酸化也具有抑制作用。本次试验则采用T L R 4 抑制剂直接抑制 T L R 4 受体胞内段，阻断胞外信号向胞内转导，并观察a n t i - 1 3 2 G P I p 2 G P I 复合物 遨垂查在垫! i = 艮鱼! 邑2 鱼! 复金物透昱墅堑：! 细胞麦达虫故佳用拯过 诱导T H P 一1 细胞内M A P K s 信号分子的磷酸化

27、现象。如图5 所示，与未经T L R 4 抑制剂处理的细胞组相比，T L R 4 抑制剂处理组的p 3 8 、E R K 、J N K 的磷酸化反 应程度明显降低，并且降低的水平比较显著( p o 0 5 ) 。这个结果表明，T A K - 2 4 2 能够阻断T L R 4 受体及胞外信号向胞内转导，从而使下游信号分子M A P K s 的磷 酸化受到阻断。 A t - 善n - + 麓- “盈峰H - _ - _ I - - 蕾l坤一 m e r l e 硎岬圆秘嗍 L P S C t U 啪 一 - 薯= 墨翟薯器= 昌啊蓐? 嘴 薯= a 置盔誓茹；誓裔螺 B 1 K | 帕 + =

28、皇宣盈墨墨昌譬= 皇= 宣墨墨= 嚣一 = = 暑= 墨 j I 皇= = 墨= = ：哪 m e f f l e 利呻2 G P 啊 L f 毽 亡 l I ： 薹 I宜n 茎 n 茎 三 图5T A K - 2 4 2 对T H P 1 细胞内M A P K s 磷酸化的抑制作用 m e t f l 删坤2 G 聊p 2 G P l “峪 采用W e s t e r n 蛋白印迹及条带灰度扫描分析p - p 3 8 、p - E R K 、p - J N K 蛋白 与相应总蛋白t - p 3 8 、t - E R K 、t - J N K 的比值。数据分别来自三次独立的实 验，用均数标准差

29、( x 4 - S D ) 来表示。 F i g u r e5 I n h i b i t i o no fM A P K sp h o s p h o r y l a t i o nb yT A K - 2 4 2i nT H P - 1c e l l s W e s t e r nb l o ta n a l y s i sa n dd e n s i t o m e t r ya n a l y s i sf o rp - p 38 、p - E R K 、p - J N K p r o t e i nV St - p 3 8 、t - E R K 、t - J N Kp r o t e

30、 i n D a t af r o mt h r e ei n d e p e n d e n t e x p r i m e n t sa l ep r e s e n t e da sm e a n s 士S D ：p 0 0 5V sn oi n h i b i t o r s 4 3 2I R A K s 抑制剂s e - 2 0 4 0 1 3 对, u a - p z G I V p Z G P I 复合物诱导T H P - 1 细胞 本实验采用I R A K s 抑制物s c - 2 0 4 0 1 3 ( 5 0 州) 与n 口- 1 细胞预孵育2h 后， 再以a n t i

31、p 2 G P I J 3 2 G P I 复合物( 1 0 0p g m 1 ) 刺激细胞，观察p 3 8 、E R K 、3 N K 的 磷酸化情况。结果如图6 所示，与未经I R A K s 抑制物处理的细胞比，经I R A K s 抑制物处理后，a n t i - p 2 G P I f 1 2 G P I 复合物刺激T H P - l 细胞p 3 8 、E R K 、J N K 的磷 酸化水平的表达降低( p o 0 5 ) 。从图上我们可以看到I R A K s 抑制物s c - 2 0 4 0 1 3 不能完全抑制M A P K s 的磷酸化反应，相比对上游细胞表面受体T L R

32、 4 的抑制效 果有所降低。我们推测，T L R 4 作为1 1 诤- l 细胞表面的受体介导a n t i - 3 2 G P I 1 2 G P I 复合物刺激信号转导具有高度的特异性，而信号转导进入胞内则经过不同途径活 化细胞，而I R A K s 仅仅是传递上游信号中的一个分支，抑制I R A K s 无法完全阻 断信号往下游转导。 一 坐堇垒在垦西= B 2 鱼丛垦2 Q ! 复金物透昱卫翌：l 细胞麦达卫：生的佳圈拯过 A - 0 蛳- 3 。 。 + + 粗一一I 棚 _ _ _ _ 睁啊赫_ 鼬二，一”一 拳 蚤 荤 詈 善 芷 C _ 一I j -。 + ： r 詈暑譬膏兰州

33、 警互= ；警= 宣譬= ：= 暑 Y Z 1 _ 暑 Y Z 7 A 专 。 葺 芷 H 啪 喇冲2 G P I 删 L f 塔 B - N I $ - + _ = = ：! 竺! = o 一：= = = = 用 l 嘲黪嗤 Y 卫 呷 - 2 Y 芷 峄 厶 苫 。 管 E 图6S C 2 0 4 0 1 3 对T H P 1 细胞内M A P K s 磷酸化的抑制作用 m e d i a 耐呻2 G P I 岬 L f I s 采用W e s t e r n 蛋白印迹及条带灰度扫描分析p - p 3 8 、p - E R K 、p - J N K 蛋白 与相应总蛋白t - p 3 8 、

34、t - E R K 、t - J N K 的比值。数据分别来自三次独立的实 验，用均数标准差( x4 - S D ) 来表示。 F i g u r e6 I n h i b i t i o no fM A P K sp h o s p h o r y l a t i o nb ys c - 2 0 4 0 13i nT H P - 1c e l l s W e s t e r nb l o ta n a l y s i sa n dd e n s i t o m e t r ya n a l y s i sf o rp - p 3 8 、p - E R K 、p - J N K p r o t

35、 e i nV St - p 3 8 、t - E R K 、t - J N Kp r o t e i mD a t af r o mt h r e ei n d e p e n d e n t e x p r i m e n t sa 北p r e s e n t e da sm e a E i s4 - S D 斜 恸 ：p 0 0 5V sn oi n h i b i t o r s 4 4 讨论 N X 2 属于钙离子介导的能与磷脂结合的膜联蛋白( A n n e x i n ) 家族成员， 以单体、异二聚体及异四聚体三种形式存在，作为细胞外受体参与纤溶、细胞间 粘附、细胞信号转导和病

36、毒感染等【5 0 】。A N X 2 没有胞内段，无法单独将胞外信 号转导进入胞内。T L R 4 是第一个被认识的人类T o l l 样受体蛋白，它在人体组织 内广泛分布，是人类天然免疫的重要受体之一。它由胞外区、胞浆区和跨膜区三 个部分组成 5 1 ，5 2 。T L R 4 与多种疾病相关，如肿瘤、自身免疫性疾病、炎症反 应性疾病等【5 3 】。本小组前期研究表明T L R 4 信号转导途径参与a n t i - p 2 G P I p 2 G P I 复合物诱导人单核细胞株T H P 1 表达丌的过程中与N X 2 形成了共受体，共同 协作传递胞外信号进入胞内【4 ，6 】。它通过M

37、y D 8 8 依赖途径募集下游信号分子 I R A K s 、T R A F 6 等参与信号转导。本研究是在前面研究的基础上，进一步探讨 抗磷脂综合症血栓形成机制，阐明下游所涉及的信号分子M A P K s 的作用情况。 上面章节已经证明了M A P K s 的三个蛋白p 3 8 、E R K 、J N K 在a n t i - 3 2 G P I p 2 G P I 复合物诱导人单核细胞株T H P 1 表达T F 的过程中发挥了积极作用，磷酸化现象 明显。本文也首次发现了E R K 、J N K 信号途径也参与到了单核细胞T 肿1 表达 T F 过程。 在次实验中，为了进一步阐明M A

38、P K s 在a n t i - p 2 G P I 3 2 G P I 复合物诱导人单 核细胞株n P - l 表达T F 的过程中与上游信号分子的关联性，我们采用抑制剂试 验，通过抑制上游信号分子来观察下游信号分子的变化，从而明确其中的信号关 系。课题组前期研究已经证实T L R 4 A N X 2 是细胞表面介导信号的共受体，但是 对于T L R 4 的证明采用了紫杉醇抑制M D 2 的方法，来间接说明T L R 4 参与作用 3 7 似乎缺乏说服。本研究直接采用T L R 4 抑制剂T A K - 2 4 2 预处理细胞，该抑制剂 通过作用于T L R 4 的胞内段从而抑制信号向下游转

39、导。这样我们就能直接说明 1 1 L R 4 参与到a n t i - 1 3 2 G P I 1 3 2 G P I 复合物诱导人单核细胞株T H P - 1 表达的过程 中。本实验抑制n 口- 1 细胞的T L R 4 后，下游的M A P K s 的三个信号分子p 3 8 、 E R K 、肿【磷酸化现象都显著降低，几乎可以达到没有抑制剂预处理组的水平， 一由此可知T L R 4 是1 r I 口1 细胞表面最重要的传递a n t i - 1 3 2 G P I p 2 G P I 复合物刺激信 号的受体，并且也说明了M A P K s 信号分子也参与到了T L R 4 介导的 a n

40、t i - 1 3 2 G P I p 2 G P I 复合物刺激n 口- 1 细胞表达T F 这一信号转导途径中。 I R A K s 是T L R 4 信号通路下游的重要信号分子，主要参与T L R 4 - M y D 8 8 依 赖通路的信号调节。T L R 4 受体被激活后迅速招募I R A K l 、I R A K 4 到受体上， 随即I R A K 4 使I R A K l 磷酸化，引起I R A K l 活化和自身磷酸化，形成高度磷酸 化的I R A K l ，随后激活下游分子，导致相关基因的转录。而I R A K 3 通过稳定 T L R 4 M y 8 8 I R A K 4

41、 I R A K l 复合物而抑制I 凡蛾4 对I R A K l 磷酸化，引起信号中 断。I R A K s 在机体天然免疫和自身免疫性疾病的病理机制中发挥重要作用 【5 1 ，5 4 - 5 8 】。近年来有报道I R A K s 可能与A P S 的致病机制相关 5 4 ，5 5 ，5 9 。本课 题组前期研究已经证明了I R A K s 在a n t i - f 1 2 G P I p 2 G P I 复合物诱导人单核细胞株 T H P 1 表达邗的过程中发挥了作用。本次实验中我们用I R A K s 抑制剂抑制 瓜U o 来观察下游M A P K s 信号分子磷酸化表达，来证明他们之

42、间的相互关联。 如本章结果所示，I R A K s 抑制剂预处理后的T H P 1 细胞M A P K s 三个信号分子磷 酸化水平都有所下降，并且具有统计学意义，但是下降的程度与我们所期望的不 同，通过对I R A K s 的抑制无法完全阻断信号转导，M A P K s 磷酸化现象依然存在 我们推论，在T L R 4 受体被a n t i - f 1 2 G P I & G P I 复合物刺激活化后，信号转入胞内 3 8 并非完全由M y D 8 8 依赖途径转导，可能部分信号由旁通路传递。由此可知，A P S 的致病机制是一个复杂的信号传导网，对于进一步研究A P S 的致病机制也有启 示

43、作用。 综上所述，分别抑制T L R 4 、I R A K s 后，a n t i 一1 3 2 G P I 1 3 2 G P I 复合物诱导n 口- l 细胞M A P K s 磷酸化水平有不同程度的降低。结合本课题组前期研究和本文上一 章的研究结果，我们可知，a n t i - p 2 G P I p 2 G P I 复合物促进n 伸l 细胞表达T F 的 过程中，T L R 4 、I R A K s 被活化，M A P I C s 作为胞内一个关键环节也参与到了信号 转导途径中，最终促进细胞表达T F ，促进血栓形成。 3 9 第五章主要结论及展望 5 1 主要结论 本文采用R T -

44、 q P C R 、W e s t e r n 蛋白印迹分析等技术对M A P K s 在 a n t i 1 3 2 G P I 1 3 2 G P I 复合物刺激单核细胞株n 口1 表达T F 中的作用及其调节机制 进行了研究，得出的主要结论如下： l 、自身抗体抗原复合物( a n t i - J 3 2 G P I J 3 2 G P I ) 刺激单核细胞株n 口- 1 表达T F ， 细胞内的重要信号分子家族M A P K s ( p 3 8 、E R K l 2 及J N K I 2 ) 同时发生磷酸 化反应。 2 、在a n t i - 3 2 G P I p 2 G P I 复

45、合物刺激细胞表达T F 所涉及的信号转导通路中，细胞 表面T L R 4 及其信号通路分子I R A K s 作为M A P K s 的上游分子参与调控作用 提示T L R 4 I R A K s M A P K s 通路可作为抗磷脂综合征( A P S ) 血栓形成的防治 靶点。 3 、在a n t i p 2 G P I J 3 2 G P I 复合物刺激细胞表达1 1 F 的过程中，三种M A P K s 分子均 发挥重要作用，并且相互之间的级联反应存在着复杂的协同作用，这为A P S 血栓形成的防治提供了新思路。 5 2 展望 本小组之前研究发现，A N X 2 与T L R 4 作为

46、共受体介导a n t i B 2 G P I J 3 2 G P I 复 合物刺激单核细胞表达T F ，I R A K s 参与到其中，与A P S 血液高凝状态的形成密 切相关。本论文重点阐明了n 口一l 细胞内信号分子M A P K s 在a n t i J 3 2 G P I 1 3 2 G P I 复合物诱导细胞表达过程中发挥重要作用，且与细胞表面受体T L R 4 及胞内 信号分子I R A K s 紧密关联。 然而本研究还有许多问题要探讨，比如，M A P K s 三个分子间是否存在一些 4 0 相互协同作用? M A P K s 的下游信号分子( N F 1 出、A P 1 等)

47、 是否参与这个过程? 我们还缺乏相应的体内实验来验证我们的研究结果。 4 l 参考文献 lM a r t i nM ，B 6 1G F ，E r i k s s o n e la I n t e r l e u k i n - 1 - i n d u c e da c t i v a t i o no fap r o t e i n k i n a s ec o - p r e c i p i t a t i n gw i t ht h et y p eIi n t e r l e u k i n - 1r e c e p t o ri nTc e l l s 叨E u r J I m m u

48、 n 0 1 19 9 4 ，2 4 ( 7 ) ：15 6 6 - 15 7 1 2 V e g a - O s t e r t a gM ，C a s p e rKS w e r l i c k e ta 1 I n v o l v e m e n to fp 3 8M A P K i nt h e U p - R e g u l a t i o n o f T i s s u eF a c t o ro nE n d o t h e l i a lC e l l sb yA n t i p h o s p h o l i p i d A n t i b o d i e s A r t h r i t i sR h e u m 2 0 0 5M a y ；5 2 ( 5 ) ：15 4 5 - 5 4 3 B o h g a k iM ，A t s u m iT ，Y a m a s h i t aY ，e ta 1 T h ep 3 8