产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵、酶的分离纯化及性质的研究.pdf

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1、产H 醢软骨素酶菌株的筛琏，筮酵酶的分离纯化及性质的研究 产硫酸软骨素酶菌株的筛选、发酵、酶的分离纯化 及性质的研究 摘要 硫酸软骨素酶在研究硫酸软骨索类糖胺多糖的结构、性质与功能等方面有多 种重要用途。近年来，浚酶在晦床领域的应用广泛，用来治疗某些疾病如大肯节 病、椎间盘突出等。同时，该酶在制备低分子量硫酸软骨素方面也存在着广阔的 应用前景。因此，获得酶活力高的硫酸软骨素酶具有重要的挫沦和现实意义。本 研究从微生物中筛选出一株高产硫酸软骨素酶的菌株并对菌株的发酵培养条 件、酶的分离纯化及酶学性质等做了系统的研究。 通过初筛和复筛从采集的样品中获得了一株高产硫酸软骨紊酶菌株，编号为 2 8 对

2、其形态和生理生化特性进行了测定，初步鉴定该菌株为少动鞘氢醇单胞菌 ( 曲h i n g o m o n a s p a u c i m o b i l i s ) 。该菌株所产的硫酸软骨素酶为胞外酶。 为了提高产酶菌株的产酶能力，采用单次单因素实验方法对其进行了发酵产 酶条件的优化。得到的最适发酵培养基组成为( ，w v ) ：酵母粉10 + 硫酸软目 素0 5 + N a C l05 + K H 2 P 0 40 , 0 3 + M g S 0 47 H 2O0 5 ，起始p H 85 ：最适发酵培养条件 为：摇瓶培养10 接种量、2 5 0 m L 摇瓶装量4 0 m L 、2 5 “ (

3、 2 、1 0 0 r m i n 振荡培养3 6 h ， 酶括力可达】2 U m L 。 硫酸软骨素酶的分离纯化，采用了( N 儿) 2 s 0 4 沉淀、D E A E S e p h a r o s eF a s t F l o w 阴离子交换层析及S e p h a d e xG 10 0 凝胶过滤层析等纯化步骤，结果获得了 电泳纯的硫酸软骨素酶，酶纯化倍数为1 5 56 2 ，酶收率为4 68 7 ，比活力为 9 80 4 U m g 。经S D S - P A G E 电泳呈单条带分子量约为8 23 k D a 。 酶学性质的研究包括p H 、温度、金属离子、底物浓度和底物专一|

4、生等。结 果显示：该酶为诱导酶，在不添加硫酸软骨素的培养基中没有酶活性；该酶的最 适反应p H 值为65 ，最适反应温度为4 0 “ 0 ；在实验所涉及的金属离子中，大部 分金属离子对酶反应无影响：该酶对底物具有相对专一性，能降解硫酸软骨索、 透明质酸和肝素等这一类结构相似的硫酸软骨素类糖胺聚糖，而对甲壳素和壳聚 糖无降解作用。 对该硫酸软骨素酶的酶解产物进行了质谱分析结果显示该酶的降解产物几 F 硫酸软骨紊酶蒂株的筛选、发B 酶的讣离纯化& 性质的研究 乎全为二一糖， b 度较- 留，测得的降解产物的分子垦约为4 5 8 D a 。 关键词：硫酸软骨素酶；发酵条件优化，分离纯化：酶学性质 P

5、 醢酸软骨亲酶* # 的镕、发H 鸸分离化& 性质研究 S t u d yo nt h eS c r e e n i n g ，F e r m e n t a t i o no f C h S a s e P I o d u c i n g S t r a i n s ，a n dP u r i f i c a t i o na n dP r o p e r t i e so f t h eC h S a s e A b s t r a c t C h o n d r o i t i n a s eh a sav a r i e t yo fa p p l i c a t i o n si n

6、m a n yw a y s ，s u c ha s s t u d y i n gt h eg l y c o s a n l m O g l y c a n s s t r u c t u r e ，p r o p e r t i e sa n df u n c t i o n sa n d s oo nR e c e n ty e a r st h ea p p l i c a t i o no fC h S a s ei nt h ec l i n i c a lf i e l di s e x t e n s i v e ，c u r i n g s o m ed i s e a s

7、 e ss u c ha st h eK e s h i n B e c kd i s e a s e ， i n t m w e r t e b r a ld i s cp r o t r u s i o na n ds oo nA tt h es a n l et i m e ，i ta l s oh a sa b r o a dr i s ei np r e p a r i n gl o wm o l e c u l a rw e i g h tc h o n d r o i t i ns u l f a t eS oi ti s o fi m p o r t a n tt h e o

8、r e t i c a la n dp r a c t i c a ls i g n i f i c a n c ef o rg e t t i n gC h S a s ew i t h h i g he n z y m ea c t i v i t yT h i ss t u d ys c r e e n e daC h S a s e - p r o d u c i n gs t r a i nw i t h h i g ha c t i v i t y ，a n dr e s e a r c h e dt h ef e r m e n t a t i o n ，p u r i f i

9、c a t i o n ，a n dp r o p e r t i e s o f t h eC h S a s e s y s t e m a t i c a l l y T h es t r a i nw i t hh i 曲C h S a s ea c t i v i t y , n u m b e r e d2 8 ，w a so b t a i n e d f r o mt h es o i ls p e c i m e nb ym e t h o d so f p r e l i m i n a r ya n ds e c o n ds c r e e n i n g I tw a

10、 si d e n t i f i e dt ob eS p h i n g o m o n o sp a u c i m o b i l i sa c c o r d i n gt o b i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n db i o c h e m i c a l r e a c t i o nt e s t sT h eC h S a s e p r o d u c e db yt h es t r a i nw a se x t r a c e l l u l a r - e n z y m e I no r d e

11、rt o i m p r o v e t h eC h S a s e p r o d u c t i v i t y ，t h e f e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sf o rC h S a s e p r o d u c t i o n w a s o p t i m i z e d u s i n g o n e f a c t o r a t a t i m e m e t h o d o l o g y T h e o p t i m a lc o m p o s i t i o n o f f e r m e n t a t i

12、o nm e d i u mw a sa s f o l l o w s ( ，w v ) ：y e a s t e x t r a c t10 ， 1 产硗酸轼骨素哺苗摊的筛选、发孵酶的井离纯化肚性质的研究 c h o n d r o i t i ns u l f a t e0 5 ，N a C l 05 ，K H 2 P 0 400 3 ，M g S 0 47 H 2 00 5 ，t h e i n i t i a lp H8 5A n dt h eo p t i m a lc u h i v a t i o nc o n d i t i o n sw e r es e a l e da

13、s ：1 s e e dc u l t u r ew a st r a n s f e r r e dt oa4 0 r a Ls t e r i l i z e df e r m e n t a t i o nm e d i ai n 2 5 0 m Lc o t t o n p l u g g e df l a s k sa n di n c u b a t e da t2 5 f o r3 6 hw i t h r e c i p r o c a t i o n ( 10 0r m i n ) T h eC h S a s ea c t i v i t yc o u l dr e a c

14、 h 12 U m L w h e nt h es t r a i nw a si n c u b a t e du n d e rt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s T h eC h S a s ew a sp r e p a r e df r o mt h ef e r m e n t e db r o t hb ya m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ，D E A Es e p h a r o s e f a s tf l o w

15、 i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a ma n dg e lf i l t r i t i o nw i t hs e p h a d e xG 一1 0 0c h r o m a t o g r a mT h e p u r i f i e de n z y m em o v e da sas i n g l ee l e c t r o p h o r e t i cb a n di nS D S - P A G E a n dt h em o l e c u l e rw e i g h tw a sa b o u t8 23k D a

16、T h r o u g ht h ep u r i f i c a t i o n ， t h eC h S a s ew a s p u r i f i e d1 5 56 2 一f o l do v e rc u l t u r es u p e r n a t a n ti n4 68 7 y i e l da n di t ss p e c i f i ca c t i v i t yw a sa b o u t9 80 4 U m g T h er e s u l t so f p r o p e r t i e so f t h eC h S a s ew e r ea sf o

17、l l o w sT h e e n z y m e w a sp r o v e dt ob ei n d u c i b l ee n z y m e ，a n dt h e r ew a sn oC h S a s ea c t i v i t yi n t h em e d i aw i t h o u tC h ST h eo p t i m a lp Ha n dt e m p e r a t u r ef o re n z y m e a c t i v i t yw a s6 5a n d4 0 Cr e s p e c t i v e l y M o s ti n o r g

18、 a n i cm e t a li o n sh a dn o e f f e c to nt h eC h S a s ea c t i v i t yT h es t u d yo ns u b s t r a t es p e c i f i c i t ys h o w e d t h a tt h e e n z y m ew a sr e l a t i v e l ys p e c i f i c i t y t os u b s t r a t e s ，w h e na c t i v e d e g r a d a t i o no c c u r r e do nc h

19、 o n d r o i t i ns u l f a t e ，h e p a r i na n dh y a l u r o n i ca v i d w h i c hw e r es i m i l a ri nt h es t r u c t u r e s ，w h i l ec h i t i na n dc h i t u s a nw e r en o t d e g r a d e db yt h ee n z y m e F # 骨i 酶菌株的筛选、牲醉，酶“ 离纯n H 厦的究 T h e p r o d u c t s o b t a i n e df r o mt

20、h ee n z y m ew a sa n a l y s e d b ym a s s s p e c t O l X l e t l Y T h ep r o d u c t sw a sd e t e r m i n e da su n s a t u r a t e dd i s a c c h a r i d e ， a n dt h el e v e lo fu n s a t u r a t e dd i s a c c h a l i d er i s e d t o n e a l l y 10 0 T h e m o l e c u l a ro f t h eu n s

21、 a t u r a t e dd i s a c c h a r i d ew a sa b o u t4 5 8 D a K e yw o r d s ：C h o n d r o i t i n a s e ；o p t i m i z a t i o n o ff e l i n e n t a t i o nc o n d i t i o n s ； e n z y m ep u r i f i c a t i o n ；e n z y m ep r o p e r t i e s P n # 女棒的筛选筮”、* 离纯化性“ R 目录 摘要 I A b s t r a c t 1 I

22、 I 第一章前言 1 l l 硫酸软骨素 1 1 l l 硫酸软骨素的结构及种类 1 1 j2 硫酸软骨素的性质 2 1 13 硫酸软骨素的生物活性 2 l14 硫酸软骨素的应用研究 3 12 低分子量硫酸软骨素 5 l3 硫酸软骨素酶 7 】3 】硫酸软骨素酶的种类 7 132 硫酸软骨素酶的分离纯化 9 l33 硫酸软骨素酶的药理作用 1 0 3 4 硫酸软骨素酶的应用研究 l4 本论文的研究目的与意义 l3 帮二章硫酸软骨索酶产生菌的筛选及菌种的鉴定 1 4 2 1 实验材料、试剂与仪器 1 4 2 l1 培养基 1 4 2 12 主要试剂 1 4 2 l3 主要仪器 1 4 22 实验

23、方法 1 5 221 菌株的初筛平板快速筛选法 15 2 22 菌株复筛 2 23 硫酸软骨素酶活力的测定 1 6 2 , 24 菌种鉴定 一1 6 2 3 实验结果 1 7 2 3 1 菌株初筛结果 2 , 32 菌株复筛结果 2 33 菌种的鉴定 1 7 1 7 2 , 4 小结 1 9 2 4 l 关于筛菌 一1 9 2 42 关于菌株鉴定 1 9 第三章产硫酸软骨素酶菌株发酵条件的研究 2 1 f “硫醴软骨寨酶菌睐的筛选、笸酵、酶分离业化性域的“ 究 3 l 实验材料、 3 1 1 菌种 试剂与仪器 2 3 12 培养基 3 13 主要试剂 3 14 土要仪器 32 实验方法 321

24、 硫酸软骨索酶活力的测定 3 22 菌体的生长曲线的测定2 2 323 发酵培养条件的研究 2 2 33 实验结果2 4 33 1 菌株的生长曲线 2 4 3 32 发酵产酶条件的研究 2 5 3 4 小结 2 9 第四章硫酸软骨索酶的分离纯化与酶学性质研究 3 0 4 1 实验材料、试剂与仪器 4 11 菌种3 0 4 I2 培养基3 0 4 l3 主要试剂3 0 4 I4 主要仪器3 1 42 实验方法 3 2 42 】硫酸软骨紊酶粗品的制各3 2 4 22 硫酸软骨素酶的纯化3 3 4 23 硫酸软骨素酶活力测定方法3 4 4 24 蛋白质含量的测定3 4 4 25 蛋白质的纯度鉴定及分

25、子量测定 4 26 硫酸软骨索酶部分酶学性质的研究 43 实验结果 3 6 3 7 4 31 硫酸软骨素酶的纯化 一3 7 4 32 蛋白质的纯度鉴定及分子量测定3 8 4 33 硫酸软骨素酶部分酶学性质的研究4 0 4 4 小结4 3 4 4 】 关于硫酸软骨素酶的制备4 3 4 42 关于硫酸软骨索酶的分离纯化 4 3 4 43 关于硫酸软骨素酶的部分酶学性质 一4 4 第五章硫酸软骨素酶酶解产物的初步分析4 6 引引弛砼 F m # 女m 镕m t 发M 、确“ R 纯n r F 质的“ 咒 5 1 实验材料、试剂与仪器 5 1 材料 5 l2 主要试剂 5 l3 主要仪器 5 2 实验

26、方法 521 硫酸软骨素寡糖的制备 4 7 522 酶解产物的分析 4 7 5 3 实验结果 4 7 5 4 小结 4 8 总结 4 9 参考文献 致谢 拍蛎拍 产硫酸# * 女趋* # t 、目、l 勺n 离* # “ R F M # ”# * # 选g 、艇* 镕* m 、M “ 离n 化* # 性赝口J “ R l 1 硫酸软骨素 第一章前言 硫酸软骨索( C h o n d r o i t i ns u l f a t e ) 是一种酸性粘多糖一糖胺聚糖，在哺乳动 物的结缔组织中含量较多如软骨、韧带、动物喉骨、鼻骨、肌膜、气管和血管 壁等I I ，鱼类软骨中含量很丰富。近年来，硫酸软骨

27、素的药用价值日益得到人 们的重视，其商品名为“康得灵”。 I11 硫酸软骨素的结构及种类 硫酸软骨素是糖胺聚糖中的典型代表物质，主要是由葡萄糖醛酸和氨基己糖 彤成的双糖单位交替连接而成的生物大分子，双糖单位的数目一般在5 0 一7 0 个左 右相对分子量大约在5 0 0 0 5 0 0 0 0 D a 之间I o ”。硫酸软骨素有多种异构体主要 是由于硫酸基在氨基己糖所在位置的不同，故硫酸软骨素有如下多种：硫酸软骨 素A 、硫酸软骨素C 、硫酸软骨素B 、硫酸软骨素D 和硫酸软骨素E 等，其结 构式如图I 1 所示”】，其中硫酸软骨素A 和硫酸软骨素c 应用到药剂中的较多。 、蛤”静 “ e

28、” n 矾精j t ”* c 圈l I 不同化学结构的硫酸软骨豪 F i gl - 1 s t r u c t u r ef o r m u l ao f d i f f e r e n tc h o n d r o i f i ns u l f a t e 一 兰M 一一 兰三一 P 酸软骨素醇苗株的筛选笛定，发簿条件优化墒的n 离纯酶 性质的研究 2 硫酸软骨素的陛质 1 硫睃软骨素的物理性质 硫酸软骨素为白色的粉末，无臭无味，因其分子中禽宵某些极性基团，如硫 酸基、羧基等，而易溶于水，难溶于有机溶剂乙醇、乙醚、丙酮等。其溶于 水所得溶液的黏性较大，且在高温、强碱及强酸时不稳定，易分解成一

29、些分子量 比较小的多糖体“。硫酸软骨素的旋光度因其化学结构不同而不同。 2 硫酸软骨豢的化学性质 硫酸软骨素囡其分子中含有某些授畦基团，如硫酸基、羧基等，而带有较多 的负电荷，能与一些阳离子，如N a - 、M 9 2 + 、c a 2 + 等结台I 。 ( 1 ) 水解反应在中性低温下，硫酸软骨素比较稳定，而在强碱、强酸及高温下， 硫酸软骨素易被降解为小分子产物，温度越高时降解越快，且沐硫酸还可硫酸 小分子产物吼硫酸软骨素酶也可使硫酸软骨索发生降解，产物多为不饱和二糖 及寡糖。 ( 2 ) 沉淀反应硫酸软骨素中的硫酸基可与B a 2 形成B a S 0 4 沉淀Iq 。 ( 3 ) 中和反应

30、 硫酸软骨素的阴离子能与许多阳离子结合形成盐，故可利用此性 质对硫酸软骨素进行纯化，如阴离子交换树脂等O I ， ( 4 ) 还原性 硫酸软骨素由于台有半缩醛基团而具有还原性，碱性酒石酸铜溶液 中的C u 外能被硫酸软骨素还原成红色氧化亚铜I 。 ( 5 ) 酯化反应 硫酸软骨索分子中含有游离的羟基，可被酯化形成台多硫酸的衍 生物唧。 3 硫酸软骨素的生物活性 硫酸软骨素作为一种塘胺聚糖，具有多种生物活性和药用价值：抗凝血、降 血脂、抗动脉粥样硬化、澈活某些脂酶、保护神经元、调节机体免疫、治疗关节 炎、促进脂类代谢、抗肿瘤以及维持血管壁弹性等”I ，近年来逐渐受到人们的 重视。 P 硫瞎软目#

31、 * 株的筛A # i 、艇B 条件仇n 、晦分离纯化技酶 腰的州R 1抗凝血作用 抗凝血是硫酸软骨素的个重要机理作用，它通过抑制凝血系统纤维蛋 白原系统中复A 物l a l X a 的活性而发挥抗凝作用，这种作用是较为缓和的。 2 降低血脂 某些定位于毛细血管的脂酶能降解甘油三酯为脂肪酸而硫酸软骨素能激活 这些脂酶并促进它们释放”l ，从而起降低血腊的作用。 3 抗动脉粥样硬化作用 硫酸软骨素能结台血浆脂蛋白形成复合物，清除血液中过多的脂蛋白、脂类 和胆固醇，同时使血管壁埘透性变低j 】，起抗动脉粥样硬化作用。 4 抗炎作用 5 羟色胺、组胺等与炎症有关的化学物质能与硫酸软骨素的阴离子结合，

32、对 心肌、主动脉等结缔组织起到了明显的抗炎作用。 5 保护和修复神经元 D 淀粉样蛋白能对某些神经元造成损害，而硫酸软骨素可消减这种损害作用： 在酪氨酸诱导的神经细胞凋亡中，硫酸软骨素通过对此受体的相关酪氨酸磷酸化 使酪氨酸降解失活，组织对神经元的损害I 。 此外，硫酸软骨素能使N K 细胞失活，并阻止A D C C 损害组织，从而促进组 织修复9 1 ，还具有促进细胞代谢以及核酸的生物合成的作用。 】4 硫酸软骨素的应用研究 由于硫酸软骨素的多种生物活性和药理作用，现在已经被广泛用于医学、食 品、保健品和化妆品原料。 J 医学 ( 1 ) 治疗风湿病和关节炎 硫酸软骨素对关节炎、风湿瘸、神经

33、痛、肩周炎等疾病的临床治疗效果明显 药用机理为硫酸软骨素具有亲软骨性，能进入软骨组织中通过延缓软骨成分的 降解、促进软骨细胞的代谢、吸收水分补充基质成分以及增加软骨细胞分泌的滑 F 酸轼骨素酶菌株的筛琏* 、发* 条件优化情的分离化肚鹄学性质的”究 液量来保护软骨，改善和增强软骨的助能，从而治疗关节炎和缓解关节炎带 来的疼痛； ( 2 ) 治疗高血脂症 脂蛋白酶话性降低时，能引起脂类物质的沉积，外导致血栓】，而硫酸软 骨素能激活脂蛋白酶，防止这种沉积，从而用于治疗高血脂症。 ( 3 ) 治疗心绞痛和抗动脉粥样硬化 硫酸软骨素与血浆脂蛋白结合形成复合物，清除m 液中过度的脂蛋白和脂 类，防止动脉

34、粥样硬化：硫酸软旨囊A 与l 札清胆固醇的结合，降低了胆固醇含量， 可用来治疗心绞痛等疾病： ( d ) 保存角膜及治疗角膜损伤 硫酸软骨素是角膜基质中的一种成分，可用来保存角膜，它的存在可维持角 膜的渗透性，使其形状保持不变，对角膜的内应细胞有显著的保护作用m 】，而 且还能改善低温保存的内皮细胞的活性。 硫酸软骨素能促进血液循环，调节新陈代谢，加速炎症的消除，稳定细胞的 内环境，有利于角膜上皮细胞的移行，从而加速角膜创伤的愈合【2 ”。硫酸软骨 素滴服液可用来治疗角膜损伤、角膜炎及角膜溃疡等。 此外硫酸软骨素还可缓解手术后眼部所受的刺激并促进角膜上皮细胞的修 复1 2 ”。 ( 5 ) 治

35、疗干眼症 干眼症是一种常见的眼病m 1 。对于干眼症较重者，临床上一般用人工泪液 配合硫酸软骨素眼膏来一起治疗，单用人工泪液的疗效不持久。此外，硫酸 软骨素也可以联合其他药物形成复方滴眼液脚】，用于治疗眼部炎症、结膜充血、 眼睛疲劳以及戴隐形眼镜带来的眼部不适等。 ( 6 ) 治疗牛皮癣 用硫酸软骨索冶疗中度和重度牛皮癣忠者，发现痉痒和脱落减轻，皮肤的隆 起减少，明显改善了牛皮癣的症状，说明硫酸软骨素就有治疗牛皮癣的作用。 ( 7 ) 治疗肾炎 硫酸软骨素对血清中脂类的清除和对脂类代谢的改善作用，可促进其修复肾 4 产硫酸轼骨索酶杯筛选豁发B 什“、“ 离纯化皿螭性庙的研究 损伤组织，从而对肾

36、炎起一定的治疗作用I 。 ( 8 ) 在生物医学上的应刚 硫酸软骨素在生物医学上司用于生物膜、活性脚手架及人工真皮的构建：锍 酸软骨素和壳聚糖具有较好的相容性，可咀不同比例制成壳聚糖一硫酸软骨素共 混膜，在共混膜上培养兔的角膜内皮细胞，发现内皮细胞可长期生长【”I ；用硫 酸软骨紊、透明质酸和明胶制成脚手架，能促进人类N P 细胞的再生，用作活性 脚手架；在体外分离培养取自A 胚真皮的成纤维细胞，同时构建胶原一硫酸软 骨索支架体系，在支架上接种扩增的成纤维细胞，可制备人工真皮旧。 2 食品 硫酸软骨素具有保水性、保胶性和高粘性，添加于食品中能保持食品的光泽、 口感的嫩滑以及味道的新鲜等作用I

37、；硫酸软骨素与vB 3 、v B 5 、苯丙氨酸等物 质配合可$ 9 成止痛膳食l “) ；我国出口到韩国、日本的硫酸软骨豢用作食品添加 剂I 。 3 保健品 硫酸软骨素对神经细胞、肾细胞等具有保护作用因此在r i 3 , b 是很流行的保 健品添加剂I ”I 。 4 化妆品 硫酸软骨素具有保水性、保胶性和高粘性，可与某些物质调制成化妆品，具 有锁住肌肤的水分和促进肌肤代谢等作用I ”】。 12 低分子量硫酸软骨素 随着对硫酸软骨素的研究深入发现其生物活性和药理作用随分子量的不同 而有所不同，特别是低分子量的硫酸软骨素( L o wm o l e c u l a rw e i 曲tc h o

38、n d r o i t i n s u l f a t e ) 。 低分子量的硫酸软骨素具有多种重要的用途。例如： “) 低分子量硫酸软骨豢作为种药物时，在多扶给药后，表现为在靶部位药物 的显著累积效应，提高了药物在靶部位的作用浓度，增强了药效： F 硫醇轼骨案酶苗株的筛选牿定发酵荣”忧他、畸的“ 离地化世酶学性质的研究 ( 2 ) 低分子量硫酸软骨索能防治和治疗矗I J 脉粥样硬化、关节炎等疾病，而且还有 利于伤口处的愈合f ”I ： ( 3 ) 有研究显示，当低分子量硫簸软骨袭和葡萄糖结合使J 1 | 时，可以减缓软骨细 胞的降解，保护软骨1 3 8 】： ( 4 ) 有些药物在临床上具有

39、剂量限制性，研究表明当低分子量硫酸软骨素作为这 些药物的载体与药物结合时，可以增强药效。如C D D P 足一种非常有效的抗癌 药物，可用于对实体瘤的治疗，但其在临床上有一定的副作用，其中毒性一肾毒 性是最常见种剂量限制性，当C D D P 与低分子量硫酸软骨素( 分子量2 5 k D a 以下) 结合时可以对药物进行有效的定位，提高药物的治疗指数，增强药效。 最新的研究表明，分子量降低至2 一】0 k D a 的硫酸软骨素对动脉粥样硬化等 疾病的药效更为明显I ”I 。因此通过适当的方法降解硫酸软骨素来获得低分子量 的硫酸软骨素既有科研意义，更有实用意义。 目前，低分子量硫酸软骨寨的制备1

40、要有j 种方法：酸水解、离子交换树脂 和酶解法5 ”I 。具体内容为： ( i ) 酸水解法 酸水解法是在3 5 9 5 C 时，用盐酸或草酸水解硫酸软骨素数小时，然后用碳 酸钠等调p H 至4 5 55 再加入7 倍量乙醇进行沉淀，即得低分子量硫酸软骨素 壤终收率为9 25 。 ( 2 ) 离子交换树脂法 离子交换树脂法是在含有阳离子交换树脂D o w e x5 0 水中，加入硫酸软骨素， 1 0 0 C 下悬浮保温2 4 h ，用碳酸钙调口H 至6 5 ，经脱盐，加乙醇沉淀，即得低分 子量硫酸软骨素，最终收率为9 0 。 ( 3 ) 酶解法 用酶解法制各低分子量硫酸软骨素的方法为：将从菌体

41、中分离纯化出的硫酸 软骨素酶( C h S a s e ) 加入到硫酸软骨素溶液中，于2 0 4 0 C 下酶解，酶解液经浓 缩、干燥即得低分子量硫酸软骨素。 前两种方法的工艺比较复杂，要求较高级的实验设备，而且还会污染环境。 相比较而言酶解法工艺简单，条件要求不高且易于控制，并且不污染环境，因 而具有较大的优势。 6 P 硫# * # 株的* 定、艇B 件“ t 的”离化晦* 质q 院 所以，利用硫酸软骨素酶制备低分子量硫酸软骨索不仅有理论意义，更有 其现实意义。为此，许多发达国家肛热衷于用硫酸软骨紊酶降解硫酸软骨紊来获 得低分子量的硫酸软骨素这研究，而国内这方面研究还很少 。 13 硫酸软

42、骨素酶 硫酸软骨素酶是存在于微生物体内的一种裂解酶，能特异地降解细胞外基质 成分中的糖胺多糖如透明质酸、硫酸皮肤素、硫酸软骨素和肝素等，降解产物是 不饱和二糖及寡糖。 硫酸软骨索酶主要是从微生物中提取出来的，上世纪初，人们就开始对微生 物来源的硫酸软骨素酶进行研究。】9 1 4 年，N e u b e r g 等学者先后发现微生物和某 些葡的抽提物均能对硫酸软骨素进行降解】。目前国外主要从微生物中提取硫 酸软骨素酶来获得高纯度的酶制剂，已报道的产该酶的菌株主要有普通变形杆菌 ( P r o t P N ，叫r s ) 1 4 J ，肝素黄杆菌( F l a v o b a c t e r i

43、u mh e p a r i n u m ) ，奇异变形 杆菌( P r o t P W i r a b i l i s ) 1 4 5 J 等。近年来，硫酸软骨素酶作为种进行基础研究的 工具酶和一种新型药用酶而日益受到人们的重视。 31硫酸软骨素酶的种类 目前，已发现4 种来源于微生物的不同类型的硫酸软骨素酶，分别为硫酸软 骨素酶A B C 、硫酸软骨囊酶A c 、硫酸软骨素酶B 以及硫酸软骨素c ，它们的降 解功能不同作用的底物也各有差异。 l 硫酸软骨素酶A B C 硫酸软骨素酶A B C 可特异地降解硫酸皮肤索、透明质酸、软骨素、硫酸软 骨素A 、硫酸软骨煮B 及硫酸软骨素c 等糖胺多

44、糖，降解得到的产物为D i 一6 s 、 A D i 4D 】_ 0 s 不饱和二糖投其寡糖，不能降解肝素。目前己经发现多种微生 物可产生硫酸软骨素酶A B C 且均为胞内酶如B a c t e r o i d e s t h e t a i o t a o m i c r o n 和 尸t e l l s咖r i s 能各自产生2 种硫酸软骨囊酶A B C tF l a v o b a c t e r i u mh e p a r i n u m 能产生1 种硫酸软骨索酶A B C ”9 6 删。硫酸软骨素酶A B C 的来源不同，其理化 产硫酸轼骨豢静苗蚌的筛选鉴壁酵条件优化、酶的讣离M

45、化的学质“ 究 性质也略有差异。B a c t e r o i d e st h e l a i o t a o m i c r o n 产生的两种硫酸软月素酶A B C 的 理化性质差异不大，其中I 的_ 【1 对分子质量为1 0 8 k D a ，| l 的栩刘分子质量为 1 0 4 k D a ，1 和I I 的最适反应p H 值般棚差02 - 04 个p H 单位：普通变形杆菌 ( P r o t e u sv u l g a r i s ) 产生的两种硫酸软骨素酶A B C 的相对分子质量还不是很确 定，但是可以确定的是其相对分子质量都在15 0 k D a 以F ，这两个酶当以硫酸

46、软 骨素为底物时的酶反应的最适D H 为8 0 ，当以软骨素为底物时的酶反应的最适 p H 为6 2 。目日日应用到药用研究中的主要是普通变彤朴菌( P r o t e u sv u l g a r i s ) 所 产生的硫酸软骨素酶A B C ，该酶已于大肠杆菌中成功表达I ”I 。 2 硫酸软骨索酶A C 硫酸软骨索酶A C 可快速地特异地降解糖胺多糖中的软骨素、硫酸软骨素c 、 硫酸软骨素A 和透明质酸，降解透明质酸的速度要慢一点降解得到的产物为 D i - 6 s 、D j 一4 s 不饱和二螗及寡糖，不能降解硫酸软骨素B 、肝索和硫酸角质 素。目前能产生硫酸软骨素酶A C 的菌种有A

47、 e r o m o n a s B q u e f a c i e n s 、A r t h r o b a c t e r a u r e s c e n t s 及F l a v o b a c t e r i u mh e p a r i n “m 等1 5 0 $ 2 】。由肝素黄杆菌( F l a v o b a c t e r i ”m h e p a r i n u m ) 产生的硫酸软骨素酶A C 为种胞内酶，该酶的相对分子量为7 4 k D a ， 等电点为88 5 酶反应的最适口H 值的范围较宽，为6 75 ：由A e r o m o n a s ，畸咖c “ 月s 和d

48、 r t h r o b a c t e r a u r e s c e n t s 产生的硫酸软骨素酶 c 能分泌到苗体外， 为胞外酶，但这2 种硫酸软骨索酶A C 的理化性质差异较大：A e r o m o n a s 脚“e J 白c i e n s 和F l a v o b a c t e r i u mh e p a r i n u m 产生的硫酸软骨素酶A C 具有相似的理 化性质，而A r t h r o b a c t e ra u r e s c e n t s 产生的硫酸软骨素酶A C 的相对分子量为 8 2 k D a ，等电点为5 4 6 。目前硫酸软骨素酶A C 已用

49、于药用价值和分子生物学领 域的研究。 3 硫酸软骨素酶B 硫酸软骨素酶B 可特异地降解糖胺多糖中的硫酸皮肤素及透明质酸，降解 产物为S D i 一0 s 不饱和二糖及寡糖。目前仅发现F l a v o b a c t e r i u mh e p a r i n u m 能产生 该粪酶，其所产生的硫酸软骨索B 的相对分子量为5 52 k D a ，等电点为90 5 ，最 适反应p H 在6 8 80 之间m 1 。因其降解底物仅限于硫酸软骨素B 、硫酸皮肤素及 透明质酸，目前硫酸软骨素B 用于药用价值的研究相对较少，但关于其分子结 P 硫酸软骨豢酶菌株的筛选定、发酵条件忧化，嘶分离纯化及酶学性质的究 构的研究相对比较清楚其是右手平行的B