核桃(Juglansregia)胚发育及其营养代谢动态研究.pdf

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1、核桃（Juglans regia）胚发育及其营养代谢动态研究 4 the earlier stage and then decreased until the minimum point at 80 DAF, thereafter these enzyme activities turned to ascend the crest value at 90-100 DAF, and then kept decreasing until the late maturity stage. Soluble sugar content had significant positive correlati

2、on with fructose and glucose content at P0.05. Sucrose content positively correlated with glucose content at P0.01, while with SS and SPS activities at P0.05. Protein content negatively correlated with NI and AI content at P0.01, while with fructose content at P0.05. 4) Sugar was dyed purple, protei

3、n was stained blue, fat was dyed black by PAS-Coomassie Brilliant Blue R, PAS-Sudan Black B. Histochemical localization showed that: During the nutrient accumulation of the walnut embryo, sugar distributed at the cell periphery or intercellular and the distribution of sugar and fat displayed spatial

4、 correlation. The fat accumulated in the cell periphery at the beginning period, and gradually accumulated to the cytoplasm and formed large clumps of fat which occupied the whole cell in the latter. The protein scattered in the cytoplasm in the form of protein particles, and the changes of its numb

5、er were consistent with the results of chemical determination. Key words： Walnut（Juglans regia）; Embryos development; Fat; Protein; Sugar; Invertase; Histochemistry 符号说明 AI: Acid invertase, 酸性转化酶 NI: Neutral invertase, 中性(碱性)转化酶 SS: Sucrose synthase, 蔗糖合成酶 SPS: Sucrose phosphate synthase, 蔗糖磷酸合成酶 UD

6、P: Uridine diphosphate, 尿苷二磷酸 UDPG: Uridine diphosphate-glucose, 尿苷二磷酸葡萄糖 S-6-P: 6-phosphate-sucrose, 6-磷酸蔗糖 F-6-P: 6-phosphate-glucose, 6-磷酸果糖 G-6-P: 6-phosphate-glucose, 6-磷酸葡萄糖 F: Fructose, 果糖 G: Glucose, 葡萄糖 PAS: Periodic Acid-Schiff stain, 过碘酸席夫反应 DTT: 1,4-Dinitrosalicylic acid, 二硫代苏糖醇 EDTA: Et

7、hylene Diaminetetraacetic Acid, 乙二胺四乙酸 DNFB: 2,4-Dinitrofluorobenzene,2,4-二硝基氟苯 HEPES: 4-(2-hydroxyerhyl)piperazine-1-erhanesulfonic acid, 4-羟乙基哌嗪乙磺酸 PVP: Poly vinyl plpyrrolidone, 聚乙烯吡咯烷酮 DNS: 3,5-Dinitrosalicylic acid, 3,5二硝基水杨酸 RGR: Relative growth rate, 相对增长率 FW: Fresh weight, 鲜重 关于学位论文原创性和使用授权的

8、声明关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所取得 的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重要贡献的个人或集体， 均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同意学 校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子版，允许论 文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论文的全部或部分 内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存 论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文 收录到中国学位论文全文数据库 ，并向社会公众提供信息服务

9、。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名： 导 师 签 名： 日 期： 山东农业大学硕士学位论文 5 1 引言 营养失衡造成的“隐性饥饿” （Hidden hunger）是威胁人类健康的一个重要因素， 全球大约有30亿人处于营养失衡状态（Welch RM et al.,2004；WHO,2002） 。进入本世纪 以来，期望通过培育和改良作物，获取营养丰富而均衡的食品，以改善人类健康状况， 取得了广泛共识（Pinstrup-Andersen P, 2000） 。核桃果仁营养丰富，脂肪含量60%75%， 脂肪中的不饱和脂肪酸占90%以上，其中对人体最具有医疗保健作用的亚油酸占65%以 上；

10、蛋白质含量15%22%，其中人体可吸收性蛋白与大豆、花生、杏仁、榛子、鸡蛋 相比是最高的，在96%以上；所含的18种氨基酸总量占核桃仁的20%左右；矿物质元素 有磷、钾、钙、镁、锰、铜、铁、锌等；维生素有胡萝卜素、硫胺素（VB1） 、核黄素 （VB2） 、尼克酸、抗坏血酸、维生素A、C、E等。而且核桃仁中含有多种医药成分， 具有多方面的保健与医疗功能。祖国医学认为核桃性温、味甘、无毒, 有健胃、补血、 润 肺 、 养 神 等 功 效 （ 李 时 珍 ， 1982 ） 。 根 据 联 合 国 粮 农 组 织 统 计 数 （http:/apps.fao.org/default-c.htm） ，20

11、06年全世界核桃（Juglans regia）收获面积67.29 万公顷，总产量达到170万吨。到2008年，中国核桃总产量达到83万吨，居世界前列， 其国内核桃市场价格也由2000年78元/kg上涨到2010年的2540元/kg（赵敏等，2010） 。 核桃作为坚果的一种，具有极高的营养价值，根据美国农业部国家营养数据库（USDA National Nutrient Databank）(http:/www.nal.usda.gov/fnic/foodcomp/)公布，核桃（Juglans regia L.）坚果仁中的主要营养成分是脂肪，含量为65.21%；脂肪酸中多不饱和脂肪酸占 47.17

12、%，主要是亚油酸（占38.09%）和亚麻酸（占9.08%） ；蛋白质含量15.23%；碳水 化合物含量为13.71%，其中膳食纤维6.7%，蔗糖2.43%，葡萄糖0.08%，果糖0.09%，淀 粉0.06%。其营养组分极其适宜于人体健康，美国食品与药物监理局（FDA）已于2004 年通过了对核桃作为健康食品的准可，核桃被认为是“21世纪的超级食品” ，也是我 国重要的“木本粮油”战略树种（李敏等，2009） 。核桃是世界四大干果之一，也是我 国重要的经济树种。 核桃的坚果在解剖学上为“拟核果” ，核桃坚硬核壳以内部分是由合生心皮的下位 子房受精形成， “坚果”之外的青果皮则为苞片和花被发育而成

13、（肖玲等，1998）坚果 内的可食用部分即“果仁” ，则大部分为子叶（张恒悦，1980a） 。所以，研究核桃胚胎 发育及其营养代谢，为制定合理的栽培技术措施提供科学依据。 核桃（Juglans regia）胚发育及其营养代谢动态研究 6 1.1 植物胚胎发育的研究 1.1.1 植物胚胎发育研究的历史 1824 年，意大利的 Amici 首次观察到花粉在柱头上的萌发以及其后在花粉管的作 用， 他观察到马齿苋的花粉在柱头上萌发长出花粉管，并发现有颗粒在伸长的花粉 管内活动，3 小时后消失。通过 Amici 的观察以及后人的继续研究，终于了解到花 粉管在雌蕊中的行为。并揭露了花粉在受精过程中的重要作

14、用，从而拉开了胚胎学研 究的序幕。当今植物胚胎学研究己有近 200 年的历史（龙成良，1996） 。十九世纪 90 年 代以来，随着生命科学新理论和新技术的逐步介入，植物胚胎学的研究得到迅速发展。 1898 年，俄国的植物学家 S.GNawaschin 首次发现了双受精现象，这一发现从而奠定了 胚胎学研究的基础（胡适宜，1983） 。从双受精发现后的 100 多年中，被子植物胚胎学 的研究主要是通过石蜡切片，应用光学显微镜观察大、小孢子发生，雌、雄性配子体发 育，雌、雄配子融合及胚胎发育的全过程（胡适宜，1998） 。19 世纪末，随着人们对植 物性别认识的不断深入，逐渐形成了以描述植物生殖过

15、程为主的植物胚胎学。它以植物 的整个有性生殖过程为研究对象，即对花的形成，雌、雄配子体的发生和发育，传粉和 受精作用，胚和胚乳的发育，种子的形成以及无融合生殖等多个过程进行形态描述，是 植物学科的一个重要分支学科， 也是研究植物有性生殖与胚胎发育过程中形态发生规律 的一门基础学科（胡适宜等，1994） 。 而进入二十世纪以后，运用光学显微镜在有性生殖领域开始开展了大量的相关研 究。人们对雄、雌配子体的发育、精子的形态结构以及和胚乳的发育等各个方面都进行 了比较深入和广泛的研究。另一方面，在前人丰富的描述性资料的基础上，开辟了比较 研究的内容，将胚胎发生中的形态特征应用到系统植物学的工作中去，以

16、此阐明植物系 统发育的地位。到 20 世纪 20 年代，Scharf被子植物胚胎学一书的出版，标志着植 物胚胎学开始由植物形态派生出来，成为一门独立的学科。而到 20 世纪 30 年代，则逐 步开展了植物胚胎学的实验性研究。实验胚胎学是人为的对植物的生殖过程进行干预， 这就使得植物育种工作者能够更好地利用胚胎学的知识和技术， 以加速植物的繁殖以及 改进育种措施（胡适宜，1982） 。 二十世纪后期，在农业生产实践迫切要求和生物科学迅速发展的推动下，各种新技 术开始广泛的应用，在生物学各分支学科之间的相互渗透下，植物胚胎学的发展也大大 加快了。从 20 世纪 60 年代起，植物胚胎学研究的性质开

17、始发生了明显的变化。由于透 山东农业大学硕士学位论文 7 视和扫描电子显微镜、显微荧光技术、细胞化学和分子生物学等各种新技术的应用和研 究手段的改进，以及生物学分支学科之间的相互渗透，使植物胚胎学超越了传统的形态 学范畴， 与植物细胞学、 植物生理学、 植物遗传学和植物生态学发生了更为密切的联系， 并逐渐与细胞生物学和分子生物学等学科结合，演进为一门交叉性、综合性的学科。因 此，现代植物胚胎学也称之为植物生殖生物学(Russell, 1984；许智宏，1999；Hu Shiyi,2002 )。植物胚胎学进入生殖生物学阶段以后，具有多学科综合研究的性质(王伏 雄，1981；杨小华等，1991)。

18、它的研究成果推动着植物生物学的发展，它在新理论上 的成就和实验技术上越来越显示出它对系统学以及农业和林业生产的重要意义。 1.1.2 植物胚胎发育的研究进展 随着科学研究手段的日益更新， 在传统的以显微解剖和观察为主要研究手段的比较 胚胎学研究中, 人们对不同植物胚胎发育过程中的形态学变化有了比较详细的描述。 在 20世纪时，发育胚胎学和比较胚胎学已经得到了充分的发展，它们在分类学中的地位也 越来越受到人们的重视(Johri B M,2001)。在此为基础上，利用分子生物学手段研究胚 胎发育，已重新成为生物学中最为活跃的研究领域之一。 胡适宜等(2002)将中国植物胚胎学的发展划分为三个时期植

19、物胚胎学在中国的发展 大体可以划分为3个时期：1）初始时期，主要是对裸子植物胚胎发育的观察和实验研究 方面开展了一些工作；2）20世纪50年代后的十几年进入学科的建立时期，在此期间培 养了一大批植物胚胎学的相关人才，开展了许多胚胎发育的描述性研究；3）近三、四 十年，随着国际上这一学科的发展，进入植物生殖生物学的发展时期。而胚胎学研究的 方向大致分为三方面。传统的胚胎学方向，由早期的石蜡切片、光镜观察发展到以后的 以超微结构研究为主，特别是在20世纪80年代以来，现代生殖生物学在研究生殖发育中 的结构方面，细胞生物学、分子生物学等多学科的渗透逐渐上升到重要地位，已经发展 到主要应用电镜技术、超

20、微组化技术、三维重构技术、定量细胞学、图象处理技术、放 射自显影以及免疫学技术等作为研究手段，同时也引入其它各种细胞生物学方法，如免 疫荧光定位及细胞化学技术， 对被子植物生殖生物学的机理进行了多学科的综合性研究 (陈劲春，1996)。已积累的超微结构的研究成果，尤其是雄性生殖单位的概念的建立、 精子异型性的确认， 使对生殖系统的结构及在发育过程中的形态变化规律的认识提高到 一个新的水平(Knox et al.,1993)。在生理学方向，早期主要研究成花的诱导，传粉、受 精前后花器生理变化，此后着重从基因的角度研究成花的控制基因、参与花粉与柱头相 核桃（Juglans regia）胚发育及其营

21、养代谢动态研究 8 互识别的S位点编码产物、花药绒毡层组织特异启动子的克隆及应用、花粉粒内基因表 达、卵细胞离体显微操作和合子形成前后的基因表达及其产物生理、生化作用等(陈劲 春，1996)。实验胚胎学方向，应用离体培养在人工控制的条件下研究雌雄配子、受精 和受精后的发育，已经建立了玉米离体受精模式系统，更多的离体操作模式系统的建立 仍将是未来发展的动力(杨弘远，1998)。总之，胚胎发育涉及由营养细胞向生殖细胞的 转变、性细胞发育、传粉与受精、胚胎发生以及胚、胚乳发育等。从广义上讲，可以包 括各种形式的营养体无性繁殖和孢子生殖过程，花粉、胚胎发生、无融合生殖等也是该 领域研究的内容。 庄东红

22、等(2000)通过观察柿树(Dysosma versipellis)减数分裂和小孢子形成过程，发 现小孢子发生过程中出现未减数分裂的核形成大型花粉， 柿树多倍体的形成可能由未减 数分裂配子受精产生。而小孢子形成过程中，绒毡层细胞的发育及功能始终是研究的重 点； 陈祖铿(1990)对绒毡层的结构、 功能和系统演化等进行了阐述； Zheng M Y et al. (2002) 研究了普通小麦(Triticum aestivum L.)中处于各发育阶段的子房对于小孢子胚胎发育的 影响，经过实验证明：在预处理过程中，各个发育阶段的子房通过为胚胎发育过程提供 基本的营养物质，对于胚状体的生长具有明显的作

23、用；Barinova et al.(2002)通过对 Antirrhinum majus小孢子成熟过程和体外转化的研究， 得出对这种植物花粉的体外成熟、 短暂转化和萌芽过程的研究，有利于为基础和应用研究提供一种很有价值的工具；Dias J S et al. (2002)研究了不同温度对四个甘蓝种的小孢子在体外胚胎发生过程中的影响； PAN Yue Zhi et al. (2003)曾对香木莲(Manglietia aromatica)的大、小孢子发生以及雌、雄 配子体发育过程进行了相关研究；孟颖等(2009)对核桃楸小孢子的发生及其雄配子体的 发育也进行了相关的研究。 郭凤根(1993)对女贞

24、属女贞（Ligustrum lucidum.)的大孢子的发生及雌配子体的形 成、传粉和受精、胚乳和胚胎的发育及果皮和种皮的发育等几个方面的内容进行了详细 的论述，同时对木犀科属间亲缘关系及女贞属系统地位进行了探讨；王秀华等（1995） 对水曲柳(Fraxinus mandshurica)的大孢子发生及雌配子发育进行了研究； 唐源江等(2003) 研究了观光木(Tsoongiodendron odorum)的大孢子发生与雌配子体形成，同时试图从大孢 子和雌配子发育的特点来揭示导致濒危的深层机理；滕年军等（2008）利用常规石蜡制 片、组织压片以及显微观察技术对菊花脑(Dendranthema n

25、ankingense)大孢子发生、雌配 子体及胚胎发育过程进行了相关研究。 发现菊花脑功能大孢子位于珠孔端和胚囊发育属 于单孢子待宵草型是区别于大多数被子植物的重要生殖特征。在模式植物上，Cory 山东农业大学硕士学位论文 9 A.Christensen et al. (1997) 用激光共聚焦扫描技术在显微水平上研究了拟南芥大配子体 的发生。这些成果和研究方法对拟南芥胚胎发育突变体的研究提供了基础。随着拟南芥 发育模式的建立，对拟南芥雌、雄配子体的结构和发育的研究资料开始大量涌现，而且 还把雌配子发生过程分成了8个阶段，并将其与胚珠发育阶段（Schneitz K et al.,1995） 、

26、 早期花发育阶段（Symth D R et al.,1990）对应起来，使得拟南芥的生殖发育研究更为深 入、更为系统。 李勇等(1994)曾对沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)胚发育过程中的成熟胚囊的 超微结构进行观察； 刑树平等(1998)曾对 Ostrya virginiana 的胚珠和胚囊发育进行研究， 并比较了桦木科各属胚胎学资料及对其它高等金缕梅类各科的胚胎学性状进行比较， 指 出在比较胚胎学研究中，最为重要、也是最多的性状来自胚珠和胚囊发育，桦木科各属 的胚胎学性状是非常相似的，科内表现出高度的一致性，如胚珠倒生并具单层珠被。 按照Soueges的观点可以

27、将胚胎发生分为原胚发育和胚发育两个阶段，胚的发育从 合子分裂开始，经过原胚、胚的分化阶段，最后达到成熟。双子叶植物胚的发育大致经 历原胚（Proembryo） 、球形胚（globular embryo） 、心形胚（heart-shape embryo） 、鱼雷胚 （torpedo-stage embryo）和子叶胚（bent-cotyledon）等几个阶段。黄坚钦等(1995) 研究 了濒危植物中国鹅掌楸(L.chinensis) 的双受精过程、胚胎发生的过程等，并试图从胚胎 学角度探讨濒危原因；曾华金等(2003)分别对西番莲(Passiflora eudlis)的受精作用、胚胎 发生、胚乳

28、发育和种子形成进行研究；吴彦琼等(2004)研究了蒜头果(Malania oleifera) 的生殖生物学特性。此外，Label et al.（1994）发现欧洲黑杨(Populus nigra L)在受精前 后子房内部的脱落酸含量不变。20世纪90年代，Kranz et al. (1990,1993)在玉米体外受精 方面首先取得突破，并进一步使人工合子发育成可育植株。传统植物胚胎学的研究都对 胚胎发育过程进行了大量细胞形态描述， 光学显微镜和电子显微镜的应用为目前胚胎发 育的分子生物学的研究奠定了坚实的基础。 现阶段高等植物有性生殖的研究，越来越明显地沿着探索生殖发育机理的方向进 行，把分子

29、生物学理论和技术引入植物生殖生物学的研究是现阶段主要的发展趋向(王 关林等，2002)，植物胚胎发生的分子机制是植物科学研究的热点之一，其发生的机理 与调控研究是目前植物细胞工程的前沿和优先发展领域。 对于研究植物细胞全能性的机 制、基因的表达和胚胎的发育具有重要意义(Vogel G, 2005；Yang X et al.,2010； Stangeland B et al.,2011)，这也为育种提供基础理论和新途径的研究也受到很大的重视。 核桃（Juglans regia）胚发育及其营养代谢动态研究 10 1.2 果实发育过程中主要营养代谢动态研究 果实的生长发育过程大致可分为细胞分裂和细胞

30、膨大两个阶段， 幼果前期主要以细 胞分裂为主，之后开始细胞体积增大的过程，果实前期的细胞分裂是构成果形指数的细 胞学基础， 植物(包括果实)的生长发育过程都是代谢与调节作用之间相互作用中的综合 表现（Goffinet M C et al., 1995）。人们对果实发育过程中碳水化合物进入果实的途径、 果实碳水化合物积累过程中的有关酶活性变化动态、 相关酶和可溶性糖在细胞内的分布 等已较为清晰，但对果实碳水化合物积累的起始信号、果实生长发育过程中代谢的控制 步骤还有待阐明。 必须从营养代谢的各个方面着手进行， 主要涉及到脂肪代谢、 碳代谢、 氮代谢等，只有深入了解果实的营养代谢机理及各营养物质积

31、累的特点，才有助于人们 通过栽培等手段来提高果实品质或者利用育种等途径来有效地改良品种。 1.2.1 脂肪代谢动态的研究 植物脂肪作为重要的农产品，不仅是人类膳食脂肪的主要来源，而且由于它的再生 性，成为化石能源的战略替代品。从 1997 年到 2007 年，世界植物脂肪的产量增加 61% （FAOSTAT, 2008） 。目前植物脂肪主要来源于棕榈（Elaeis guineensis） 、油菜(Brassica napus)、向日葵(Helianthus annuus)等少数几类植物。2007 年，这几类植物提供了全球 83%的植物脂肪（FAOSTAT,2008） 。植物脂肪主要由种子产生，

32、植物脂肪代谢是相当复 杂的过程，这一过程涉及到一系列生化反应及催化反应的酶，还涉及植物种子胚胎的发 育。尽管如此，随着近年来，随着基因组学和蛋白质组学的发展，利用基因组学技术 （Sergei M et al.,2000；White JA et al.,2008）和蛋白质组学技术（Xiao Gang et al.,2008； Sheng Bao Xu et al.,2008），对于植物脂肪代谢途径的基因调控和表达模式进行了研究。 克隆了植物脂肪代谢的关键基因如乙酰辅酶 A 羧化酶 （acetyl-CoA carboxylase， ACCase） 等。利用 cDNA 文库技术和同源序列扩增技术，在

33、油茶（谭晓风等，2006）和杨树（周 洲等，2007）等木本植物上也克隆了脂肪代谢相关基因。 在拟南芥中，种子脂肪的积累呈S型曲线，在受精后的7-17d增加速度最快，在第18d 达到最大值，但在成熟期的最后几天，脂肪含量又呈下降趋势（Baud S et al.,2009） ；安 建平等（2006）报道在亚麻籽粒发育过程中棕榈酸和硬脂酸的含量在其发育的初期阶段 较高， 积累的速度也快， 随着亚麻的继续发育， 籽粒中棕榈酸和硬脂酸的含量逐渐下降， 亚麻籽粒成熟以后这两种脂肪酸的含量降为最低； 随着亚麻籽粒的发育油酸和亚油酸的 含量逐渐上升，成熟期含量明显高于发育初期；李晓丹等（2009）通过对花生

34、种子发育 山东农业大学硕士学位论文 11 过程中脂肪酸累积模式的研究发现： 两种花生种子发育过程中棕榈酸和硬脂酸的含量逐 渐呈现下降趋势，油酸和亚油酸含量逐渐升高。李晓丹等（2008）还分析了芝麻种子发 育过程中不同脂肪酸的积累过程及相关关系，发现随着芝麻种子的发育，种子中含有的 棕榈酸和硬脂酸含量逐渐降低，油酸和亚油酸含量总体呈现上升趋势，其中在发育的某 些阶段油酸和亚油酸含量呈现一定的负相关性；王培蒂等（1995）研究发现马尾松种子 发育过程中随着脂肪的逐渐积累淀粉和可溶性糖的含量逐渐降低， 认为淀粉和可溶性糖 含量对脂肪的转化和积累都具有重要意义；王萍等（2001）研究发现籽用南瓜种子发

35、育 的早期阶段主要是进行可溶性糖和淀粉的积累，随着果实逐渐成熟，可溶性糖和淀粉含 量逐渐降低，转化为脂肪贮存在南瓜种子中；王秋霞等（2010）通过定期测定文冠果的 脂肪、蛋白质、淀粉含量研究了文冠果脂肪积累规律。脂肪百分含量在6月20日最低， 6 月20日至7月1日是果实体积增长最快时期，脂肪百分含量增长也最快。而到7月14日以 后，脂肪含量百分数增长较慢并趋于平稳。 1.2.2 蛋白质代谢动态的研究 蛋白质是组成细胞的最主要成分，是细胞结构的基础，细胞各部分都含有蛋白质， 细胞的一切功能活动都是在蛋白质的参与下完成的， 所以它是生命活动中必不可少的物 质。植物发育即植物的个体发育, 指植物生

36、命所经历的全过程。从受精卵的最初分裂开 始, 经历营养体形成、生殖体形成、开花、结实等阶段, 直至衰老和死亡。植物发育是 植物生长和分化的总和,是植物生长分化的动态过程。植物的形态建成是基因组按一定 的时空顺序选择性表达的结果。有关调控基因活动的研究,最早是从蛋白质水平上进行 的，不同的发育分化阶段中合成类型和数量不同的蛋白质。因此，人们曾把蛋白质作为 研究发育和分化的指标。 氮代谢是决定植物生长的基本要素之一， 它以氨基酸为主要底物在细胞中合成蛋白 质，再经过对蛋白质的修饰、分类、转运及储存等，这关系到植物对环境胁迫的适应能 力。氮合成要依靠无结构的碳水化合物来提供和转运氮源，其中硝酸还原酶

37、(NR) 谷氨 酸脱氢酶(GDH) 、 磷酸蔗糖合成酶(SPS)和烯醇丙酮酸磷酸羧化酶(PEPCase)等在氮耦合 代谢调节过程中扮演着重要的角色。根据基因的遗传信息在mRNA、tRNA 和rRNA以及 氨基酸活化酶等生物功能物质参与下，在核糖核蛋白体上合成肽链，再经过折叠等生化 过程最后形成具各种生物功能活性的蛋白质（Vitale A et al.,1993） 。 傅秀红等曾在2000以银杏良种桂G86-1为试材，对种实发育过程中种仁和种皮的11 核桃（Juglans regia）胚发育及其营养代谢动态研究 12 种营养成分的含量和积累的变化动态进行系统研究得出，在种实生长发育前期，粗蛋白

38、质、粗脂肪等养分在种皮和种仁的含量还较高， 但随着生长发育期的变化而降低，所 以后期适施N、P、K 肥，不仅可以增加蛋白质、粗脂肪的含量，而且还可提高还原糖 和蔗糖的含量，改善种仁的风味和品质；赵晋忠等（2004）的研究则认为：不论早熟品 种还是晚熟品种，在开花后15d籽粒中的蛋白质含量就达到较高的水平（30%以上） 。蛋 白质积累的变化规律是呈波动趋势，蛋白质的绝对含量以及籽粒重积累趋势基本一致， 总体上都呈缓慢的上升趋势，蛋白质的相对含量总体上呈相反的趋势，蛋白质相对含量 与籽粒重也呈相反的趋势；孙聪姝等（2006）的研究认为：各时期籽粒蛋白质含量均与 成熟期籽粒蛋白质呈现极显著正相关，

39、籽粒形成后期的蛋白质积累是决定成熟籽粒蛋白 质含量高低的关键时期。 1.2.3.糖代谢动态的研究 大多数植物的光合产物是蔗糖和淀粉，其中蔗糖是光合产物运输的主要形式，也是 “库”代谢的主要基质(Farrar et al.,2000)。其次，果实中的糖含量的变化也受代谢相关 酶的调控，它们的动态变化及其相互关系是研究库源关系的重要内容之一。果实糖分积 累与果实发育密切相关（吕英民等，2000） ，果实品质在很大程度上取决于果实内所含 糖的种类和数量，糖不仅是影响果实甜度的物质，而且还是酸、类胡萝卜素和其它营养 成分及芳香物质等合成的基础原料。近年来的研究表明，糖还作为信号分子，与激素、 N 等信

40、号联成网络， 通过复杂的信号转导机制调节植物生长发育与基因表达 （黎京度等， 1988） 。深入了解糖分的积累和代谢机制，抓住关键环节，是提高果实品质的根本方法。 近年来，人们对于果实中糖分积累和代谢的研究也逐步深入。 1.2.3 .1 与糖代谢相关酶活性的研究 果实内糖分积累的种类和含量决定了果实的品质， 而糖卸载到果实中在很大程度上 取决于果实的库强，而果实获得同化物的能力很大程度上也是由库强所决定，库强大小 的一个重要生理标志就是糖代谢相关酶活性。 而果实中与糖代谢相关的酶主要有转化酶 (Invertase, Ivr) 、蔗糖磷酸合酶(Sucrose phosphate synthase

41、, SPS)和蔗糖合酶(Sucrose synthase ,SS)。转化酶可以催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖。根据其PH酸碱度的 不同又分为酸性转化酶(Acid invertase, AI) 和中性转化酶(Neutral invertase, NI)。 SPS为催 化合成蔗糖的酶，它催化UDPG和6-磷酸果糖合成蔗糖磷酸，然后在磷酸酯酶作用下生 成蔗糖。SS为葡萄糖转移酶，它在UDP存在的条件下，催化将蔗糖转化成UDPG和果糖 山东农业大学硕士学位论文 13 的可逆反应。它在蔗糖代谢中起合成还是分解蔗糖的作用与其是否被磷酸化有关。 果实中糖的积累主要与以上三种酶的活性变化有关。在甜瓜果实的

42、发育过程中，酸 性转化酶活性和中性转化酶活性随着果实的生长发育不断变化（张明方等，1998） 。在 果实发育前期，蔗糖开始积累，活性开始降低，AI在甜瓜果实发育的早期提高，高活性 Al主要为快速生长的组织提供己糖作为碳源， 随着果实成熟和蔗糖的积累， Al活性降低。 李兴军等（2000）曾报道杨梅花芽孕育期间，蔗糖水平变化过程与转化酶呈相反趋势； Hubbard等（1991）研究发现报道草莓中酸性转化酶活性在幼果期高，随着果实发育而 持续降低，中性转化酶在果实发育的中期阶段最高，而后下降， 但成熟时活性高于酸 性转化酶；KLann et al. (1996) 研究发现：在韧皮部卸载位点和贮存细

43、胞之间存在了一 个蔗糖梯度；Bachelier et al.（1997）得出处在细胞壁中的转化酶能调节蔗糖从韧皮部卸 出，并且控制蔗糖的吸收速度，而在液泡中的转化酶可以调节蔗糖和己糖的贮存。可见 转化酶是蔗糖在这些果实内代谢的一个关键酶。 在高等植物器官营养物质的运输过程中， 库强的强弱是由库细胞蔗糖代谢和贮藏能 力决定的，而库强大小的一个重要生化指标是蔗糖代谢相关酶的活性（Farrar et al.,1993） 。Brandon et al. (2001) 认为 SS 影响库强的作用机理可能是在果实汁胞外的 SS 催化蔗糖分解为 UDPG 和果糖， UDPG 和果糖经过三羧酸循环后生成 AT

44、P， ATP 供能启 动汁胞膜上的 H+泵，H+泵将胞外的扩泵入到汁胞内。而在迅速生长的库器官中，SS 主 要起分解作用，但在不同的作物中其催化方向有所不同，桃果实在发育早期蔗糖含量很 低，但成熟时蔗糖的含量达到其总糖的 80%，所以 SS 在前期起分解蔗糖的作用，而后 期起合成蔗糖的作用。生育前期 SS 分解活性大于合成活性，这有利于器官的形态建成， 而在生育后期 SS 合成活性大于分解活性，则有利于根中蔗糖的形成。龚荣高等(2004) 通过研究得出在脐橙果实发育中后期，SS 合成方向是影响糖积累的主要酶。由于转化 酶在甜橙等果树的果实发育早期就基本消失， 而 SS 分解方向的活性高， 可能

45、 SS 分解方 向起主要作用，催化蔗糖分解为 UDPG 和果糖，从而成为果实形态建构的物质基础，也 为呼吸作用提供重要能量来源。蔗糖磷酸合成酶(SPS)在蔗糖合成积累中起着重要的作 用，蔗糖是高等植物光合作用的主要产物，是碳运输的主要形式，也是“库”代谢的主 要基质(Farrar et al., 2000)， 而SPS在蔗糖代谢中的作用主要表现在SPS影响源强和库强， 调节光合产物在蔗糖和淀粉的分配，参与细胞分化与纤维细胞壁合成。Huber (1996)对 大豆研究均表明：蔗糖磷酸合成酶（SPS）是影响大豆叶片中蔗糖合成的关键酶；李永 庚等(2001)也研究发现磷酸蔗糖合成酶在小麦旗叶光合产物

46、向蔗糖的转化过程中也起关 核桃（Juglans regia）胚发育及其营养代谢动态研究 14 键性的调节作用；Kwans et al.（1998）研究也认为 SPS 是促进夏橙果实蔗糖积累的关键 酶；赵智中研究了蔗糖代谢相关酶在温州蜜柑果实糖积累中的作用，提出糖积累是果实 品质形成的关键， 而蔗糖代谢又是糖积累的重要环节，故许多学者试图从蔗糖代谢相 关酶的活性变化来探讨果实糖积累的机理。 1.2.3.2 糖代谢相关酶之间的协同作用 蔗糖代谢相关酶的综合作用是影响果实糖积累的重要因子。 果实发育中的蔗糖积累 代谢不仅仅是单个酶在起作用，而是几种酶共同作用的结果。草莓果实中蔗糖浓度升高 时，SPS

47、、NI 和 SS 的活性都上升(Hubbard et al.,1991)；而在桃果实蔗糖积累过程中， SPS 活性保持稳定，转化酶活性呈下降趋势，其它果实中也类似，几种蔗糖代谢关键酶 可能同时对果实糖积累产生影响， 因此在研究糖积累机理时应考虑几种蔗糖代谢关键酶 的综合作用。 糖代谢相关酶的净活性是反映各种蔗糖代谢相关酶综合作用的指标。 蔗糖分解酶类 的活性=AI+NI+SS(分解方向)， 蔗糖合成酶类的活性= SPS+SS (合成方向)； 酶的净活性= SPS + SS (合成方向)AI-NI-SS(分解方向)。赵智中等(2001)的研究表明：酶的净活性是 影响温州蜜柑果实蔗糖积累的重要因子

48、， 温州蜜柑幼果期果实中的蔗糖代谢相关酶的净 活性为很高的负值，这时果实中蔗糖的含量几乎接近于零，进入着色期后酶的净活性变 为正值， 蔗糖积累速度加快， 说明此时蔗糖在进入果实后被分解和消耗的比例相对较少。 不同品种的苹果果实发育过程中， 蔗糖代谢相关酶的净活性都经历了一个由负值向正值 增加的过程（宋烨等，2006） 。 1.3 植物组织化学的研究 组织化学（Histochemistry）技术是通过化学或物理反应原理显示组织切片或细胞内 某种化学成分，进行定位、定量及其与功能相关的研究。 它是逐步建立在形态学基础 之上的组织化学属边缘科学的范畴，是研究细胞和组织中的化学组成、定位与定量以及 代

49、谢状态的科学，其根本的目的是联系形态、化学成分和功能来了解细胞或组织的代谢 变化。 19世纪初，法国植物学家拉斯帕伊在研究禾本科植物的受精作用时，首次发现了淀 粉的碘反应。此后他还建立了蛋白质的黄色反应，硫酸对于糖醛及蛋白质醛基反应等鉴 定方法，这被认为是组织化学研究的开始。自1830年比利时植物学家Raspail发表在生 理学中使用显微镜观察化学物质一文开始，组织化学就以快捷、灵敏、操作简便等诸 山东农业大学硕士学位论文 15 多优点引起了研究者们的广泛关注并逐渐被运用于医药学、生物学等众多领域。随着科 学技术的不断发展，组织化学在近几十年来已经得到了迅速的发展，产生了许多分支， 如核酸与蛋白质、蛋白质与氨基酸、脂类与蛋白质、碳水化合物与粘蛋白及粘多糖、无 机物组织化学、酶组织化学、电镜组织化学、荧光组织化学、免疫组织化学、同工酶组 织化学、定量组织化学、原位杂交组织化学和放射自显影技术等。因此，现代组织化学 的概念已经大大的超过了以往的范畴，无论从理论、内容、研究手段、研究范围都比以 往更广泛及更深入。 Mieczyslaw KD et al. （1999） 利用组织化学定位酚类化合物来研究油菜种子在吸水 和萌发时的超微结构变化，明确